遗传信息的复制与传递 第 三 篇 Jianjun Xie, M.D. , Ph.D Department of Biochemistry and Molecular Biology, Medical College of Shantou University, Shantou, China

前 言 DNA是生物遗传的主要物质基础，生物体内的遗传信息以密码的形式储存在DNA上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA，然后翻译成相应的蛋白质，以执行各种生命高能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状，这就是基因的表达。 DNA、RNA和蛋白质的生物合成均需要一定的模板，适当的原料，遵循一定的规则，在特定的酶的催化下完成。

中心法则 (the central dogma) 转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录 转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录 转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录 转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录 转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录 转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录 作者 2006-10-18 由DNA双螺旋结构的发现者之一点F.Crick于1958年最早提出。1970年，H.Temin及Baltimore分别发现了逆转录现象，对中心法则作了补充。

DNA Biosynthesis and Recombination Chapter 16 DNA Biosynthesis and Recombination DNA的合成与重组 DNA指导的DNA合成 (DNA复制) DNA的修复合成 RNA指导DNA合成

The General Features of Genome Replication 第一节 The General Features of Genome Replication 基因组复制的主要特点

基因与基因组 基因(gene)： 为蛋白质或RNA编码的DNA功能片段，是以碱基排列顺序的方式储存的遗传信息。 基因组（genome)： 含有一种生物的一整套遗传信息的遗传物质，称为基因组。在真核生物体中，基因组是指一套完整单倍体DNA（染色体DNA）和线粒体DNA的全部序列，既包括编码序列，也包括非编码序列。

DNA复制的基本特征 复制 亲代DNA 子代DNA 复制(replication)：

（一） 有固定的复制起始位点 DNA复制总是在DNA分子上的一个或者多个位点开始的，这种控制起始的位点称为复制起始点（origin of replication, ori）。为DNA复制所必需的特殊的DNA序列。 ori 的一般特征 ： 1.由多个独特的短重复序列组成。 2.短重复序列被多亚基的复制起始因子所识别并结合。 3.一般富含AT，利于双螺旋DNA解旋。

E.coli 复制起始点 oriC 同向重复序列 反向重复序列 5 3 1 13 17 29 32 44 GATTNTTTATTT ··· GATCTNTTNTATT ··· GATCTCTTATTAG ··· 1 13 17 29 32 44 同向重复序列 反向重复序列 5 3 ···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA 58 66 166 174 201 209 237 245

ori （二） 复制叉和复制子 双螺旋DNA复制时，复制区生长点的结构呈Y形或叉形，称之为复制叉（ replication fork）。 复制泡

复制中的放射自显影图象 在原核生物双向复制中，DNA被描述为眼睛状。为说明方便而做的图为形。 ori

复制子（replicon） 从一个DNA复制起点起始的DNA复制区域，它是一个独立复制单位，包括复制起点和终点。

（三）半保留复制方式保证遗传信息的忠实传递 半保留复制的概念 Semiconservative replication DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全重新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。是DNA复制最重要的特征。

DNA复制的三种可能方式 全保留式 　半保留式 混合式

1958 – Matthew Meselson和Franklin Stahl 马修.梅塞尔(Matthew Keelson) 福兰克林.斯塔尔(Franklin Stahl)

DNA半保留复制实验证据 梯度离心结果 含N15-DNA的细菌 培养于普通培养液 第一代 继续培养于普通培养液 第二代

普通DNA 全保留 二代 一代 重DNA 混 合 一代 二代 中等密度DNA

半保留复制的意义 按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。

解链方向 3 5 （四）半不连续复制克服了空间结构对DNA新链合成的制约 5´ 领头链 (leading strand) 3´ 5´ 随从链 (lagging strand) 3´ 5´

顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的这股链称为领头链。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。 冈崎片段： • 1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，将这些不连续的片段称为冈崎片段。 • 原核生物: 1000~2000个核苷酸 • 真核生物: 100~200个核苷酸

半不连续复制动画

（五）DNA复制必须有引物 多数DNA复制使用RNA引物 个别DNA复制以DNA或核苷酸为引物 DNA聚合酶不能从游离的核苷酸开始合成DNA链，必须由引物（primer）提供自由的3-OH末端，通过加入核苷酸使之不断延伸。 所有细胞和多数病毒的DNA复制，首先利用模板合成一段RNA引物，这一过程为引发（priming）。 RNA引物5端的第一个核苷酸通常是pppA（个别为pppG）。 个别DNA复制以DNA或核苷酸为引物 174等噬菌体以双链环形DNA的一条链上产生切口处的3-OH为引物； 腺病毒及某些线性DNA病毒以结合于病毒DNA的5端磷酸基团的末端蛋白上的dCTP的3-OH为引物开始复制。

Process of DNA Replication 第二节 Process of DNA Replication DNA复制过程

DNA复制的体系 底物: dNTP (dATP、dGTP 、dCTP 、dTTP) 聚合酶: 依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-pol) 引物: 提供3‘-OH末端的寡核苷酸 其他酶和蛋白质因子: 拓扑异构酶、解螺旋酶、单链DNA结合蛋白、引物酶、连接酶

一、原核生物DNA复制体现了复制的基本过程和特征 （一）在复制起点解旋酶和多种因子形成复合物 DNA分子通常都反复盘曲、折叠形成超螺旋结构，其碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA链通过解旋、解链等步骤，解成单链并在局部形成相对稳定的结构，它才能起模板作用。这一过程需要许多酶以及蛋白质的参与。 1. E.coli复制起始需要6种蛋白质因子 DnaA、DnaB、DnaC、HU、 促旋酶（gyrase，即拓扑异构酶Ⅱ）、 单链DNA结合蛋白(single strand binding protein, SSB)

E.coli DNA复制起始

DnaA蛋白 DnaB蛋白 结合oriC的4个9bp反向重复序列形成复制起始复合物. 作用于oriC的3个13bp正向重复序列，DNA在这3个位点解链，形成开放型复合物（open complex） . DnaB蛋白 53解旋酶作用产生两条复制模板链,每解开一对碱基，需消耗2分子ATP. 激活引发酶DnaG蛋白. DnaB蛋白与引发酶结合，形成引发体. DnaC蛋白运送与协同DnaB蛋白.

促旋酶 （gyrase，即拓扑异构酶Ⅱ） 解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。促旋酶既能水解 、又能连接磷酸二酯键克服解链过程中的打结、缠绕现象。

SSB蛋白单链DNA结合蛋白 (Single Stranded DNA Binding Protein, SSB) HU蛋白 DNA结合蛋白，对复制起促进作用。 HU蛋白能够使DNA发生折叠。

（二）引发酶合成RNA引物 引发酶 (primase) 依赖DNA的RNA聚合酶。 可以催化游离NTP聚合。 在大肠杆菌，是dna G 基因的表达产物。 催化RNA引物的生成。 E.coli 中DnaB结合引发酶DnaG，催化合成RNA引物 引物（primer）： 　 是由引物酶催化生成的短链RNA，它可为DNA聚合提供3'-OH末端。

（三）复制时聚合酶Ⅲ催化DNA合成而聚合酶Ⅰ切除引物 (dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi

聚合反应的特点 • 以单链DNA为模板 • 以dNTP为原料 • 引物提供3'-OH • 聚合方向为5' →3' • 遵守碱基互补规律

? 3  5外切酶活性 5  3外切酶活性 能辨认错配的碱基对，并将其水解，主要为校读。 核酸外切酶活性 5´ A G C T T C A G G A T A  3´ | | | | | | | | | | | 3´ T C G A A G T C C T A G C G A C 5´ ? 3  5外切酶活性 能辨认错配的碱基对，并将其水解，主要为校读。 5  3外切酶活性 能切除引物和突变的 DNA片段，主要为修复填补。

奥乔亚 科恩伯格 Severo Ochoa Arthur Kornberg 1959 年获诺贝尔生理学或医学奖

原核生物（E.coli） 亚基数目 功　　能 Pol Ⅰ 1 去除RNA引物，DNA损伤修复 Pol Ⅱ 1 DNA损伤修复 Pol Ⅲ 核心酶 3 染色体DNA复制 Pol Ⅲ 全酶 9 染色体DNA复制 Pol Ⅳ (Din B) 1 DNA损伤修复，穿越损伤合成（TLS） Pol Ⅴ (UmuC, UmuD) 3 TLS（translesion synthesis） 真核生物 亚基数目 功　　能 Pol  4 合成引物 Pol  1 碱基切除修复 Pol  3 线粒体DNA复制和损伤修复 Pol  2~3 DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复 Pol  4 DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复 Pol  1 DNA交联损伤修复 Pol  1 TLS Pol  1 减数分裂相关的DNA损伤修复 Pol  1 体细胞高变（somatic hypermutation） Pol  1 TLS Pol  1 相对准确的TLS（穿越环丁烷二聚体） Pol  1 TLS，体细胞高变 Rev 1 1 TLS

DNA聚合酶Ⅲ全酶结构 全酶结构包括： ２个核心酶 1个-复合物（、、、、、 6种亚基） 可滑动的DNA夹子（含1对-亚基）

-复合物由6种亚基组成：、、、、、 核心酶由、和亚基组成： 1. 亚基（130 000）主要功能是合成DNA. 2. 亚基具有35外切酶活性（校正功能）亚基可增强其活性. 3. 亚基可能起组装作用. β亚基(DNA夹子) 能夹稳模板链，负责酶沿DNA模板滑动的作用。 -复合物由6种亚基组成：、、、、、 2个-亚基分别和1个核心酶相互作用，其柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成前导链和后随链。 功能：-复合物是DNA夹子加载蛋白，负责将可沿DNA链滑动的一对-亚基（DNA夹子）加载于DNA，使DNA聚合酶Ⅲ具有持续合成能力。

DNA-pol Ⅰ 功能：校读，去除RNA引物，填补空隙，参与DNA损伤修复。

N 端 DNA-pol Ⅰ C 端 木瓜蛋白酶 小片段 大片段/Klenow 片段 323个氨基酸 604个氨基酸 5  核酸外切酶活性 DNA聚合酶活性   5 核酸外切酶活性 Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

(四) Tus蛋白识别复制终点使复制终止 在复制叉汇合点两侧约100kb处各有一个终止区（ter D/A和ter C/B）。 Tus蛋白具有反解旋酶（contra-helicase）活性，识别并结合ter序列中共有序列，阻止DnaB蛋白的解旋作用，从而抑制复制叉前进。 Tus蛋白除了使复制叉停止运动以外，还可能造成复制体解体。

(四) DNA连接酶 连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。 5’ 3’ 3’ HO 5’ ATP（NAD+） DNA连接酶 AMP 5’ 3’ 3’ 5’

(六) DNA复制需要两类DNA拓扑异构酶 在复制过程中，DNA每复制10bp，复制叉前方的模板DNA双螺旋就要绕其长轴旋转一周，产生正超螺旋。 拓扑异构酶是一种可逆的核酸酶。它们可共价结合DNA分子上的磷酸基团，切断磷酸二酯键。 DNA拓扑异构酶功能： 消除正超螺旋，使复制叉能够顺利前进。 维持E.coli、噬菌体和质粒DNA复制起始模板DNA负超螺旋状态。 环形染色体复制后产生的两个子染色体连环体解连环。

切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 作用机制 切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 反应不需ATP。 拓扑异构酶Ⅰ 切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。（主要） 拓扑异构酶Ⅱ

E.coIi的TopoⅠ只作用于负超螺旋DNA，消除负超螺旋。

DNA拓扑异构酶Ⅱ的功能 E.coli的TopoⅡ将前方产生的正超螺旋转变为负超螺旋。

E.coli 的TopoⅣ功能是将复制产生的两个子染色体从连环体中分离出来，催化连环和去连环过程 。

DNA复制的过程 Dna B、 Dna C 3 Dna A 引物酶 5 3 DNA拓扑异构酶 SSB 5

3 引物酶 3' HO 5' 引物 5 3 5

5' 3' DNA-pol 5' OH 3' 3' dATP dGTP dTTP dCTP

随从链上不连续性片段的连接 5 RNA酶 5 DNA-pol Ⅰ dNTP 5 ATP DNA连接酶 AMP+PPi 5 OH P

二、真核生物DNA复制和原核生物相似但更为复杂 真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等； DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶/转换； 切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAse HⅠ和FEN1等。

(一)常见的真核细胞DNA聚合酶有5种 A家族与大肠杆菌PolⅠ同源，包括Pol 和Pol  B家族与大肠杆菌Pol Ⅱ同源，包括Pol 、、和ζ C家族与大肠杆菌Pol Ⅲ同源，仅在真菌中发现 X家族与大肠杆菌DNA聚合酶并无同源性，却与末端转移酶同源，成员包括Pol 、、 Y家族（ UmuC/DinB超家族），近年发现一个特殊的真核及原核DNA聚合酶家族，成员包括Pol 、、和Rev1

常见的真核DNA聚合酶有5种： Pol 负责合成引物 Pol 负责DNA复制、核苷酸切除修复和碱基切除修复

(二)真核DNA复制叉主要蛋白质的类型和功能与原核基本相似 功 能 RPA 单链DNA结合蛋白，激活DNA聚合酶，使解旋酶容易结合DNA PCNA 激活DNA聚合酶和RFC的ATPase活性 RFC 有依赖DNA的ATPase活性，结合于引物-模板链，激活DNA聚合酶， 促使PCNA结合于引物-模板链 Pol /引发酶 合成RNA-DNA引物 Pol / DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复 FEN1 核酸酶，切除RNA引物 RNAse HⅠ 核酸酶，切除RNA引物 DNA连接酶Ⅰ 连接冈崎片段 DNA解旋酶 DNA双螺旋解链，参与组装引发体 TolⅠ和TolⅡ 拓扑异构酶，去除负超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除复制叉前方产生的正超螺旋

1. DNA聚合酶/引发酶复合物合成RNA-DNA引物 DNA聚合酶（Pol ）分子含有4个亚基： p180：催化亚基 p48：具有引发酶活性 p58：p48的稳定性和活性所必需的 p70：与组装引发体有关

Pol /引发酶复合物 功能：合成RNA引物 反应过程： 调节：磷酸化的调节作用（抑制） 首先，合成RNA引物； 其次，利用DNA聚合酶活性将引物延伸，产生起始DNA（initiator DNA，iDNA）短序列，形成RNA-DNA引物； 最后，Pol /引发酶脱离模板链DNA，发生DNA聚合酶转换（switch）。

2. RPA的功能与E.coli的SSB相似 复制蛋白A（replication protein A，RPA） 结构： p70、p34和p11组成异源三聚体 功能： 结合单链DNA 促使双螺旋DNA解旋 激活Pol /引发酶活性 为Pol 依赖复制因子C（RFC）和增殖细胞核抗原（PCNA）合成DNA所必需 RPA三聚体与SV40 T抗原结合，组装引发体复合物所必需 RPA参与DNA重组和修复

3. RFC与E.coli DNA聚合酶Ⅲ的-复合物功能相似 复制因子C（replication factor C，RFC） 结构：有p140，p40，p38，p37、p36 5个亚基 p140 结合PCNA p40、p37和p36组成稳定的核心复合物，具有依赖DNA的ATPase活性 p38可能在p140和核心复合物之间起连接作用 功能： 促使可滑动的DNA夹子PCNA结合于引物-模板链，是Pol 在模板DNA链上组装并形成具有持续合成能力全酶所必需的。

4. PCNA是可滑动的DNA夹子 增殖细胞核抗原 结构： 功能： 同源三聚体，可形成闭合环形的可滑动DNA夹子。 （proliferating cell nuclear antigen，PCNA） 结构： 同源三聚体，可形成闭合环形的可滑动DNA夹子。 功能： PCNA是Pol 的进行性因子，使Pol 获得持续合成能力。 PCNA是协调DNA复制、损伤修复、表观遗传和细胞周期调控的核心因子。 PCNA水平是检测细胞增殖的重要指标。 PCNA能激活Pol 。

5. DNA聚合酶合成前导链和后随链 DNA聚合酶 结构：Pol 分子是异源二聚体（p125和p50） p125：催化亚基，具有DNA聚合酶活性和35核酸外切酶活性，其N端区与PCNA相互作用 p50：辅助PCNA激活p125 功能：Pol 合成前导链和后随链

6. FEN1和RNAse HⅠ切除RNA引物 FEN1（flap endonuclease 1）具有核酸内切酶和53核酸外切酶活性。 RNAse HⅠ是核酸内切酶，参与冈崎片段成熟时切除5端RNA引物，底物RNA连接在DNA链的5端，切割后在DNA链的5端残留一个核糖核苷酸，这个核苷酸再被FEN1切除。

7. DNA解旋酶打开双螺旋以暴露复制模板 DNA复制需要DNA解旋酶打开DNA双螺旋，使复制模板链得以暴露。 8. 真核DNA复制叉模型

真核生物复制过程中酶及功能 Pol /引发酶 合成RNA-DNA引物 Pol  合成前导链和后随链 RFC 识别引物iDNA的3端并驱除Pol /引发酶 PCNA 结合DNA并引入Pol  RNAse H I/FEN1 切除冈崎片段5端的RNA引物 Pol （或Pol ） 填补冈崎片段之间的空隙 DNA连接酶Ⅰ 封口 RPA 稳定解旋后的单链DNA 解旋酶 复制叉的形成和移动必不可少 拓扑异构酶 释放复制叉前进时产生的扭曲应力

(三) 引发和延伸发生DNA聚合酶/转换 1. 解旋酶与Pol /引发酶相互作用组装引发体 识别染色体DNA复制起点和DNA局部解旋后，Pol /引发酶复合物结合于复制起点，这一步叫做引发体组装。 引发体组装包括DNA解旋酶与Pol /引发酶相互作用。 2. DNA聚合酶/转换 前导链：出现在引发后期 后随链：发生于每个冈崎片段合成之际 发生DNA聚合酶/转换的原因是Pol 不具备持续合成能力 DNA聚合酶/转换的关键蛋白是RFC

真核DNA聚合酶转换和后随链合成

(四) 切除RNA引物有两种机制 依赖RNAse HⅠ/FEN1切除方式： 首先RNAse HⅠ利用核酸内切酶活性切割连接在冈崎片段5端的RNA片段，在RNA-DNA引物连接点旁留下1个核糖核苷酸； 然后FEN1利用53核酸外切酶活性切除这最后一个核糖核苷酸。 依赖Dna2/FEN1切除方式： 解旋酶Dna2具有依赖DNA的ATPase和35解旋酶活性，其解旋作用可以使前一个冈崎片段的5端引物形成“盖子”结构，再由FEN1的内切酶活性切除引物。

切除RNA引物的两种机制 RNAse HⅠ/FEN1 Dna2/FEN1

(五) 真核染色体在每个细胞周期中只能复制一次 真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞周期的S期，而且只能复制一次。

复制基因（replicator）是指DNA复制起始所必需的全部DNA序列。 1. 前复制复合物在G1期形成而在S期被激活 复制基因（replicator）是指DNA复制起始所必需的全部DNA序列。 真核细胞DNA复制的起始分两步进行，即复制基因的选择和复制起点的激活。

复制基因的选择出现于G1期，基因组的每个复制基因位点均组装前复制复合物（pre-replicative complex，pre-RC）。 复制起点的激活出现于细胞进入S期以后，这一阶段将激活pre-RC，募集若干复制基因结合蛋白和DNA聚合酶，并起始DNA解旋。 在原核细胞中，复制基因的识别与DNA解旋、募集DNA聚合酶偶联进行。而在真核细胞中，这两个阶段相分离可以确保每个染色体在每个细胞周期中仅复制一次。

前复制复合物（pre-RC）的形成 复制起点识别复合物（origin recognition complex，ORC）识别并结合复制基因。 ORC至少募集两种解旋酶加载蛋白Cdc6和Cdt1。 三种蛋白质一起募集真核细胞解旋酶Mcm2-7。

在S期，pre-RC被蛋白激酶（Ddk和Cdk）磷酸化，从而被激活。 pre-RC磷酸化导致在复制起点组装其他复制因子并起始复制，复制因子包括3种DNA聚合酶。 DNA聚合酶在复制起点按一定顺序组装：首先Pol 和Pol 结合，然后是Pol /引发酶。

pre-RC的激活和组装真核DNA复制叉

真核细胞通过依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）严格控制pre-RC的形成和激活。 （1）激活pre-RC，以起始DNA复制； （2）抑制形成新的pre-RC。

在每个细胞周期过程中，仅有一次机会形成pre-RC，也仅有一次机会激活pre-RC。 pre-RC在被激活后即解体，所暴露的复制基因可形成新的pre-RC并迅速结合ORC。但在S、G2和M期，高活性的Cdk抑制pre-RC的其他组分结合ORC。只有当染色体分离和细胞分裂完成时，Cdk的活性消失，新的pre-RC才能形成。

(六)端粒酶确保染色体末端复制完整 前导链产生完整的子染色单体。 后随链3端留下缩短的未复制的ssDNA区。

TTTTGGGGTTTTGGGG… 端粒（telomeres）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。 人的端粒重复序列为5’-TTAGGG-3。 这些重复序列多为双链，但每个染色体的3’端比5端长，形成单链ssDNA。这一特殊结构可解决染色体末端复制问题。 功能 维持染色体的稳定性 维持DNA复制的完整性 TTTTGGGGTTTTGGGG…

端粒酶 端粒酶（telomerase）是一种核糖核蛋白（RNP），由RNA和蛋白质组成。 端粒酶以自己的RNA组分作为模板，以染色体的3端ssDNA（后随链模板）为引物，将端粒序列添加于染色体的3端。这些新合成的DNA为单链。 组成 端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白 (human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTRT)

2009年诺贝尔生理学或医学奖

大事记 1939年，Barbara McClintock发现玉米细胞的染色体断裂末端容易融合 1972年，James Watson提出染色体复制的末端隐缩问题 1978年，报道四膜虫的端粒序列 1982年，端粒的发现导致人工染色体的发明 1984年，报道酵母的端粒序列 1985年，报道四膜虫的端粒酶活性 1989年，报道四膜虫端粒酶的RNA亚基 1994年，报道酵母端粒酶的RNA亚基 1995年，报道酵母端粒酶活性 1996年，纯化了四膜虫端粒酶的催化亚基,遗传筛选到酵母端粒酶的催化亚基 1997年，证明了四膜虫和酵母端粒酶的催化亚基

端粒及端粒酶的意义 成年人端粒比胚胎细胞端粒短； 老化与端粒酶活性下降有关； 肿瘤的发生与端粒酶活性有关； 端粒酶不一定能决定端粒的长度。

细胞衰老 细胞分裂 细胞分裂 端粒酶 永生化 抗肿瘤靶点

正常细胞： 细胞年轻化 细胞分裂 抗衰老 细胞分裂 衰老死亡 端粒酶 重新引入

三、线粒体和噬菌体DNA复制具有特殊方式 线粒体DNA的D环（D-loop）复制 噬菌体的滚环（rolling circle）复制

（一）线粒体DNA按D环方式复制 DNA-pol γ dNTP 线粒体DNA分子特点： 环形、双螺旋DNA分子 两条链一条为重链（H链），另一条为轻链（L链） dNTP DNA-pol γ

线粒体DNA复制特点： 有特异的复制起点； 环形线粒体DNA两条链（H和L）的复制不同步D环或取代环（displacement loop）：线粒体DNA复制开始以H链作为模板合成新的L链，取代原来的L链并和H链互补，而原来的L链则保持单链状态，形成类似英文字母D的区域； 两条链具有不同的复制起点和相反的合成方向； 线粒体DNA复制也需要RNA引物。

（二）噬菌体DNA按滚环方式复制 E.coli 噬菌体DNA的分子结构特点： 噬菌体DNA复制特点： 环形双螺旋DNA分子 一条为模板链，另一条为非模板链 噬菌体DNA复制特点： 仅以一条链作为模板合成若干环形DNA分子拷贝 噬菌体DNA复制的方式是滚环复制

滚环复制： 噬菌体DNA复制首先由它自己编码的A蛋白在非模板链上造成缺口，再以所产生的游离3端羟基作为引物，并在宿主细胞的DNA聚合酶、解旋酶和SSB蛋白等作用下合成新链，新链和模板链互补并取代了原来的非模板链。这种复制方式称为滚环复制 。

3-OH 5-P 5'  5 3 5 3 5' 滚环复制

滚环复制和D环不对称复制的存在说明： 双螺旋DNA在复制起点解链不一定导致两条链同时复制，也可能利用一条链作为模板起始DNA合成。

Reverse Transcription 第三节 Reverse Transcription DNA的反转录合成

RNA肿瘤病毒  DNA原病毒（或前病毒） 反转录的发现发展了中心法则 1964年，Temin H等发现原病毒（provirus）DNA是RNA肿瘤病毒在复制过程中的中间物。 RNA肿瘤病毒  DNA原病毒（或前病毒） 原病毒或前病毒：存在于真核染色体中和反转录病毒RNA基因组相对应的双链DNA序列。

经典中心法则： DNA中间模板分子（mRNA）蛋白质 1970年，Temin和Baltimore发现了反转录酶。 反转录酶的发现扩大与发展了中心法则。 反转录：在反转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程。 反转录病毒（retroviruses ）： RNA病毒，含有反转录酶。

一、反转录酶以tRNA为引物合成双链cDNA 反转录酶：从RNA病毒中发现，能催化以RNA为模板合成双链DNA的酶，全称为依赖RNA的DNA聚合酶 反转录酶有3种酶的活性： RNA指导的DNA聚合酶活性； DNA指导的DNA聚合酶活性； RNAse H的活性是指它能够从53和35两个方向水解DNA-RNA杂合分子中的RNA。

反转录酶的结构

反转录病毒RNA基因组和原病毒

反转录病毒RNA基因组转变为双链cDNA的途径

反转录酶的过程 引物：宿主tRNA分子的3‘-OH端 cDNA是反转录最终的双链DNA，其长度较模板RNA要长，5’端多出U3，3’端多出U5，故两端多出相同的长末端重复序列（LTR）. 反转录病毒的R序列：逆转录病毒RNA两端均含的重复序列，对于复制的完整性起重要作用。 cDNA链的两次转换：第一次在cDNA第一条链的U5-R合成后，第二次cDNA第二条链合成之初。 PBS：primer binding sequence PPT: polypurine tract, 多嘌呤序列

二、反转录病毒在宿主细胞内的主要活动 （一）反转录合成双链cDNA （二）双链cDNA插入宿主染色体形成原病毒

（三）原病毒DNA转录产生病毒RNA 具有自我复制能力的反转录病毒基因组含有3个基因： 原病毒初级转录产物有3种重要功能： gag基因编码几种病毒核心蛋白（衣壳蛋白）; pol基因编码3种酶：反转录酶、蛋白酶和整合酶; env基因编码插入病毒外膜磷脂双层中的糖蛋白。 原病毒初级转录产物有3种重要功能： 直接翻译产生多蛋白Gag和Gag-Pol。 含有包装信号，因此构成完整的病毒基因组。 大约一半初级转录产物经过剪接加工形成gag-pol mRNA和env mRNA。

（四）病毒RNA经翻译和包装形成反转录病毒颗粒 初级转录产物多蛋白Gag-Pol，经过蛋白酶水解，可产生反转录酶、蛋白酶和整合酶。 多蛋白Gag经过加工，生成4种病毒衣壳蛋白。 env基因编码的Env蛋白，经过加工以后插入病毒外膜磷脂双层。 这些病毒蛋白和病毒RNA基因组可以迅速组装成许多新的反转录病毒颗粒。

第四节 DNA Damage and Repair DNA损伤修复

一、多种因素通过不同形式可引起DNA损伤 突变 (mutation)： 是由遗传物质结构改变而引起的遗传信息的改变。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。 DNA损伤 (DNA damage)： 泛指一切DNA结构和功能的变化。包括各种突变类型、碱基的损伤和DNA链的断裂。

引起DNA损伤的因素： 碱基开环和糖苷键断裂引起碱基丢失：多为自发性，自然错配率约为10-9～10-10 左右。 辐射或氧化损伤等引起碱基改变：如相邻的两个嘧啶碱基之间的共价交联。 化学因素可引起核苷酸插入或缺失：溴化乙啶等。 辐射和化学损伤可引起DNA链断裂：博来霉素损伤磷酸二酯键。 物理和化学因素可引起DNA链间或链内交联：丝裂霉素等。

DNA损伤的结果: 导致复制或转录障碍 导致复制后产生基因突变 突变是进化、分化的分子基础 突变导致基因型改变 突变导致死亡 突变是某些疾病的发病基础

二、DNA损伤修复系统有多种类型

（一）直接修复（direct repair） 光复活修复系统 修复对象：将DNA中因紫外线照射而形成的嘧啶二聚体分解。 机制：细胞内光裂合酶（photolyases）分子中生色基团次甲四氢叶酸吸收光子并将FADH2激活生成的激发型FADH2，再将电子转移给嘧啶二聚体，使其还原。 分布：分布广泛，除哺乳动物外均有之。 光修复酶

O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶修复 修复对象：DNA中被甲基化修饰的鸟嘌呤（O6-甲基鸟嘌呤，与T配对）。 机制：将甲基转移到酶蛋白活性中心的Cys残基侧链上，使鸟嘌呤复原，避免发生突变。 特点：DNA甲基转移酶一旦接受甲基就不再具有催化活性 ，修复代价高昂 。

（二）碱基切除系统修复切除受损碱基 碱基切除修复（base excision repair, BER） 对象：受损的碱基 修复系统： 糖苷酶（glycosylases）识别、切除受损碱基，产生AP位点（apurinic or apyrimidinic site）。 AP内切酶在AP位点的5’端切断磷酸二酯键。 AP外切酶再切割AP位点的3’端。 DNA聚合酶填补产生的缺口。 最后DNA连接酶连接。

E.coli碱基切除修复系统 切除胞嘧啶自发脱氨基产生的尿嘧啶

DNA糖苷酶识别的异常碱基包括： 自动防故障（fail-safe）系统 胞嘧啶脱氨基产生的尿嘧啶； 氧化的鸟嘌呤（oxoG）； 脱氨基的腺嘌呤； 开环碱基； 碳原子之间双键变成单键的碱基等。 自动防故障（fail-safe）系统 功能：利用DNA糖苷酶切除DNA复制前未去除的损伤碱基。

碱基切除修复系统切除鸟嘌呤氧化产物oxoG

（三）核苷酸切除修复系统识别DNA双螺旋变形 核苷酸切除修复（nucleotide excision repair, NER）系统识别DNA双螺旋形状的变形。 DNA聚合酶和连接酶以未损伤的DNA链为模板修补缺口。 E.coli的NER主要由4种蛋白质组成: UvrA, UvrB, UvrC和UvrD

核苷酸切除修复系统： UvrA识别DNA双螺旋结构变形 UvrB负责解链，募集核酸内切酶UvrC UvrC在损伤部位的两侧切断DNA链 UvrD去除这两个切点之间的DNA片段 DNA聚合酶Ⅰ和连接酶填补缺口

着色性干皮病(xeroderma pigmentosis，XP) 高等真核生物的NER作用： XPC蛋白负责发现DNA双螺旋中的变形 XPA 和XPD蛋白具有解旋酶活性 核酸酶ERCC1-XPF切割损伤部位5’侧，XPG切割3’侧 DNA聚合酶和连接酶负责填补产生的缺口 着色性干皮病(xeroderma pigmentosis，XP) 是切除修复缺陷性的遗传病。 XP病人细胞对嘧啶二聚体和烷基化的清除能力降低，不能修复紫外线照射引起的DNA损伤，因此易发生皮肤癌。

XP Symptoms: are usually characterize by a severe sunburn that develops upon acute sunlight exposure. Other skin conditions associated with the disease include an increased amount of freckles, xerosis (dry skin), hyper and hypopigmentation (色素沉着或者减退), abnormally rough skin, and painful apoptosis of the skin. Many of the patients who are born with XP will develop squamal or basal cell skin cancer by age 8 . (From: http://apps.ashland.edu/index.php/Xeroderma_pigmentosa)

Autosomal recessive

NER不仅能够修复整个基因组中的损伤，而且能拯救因转录模板链损伤而暂停转录的RNA聚合酶，即参与转录偶联修复（transcription-coupled repair）。 转录偶联修复的意义：将修复酶集中于正在转录DNA，使该区域的损伤尽快得以修复。 真核转录偶联修复的核心是TFⅡH。 TFⅡH分别参与两个独立过程： 1. 在核苷酸切除修复（包括转录偶联修复）时起DNA解旋酶的作用； 2. 在转录过程中打开DNA模板。

（四）重组修复系统能够修复DNA断裂损伤 重组修复（recombinational repair），发生于损伤较多时，复制时跳过损伤部位，新链产生的缺口由母链弥补。 对于DNA双链断裂（double-strand break，DSB）损伤，细胞也采用重组修复，通过与姐妹染色体正常拷贝的同源重组来恢复正确的遗传信息。

重组修复并没有从亲代DNA中去除二聚体。当第二次复制时，留在母链中的二聚体仍使复制不能正常进行，复制经过损伤部位时所产生的切口，仍旧要用同样的重组过程来弥补，随着DNA复制的继续，若干代以后，虽然二聚体始终没有除去，但损伤的DNA链逐渐“稀释”，最后无损于正常生理功能，损伤也就得到了修复。

（五）跨损伤DNA聚合酶能够跨越损伤部位合成DNA 正在复制的DNA聚合酶可能遭遇尚未修复的DNA损伤，细胞自动防故障系统能够使复制体绕过损伤部位，这一机制就是跨损伤DNA合成（Translesion DNA synthesis，TLS）。 E.coli跨损伤DNA合成由UmuC-UmuD′复合物进行。 跨越损伤修复中的DNA聚合酶虽然依赖模板，但不依赖于碱基互补配对，故合成差错率较高。 DNA损伤修复的最后一种手段，这种DNA聚合酶不常规表达。

E.coli 跨损伤DNA合成

真核生物跨损伤DNA合成

三、DNA损伤修复具有重要的生物学意义 修复系统的存在保证了物种遗传的稳定性，对降低修复缺陷相关疾病的发病率有十分重要的意义。 突变是肿瘤的发动机。 修复系统的弊端：新品种的研发。 遗传性非息肉性结肠直肠癌：Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC)，DNA修复缺陷 乳腺癌：BRCA1 and BRCA2

Ataxia Telangiectasis Nijmegen Breakage Syndrmoe 遗传性疾病 受影响的修复机制（基因） 对染色体的损害 与癌症的相关性 多发性结直肠腺瘤 碱基切除修复（MYH） 点突变机率增加 大肠直肠癌 XP 核苷酸切除修复（XP相关基因群） 皮肤癌 科凯恩综合征 转录合并修复（CSA、CSB等） 无 遗传性非息肉大肠直肠癌 错误配对修复（MLH1、MSH2） 家族性乳腺癌/卵巢癌 同源性重组（BRCA1、BRCA2） 染色体异常 乳癌、卵巢癌 Ataxia Telangiectasis 同源性重组、非同源性末端接合（ATM） 淋巴癌 AT-like Disorder 同源性重组、非同源性末端接合（Mre11） Nijmegen Breakage Syndrmoe 同源性重组、非同源性末端接合（NBS1） IV型黏合酶缺失症 非同源性末端接合（lIG4） 血癌 Bloom Syndrome 同源性重组（BLM） 血癌、淋巴癌 Werner Syndrome 同源性重组（WRN） 各种癌症 Fanconi Anemia 同源性重组（FA相关基因群） 染色体易断裂

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