第一章 光谱技术 作 者: 王 英 联系电话: 13907593478

第一节 概 述 许多物质有颜色,大量无色的物质可以与显色剂作用生成有色的物质，这些有色的化合物颜色的深浅与其浓度成正相关，则浓度越大，颜色越深。故通过测定颜色的深浅可对物质进行定量分析，称为比色分析法。 一、比色分析的概况： 最早的纳氏比色法是按浓度从低到高，配好系列标准管，然后将待测样品与标准管进行比较定量，如黄疸指数的测定，它属于目力比色法。这种方法很简单，但误差很大。

后来造出光电比色计，其原理是一束平行单色光通过一定厚度的有色溶液时，一部分光被吸收，未被吸收的光透过溶液照到光电池上，光电池将光能转换成电能，推动检流计偏转，再和标准管比较可计算出待测溶液的浓度。 但光电比色计只适合在有限波长内测量，不能满足不同分析工作的需要。

为了克服以上不足制造了性能更好的分光光度计，分光光度计将分析区域扩展到红外和紫外波段。这样许多用普通比色法无法进行分析的无色物质，只要在红外或紫外区域内有适当的吸收峰，便可以用相应的分光光度计加以测定。从而大大扩展了物质的测定范围，尤其是在有机化合物检测方面的应用。 分光光度计分吸收光谱仪和发射光谱仪两类。 发射光谱仪主要有光栅光谱仪、荧光分光光度计和火焰光度计，可见及紫外分光光度计、红外分光光度计等为吸收光谱仪。

二、光谱分析技术 根据物质具有吸收、发射或散射光谱谱系的特征，来测定其性质、结构或含量的一类分析技术称为光谱分析技术。 光谱分析技术包括吸收光谱分析、发射光谱分析和散射光谱分析三大类。 它具有灵敏、快速、准确、简便等优点，是一种最常用的生化分析技术。 常用的有：可见及紫外分光光度法、红外分光光度法、荧光法，原子吸收光谱法、火焰光度法及比浊法等。

第二节 光谱分析的基本原理 一、光的基本性质 光是电，电是光，光电可相互转换。 第二节 光谱分析的基本原理 一、光的基本性质 光是一种电磁波，是能的一种表现形式，是一种以巨大速度通过空间传播的光量子流，在不同的介质可发生反射、折射、衍射、色散和偏振等现象。 光是电，电是光，光电可相互转换。

光具有波动性，以波动的形式进行传播，并可用波长、频率、传播速度等参数来描述。 两个波峰之间的距离为波长（），单位时间内通过某一点波的数目为频率（）, c为光速。 波长与频率之间的关系是： 不同波长的光具有不同的能量，光的能量与光的波长成反比，波长越长（频率越低），能量越小；波长越短（频率越高），则能量越大。紫外光的波长小于可见光和红外光的波长，因此，紫外光的能量大于可见光和红外光的能量。

二、光谱 光谱是复合光经色散后的单色光按一定顺序排成一幅光的色谱。 光谱又可分为发射光谱、吸收光谱和散射光谱。 1. 发射光谱 发光体通过三棱镜或光栅的色散后得到的光谱，为发射光谱，不同的发光体（光源）有其独特的发射光谱。

2. 吸收光谱 物质的原子或分子对光选择性地吸收而得到的光谱，为吸收光谱。 （1） 对固体物质来说，当白光照射到物质上时，物质对于不同波长的光吸收、透过、反射、折射的程度不同而使物质呈现不同的颜色。 对各种波长的光完全吸收则呈现黑色；完全反射则呈现白色；吸收程度差不多则呈现灰色。 如果只吸收了部分波长的光，这种物质则呈现出反射光的颜色。

（2） 对溶液来说，溶液呈现不同的颜色，是由于溶液中的分子或离子选择性地吸收某种颜色的光所引起的。 如果各种光透过程度相同，这种溶液是无色透明的。 若只让一部分波长的光透过，其它波长的光被吸收，这溶液则呈现出透过光的颜色，是它吸收光的互补颜色。

任何一种溶液，对不同波长的光的吸收程度是不相等的。如果将各种波长的单色光依次通过一定浓度的某一溶液，测量该溶液对各种单色光的吸收程度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标，可以得到一条曲线，即吸收光谱曲线。 表1-1列出了物质颜色与吸收光颜色之间的关系。 如将表1-1中相对应的光按一定的比例混合，可以成为白光，因此，这两种光称为互补色光。

表1-1 物质的颜色和吸收光颜色的关系 吸收光 颜色 波长（nm） 400~450 黄、绿 紫 黄 蓝 450~480 橙 青、蓝 表1-1 物质的颜色和吸收光颜色的关系 吸收光 物质的颜色 颜色 波长（nm） 400~450 黄、绿 紫 黄 蓝 450~480 橙 青、蓝 480~490 红 青 490~500 500~560 紫、红 绿 560~580 紫 黄、绿 580~600 蓝 黄 青、蓝 橙 600~650 青 红 650~750

第三节 吸收光谱分析法 一、吸收光谱分析法的基本定律 第三节 吸收光谱分析法 一、吸收光谱分析法的基本定律 朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律是讨论吸收光能与溶液浓度和液层厚度之间关系的基本定律，它是分光分析的理论基础。 朗伯-比尔定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。

透光度：透过光强度（I）与入射光强度（I0）之比 用T表示 T = I / I0 T×100称为百分透光度（T% ）。 吸光度：透光度的负对数 用A表示 A = 1gT= 1g I0/I A = kbc 式中k为吸光系数（常数），c为浓度，b为液层厚度，该式是分光分析的定量公式。 I0 I

二、偏离朗伯-比尔定律的因素 朗伯-比尔定律:被测物质的浓度与吸光度成正比，以两者关系作图得到一条通过原点的直线。但在实际测定中，往往有偏离定律的现象。导致偏离定律的主要原因有光学和化学两方面的因素。

1、光学因素 朗伯-比尔定律成立的重要前提是单色光，但在实际测定中使用的入射光并不是100 %纯的单色光，会有其它波长的光混杂入，不纯的单色光是引起偏离的主要因素。 比色分析要注意校准波长，特别是在气候变化时。

2、化学因素 被测物的浓度、pH、溶剂和温度等均可影响比色分析的线性，被测物的离解、缔合或形成新的物质等原因也可导致溶液各组分间比例发生变化，若各组分的吸光系数差别较大，则吸光度与浓度间的关系也会偏离直线。 在应用朗伯-比尔定律的实际工作中，溶液应该是一个均匀体系，否则吸光度与溶液的浓度不成直线关系。 各份待测溶液颜色的深浅要相近。

3、透光度与吸光度转换的误差 为了减少误差，掌握好仪器的透光度或吸光度的读数范围至关重要，因而透光度与吸光度的准确度是衡量仪器精度的指标之一。 三、吸收光谱分析的特点 1、可见光分光分析特点： （1）灵敏度高 最低的检测浓度可达10-7g/ml，通常物质浓度在10-5~10-2mol/L范围内较为合适。 （2）操作简便、快速、应用广泛、重服性好 。 （3）可见光的比色池以光学玻璃作入射和出射光学面。

2、紫外分光分析特点： 紫外分光分析法除具备灵敏度高、操作简便及应用广泛等特点外，更重要的是无需显色，无论是有色或无色溶液，只要在紫外光区有特异性吸收峰即可进行定性或定量分析，故不破坏标本。 紫外分光分析法的比色池要求用不吸收紫外线的石英玻璃作入射和出射的光学面 。 紫外分光分析法除可采用标准品比较检测外，还可采用被测物质的克分子吸光系数计算其含量，而无需标准管。

四、可见紫外分光分析 光 源 白炽灯、 氢弧灯或氘灯 单色器 吸收池 比色杯（玻璃杯或石英杯） 检测器 硒光电池、光电管、光电倍增管 指示器 （一）分光光度计的组成 光 源 白炽灯、 氢弧灯或氘灯 (360~1000nm ) (150~400nm ) 单色器 三梭镜、光栅、滤光片 吸收池 比色杯（玻璃杯或石英杯） 检测器 硒光电池、光电管、光电倍增管 指示器 检流计、微安表、数字显示器

1. 数字显示器 2. 吸光度调零旋钮 3. 选择开关 4. 吸光度调斜率电位器 5. 组成量度旋钮 6. 光源室 7. 电源开关 8 1.数字显示器 2.吸光度调零旋钮 3.选择开关 4.吸光度调斜率电位器 5.组成量度旋钮 6.光源室 7.电源开关 8.波长手轮 9.波长刻度窗 10.试样拉手架 11.100%T旋钮 12.0%T旋钮 13.灵敏度调节旋钮 14.干燥器

A样 A标 C 样 = C标 （二）分光分析定量方法 1、标准曲线法 : 2、 直接对比测定法 : X 3 、吸光系数 : A=abC

标准曲线 吸光度 标准品浓度