实验一:细菌的革兰氏染色 1.实验器材 菌种:大肠杆菌;金黄色葡萄球菌;链球菌;溶藻弧菌 溶液和试剂:草酸铵结晶紫、卢哥氏碘液、95%乙醇、番红液 其他用品:显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。 2.实验目的 ①学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。 ②了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 3.基本原理 革染氏染色的机理,与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。经结晶紫初染以后,所用的细菌都被染成蓝紫色。碘作为媒染剂,它能与结晶紫结合形成复合物,从而增强了染料与细菌的结合力。当用乙醇脱色时,两类细菌的脱色效果是不同的,革染氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低,用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小,透性降低,从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内;革染氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高,所以当脱色处理时,类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加,使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。用蕃红复染时染上红色。 4. 实验步骤 具体参照p82
实验内容: 1、每组分别对菌A、B、C、D进行革兰氏染色,通过结果确定细菌种类。 2、分别选取一种G+和G-细菌进行混合涂片,再进行革兰氏染色。 注意事项 为了保证革染氏染色结果的正确性,制片过程中要注意:要选用活跃生长的幼培养物作革染氏染色,涂片不宜过厚,火焰固定不宜过热,脱色时间的控制。
实验流程 混合涂片染色方法同上。 1、 取载玻片用纱布擦干,涂菌的部位在火焰上烤一下,除去油脂。 2、 涂片:先在载玻片上滴一滴无菌水,再用接种环取少量菌体,涂在载 玻片上,使其薄而均匀。 3、 晾干:让涂片在空气中自然干燥(可适度靠近酒精灯火焰旁温干)。 4、 固定:让菌膜朝上,通过火焰2-3次固定(以不烫手为宜)。 5、 染色:将固定过的涂片放报纸上,滴加草酸铵结晶紫液,染1 min。 6、 水洗:用水缓慢冲洗涂片上的染色液,用吸水纸吸干。 7、 媒染:滴加1滴碘液,染1min,水洗。 8、 脱色:吸去残留水,连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色,立即水洗。 9、 复染:滴加蕃红复染2-3 min,水洗。至此,革兰氏染色结束。 10、镜检:干燥后用油镜观察。 混合涂片染色方法同上。