酶的概述 生物化学.

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酶的概述 生物化学

§3.1 酶的一般概念 §3.2 酶的结构与功能的关系 §3.3 酶的作用机理 §3.4 酶促反应动力学 §3.5 酶的分离提纯及活力测定 §3.6 重要的酶

§3.1 酶的一般概念 一、酶的概念与化学本质 二、酶的组成与类别 三、酶的催化特性 四、命名与分类 五、酶的系统编号

一、酶的概念及化学本质 1、酶的概念: 2、酶的化学本质: 酶是生物体活细胞产生的具有特殊催化活性和 特定空间构象的生物大分子,包括蛋白质及核酸, 又称为生物催化剂。 2、酶的化学本质: 绝大多数酶是蛋白质,少数是核酸 RNA,后者 称为核酶。

除少数酶(核酶)外,绝大多数酶是有催化能力的蛋白质,依据: ⑤ 和蛋白质具有相同的颜色反应 ④ 和蛋白质一样不能透过半透膜 ③ 酶存在两性电离和等电点 ② 凡能使蛋白质变性的因素都使酶变性 ① 酶的水解产物为氨基酸,酶具有和蛋白质一样的一级、 二级、三级乃至四级结构 本章只讨论以蛋白质为本质的酶

二、酶的组成与分类 (一)按酶的组成分类 (二)按酶的结构特点及分子组成形式分类 (三)按酶的存在状态分类

(一)按酶的组成成分分为 单成分酶(单纯酶):完全由蛋白质组成,没有辅因子 多成分酶(复合酶): 如消化道中的各种水解酶:淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等 结合酶=酶蛋白(脱辅酶)+辅助因子(辅因子)=全酶 全 酶 酶 蛋 白 辅 助 因 子 结合蛋白质 蛋白质部分 非蛋白质部分

辅酶:和酶蛋白结合疏松,能用透析或超滤方法除去 辅基:和酶蛋白结合紧密,不能用透析或超滤方法除去 辅因子 ●从本质上看,酶的辅助因子: 小分子有机化合物:NAD+、NADP+、FAD、CoA等 金属离子:如 K+、Na+、 Mg2+、Cu2+(或Cu+)、Zn2+和 Fe2+(或Fe3+)等。 ●大多数维生素(特别是 B 族维生素)是组成许多酶的辅酶或 辅基的成分(它们的化学结构式见下章维生素)。

●体内酶的种类很多,而辅酶的种类却较少,通常一种酶蛋白 只能与一种辅酶结合,成为一种特异的酶。 ●一种辅酶往往能与不同的酶蛋白结合构成许多种特异性酶。 ●酶蛋白在酶促反应中主要起识别底物的作用,酶促反应的特 异性、高效率以及酶对一些理化因素的不稳定性均决定于酶 蛋白部分。 ●辅因子决定酶的反应种类与性质,其主要作用为:在反应中 传递电子、质子或一些基团。

一些金属离子作为酶的辅助因子 金属离子 酶 金属离子 酶

(二)根据酶的结构特点及分子组成形式分为: 1、单体酶 2、寡聚酶 3、多酶复合体

1、单体酶: 2、寡聚酶: 只含一条肽链,分子量小,大多数水解酶属于此类。 ●由相同或不同的若干亚基构成。 ●由几条或几十条多肽链组成,每条肽链是一个亚基, 单独的亚基无酶的活力。 ●由相同或不同的若干亚基构成。 如:己糖激酶、乳酸脱氢酶,含四个亚基 谷氨酸脱氢酶,含六个亚基

由相同亚基聚合而成的寡聚酶

由不同亚基聚合而成的寡聚酶

3、多酶复合体: ●若干个功能相关的酶彼此嵌合形成的复合体。 ●每个单独的酶都具有活性,当它们形成复合体时,可催 化某一特定的链式反应。 如 脂肪酸合成酶复合体:含有六个酶及一个非酶蛋白质 丙酮酸氧化脱羧酶复合体:含三个酶六个辅助因子

(三)按酶的存在状态分为: 1、胞内酶: 2、胞外酶: 在合成分泌后定位于细胞内发生作用的酶,大多数 的酶属于此类。 在合成后分泌到细胞外发生作用的酶,主要为水解酶。

三、酶催化作用的特性 (一)酶与普通催化剂的共性 (二)酶的催化特性 (三)酶的专一性 (四)酶的专一性的解释

(一)酶与普通催化剂的共性 ●只能催化热力学上允许进行的反应,对于可逆反应,酶只 能缩短反应达到平衡的时间,但不改变平衡常数; ●酶也是通过降低化学反应的活化能来加快反应速度; ●酶在反应中用量很少,反应前后数量、性质不变。

酶与一般催化剂的比较

酶能大幅度地降低化学反应的活化能

酶能显著地降低化学反应的活化能 ● H2O2→H2O + O2 过氧化氢的分解反应 无催化剂时活化能为 75.5 KJ/mol ●蔗糖 → 果糖 + 葡萄糖 无催化剂时活化能为 1339.8 KJ/mol H+(酸)催化时活化能为 104.7 KJ/mol 蔗糖酶催化时为 39.4 KJ/mol

(二)酶的催化特性 1、酶具有极高的催化效率(高效性) 2、酶具有高度专一性(特异性specificity) 3、反应条件温和性 4、酶的活力受多种因素的调节控制

1、酶具有极高的催化效率(高效性) 酶比一般的催化剂效率高 10 7~10 13 倍,是 非酶催化的 10 8~10 20 倍。 酶的高效性是因为酶能大幅度降低化学反应活化能

例如: CO2+H2O H2CO3 CO2+2NH3 NH2-CO-NH2+H2O 碳酸酐酶(红细胞、肺泡细胞、肾小管细胞) 每个酶分子 1s 内催化 6×10 5 个 CO2 水合,比非催化 反应高 107 倍 脲酶: CO2+2NH3 NH2-CO-NH2+H2O 20℃的催化常数为 3×10 4 S -1,比非催化反应大 1014 倍。 一餐饭在 37 ℃下消化,无催化剂时需要 50 年,消化酶 消化只需 3 ~ 4 小时

2、酶具有高度专一性(特异性specificity) 指酶对所作用的底物(substrate)具有选择性。 如:蛋白酶:催化蛋白质水解 脂肪酶:催化脂肪水解 磷酸二酯酶:催化磷酸二酯键水解 3、反应条件温和性: 动物酶作用条件:体温(37 ~ 40℃)、中性(pH 7.4)、 常压; 离开温和的反应条件,酶易失活

4、酶的活力受多种因素的调节控制 酶浓度调节:酶合成与降解速度调节 酶活性调节:变构调节、共价修饰调节 激素调节

1、绝对专一性(absolute specificity) (三)酶的专一性 酶的专一性:也称为酶的特异性,它是指酶对所 作用底物的选择性。 1、绝对专一性(absolute specificity) 根据酶对底物的选择方式不同,酶的专一性分为: 2、相对专一性(relative specificity) 3、光学专一性(optical specificity) 4、几何专一性(geometrical specificity)

2NH3+CO2 NH2CONH2+H2O 1、绝对专一性(absolute specificity) 脲酶 指一种酶只选择一种底物作用,如脲酶: 脲酶 2NH3+CO2 NH2CONH2+H2O

2、相对专一性(relative specificity): 指一种酶选择一类底物作用。 基团专一性(族专一性,group speicificity): 指酶对所作用的键及键一侧或两侧的基团的选择性。 如: α-D-葡萄糖苷酶,胰蛋白酶 键专一性(bond specificity): 指酶对所作用键的选择性,如脂肪酶。 根据酶选择的对象不同又分为:

3、光学专一性(optical specificity): 指酶对所作用底物立体构型的选择性。 4、几何专一性(geometrical specificity): 指酶对所作用底物顺-反异构的选择性。 如 顺乌头酸酶

(四)酶的专一性的解释 1、锁与钥匙学说(直接契合学说) 2、诱导契合理论 3、结构性质互补假说 4、三点附着学说

德国的化学家 Emil Fisher 1894 年提出。 1、锁与钥匙学说(直接契合学说): 德国的化学家 Emil Fisher 1894 年提出。

2、诱导契合理论: 1958年 Koshland 提出

3、结构性质互补假说 4、三点附着学说 该学说认为酶同底物结合的专一性,与底物结构和酶的 活性中心的空间结构相关,二者的结构是互补的。如果底物 是解离的,则酶的活性中心的空间结构必然带相反的电荷才 能很好结合。而且底物同酶活性中心的极性也必然相同。 4、三点附着学说

四、酶的命名与分类 (一)酶的命名 (二)酶的系统分类方法

(一)酶的命名 通常采用习惯命名法 习惯命名法主要根据以下几个原则: 1、底物+酶:如淀粉酶、蛋白酶、 脂肪酶等; 3、来源+底物+作用条件+酶等:如细菌淀粉酶、碱性 磷酸酯酶、胃蛋白酶等。 2、反应的性质+酶:如脱氢酶、脱羧酶、水解酶等;

从上述可知,酶的习惯命名法不够系统,不够准确, 难免会出现一酶多名或一名多酶的现象。 1961 年国际酶学委员会(Enzyme Commission,EC)提出了系统命名法。 系统命名法规定,酶的名称包括两部分: 如果反应中有多个底物,每个底物均需列出,但水解反应中 的“水”可省略,底物名称之间用“ :”隔开。若底物有构型,也 需标出, 底物名称 + 反应类型

CH3CH2OH + NAD+ → CH3CHO + NADH+H+(反应) 乙醇脱氢酶(习惯名) 乙醇:NAD+ 氧化还原酶(系统名) CH3CH2OH + NAD+ → CH3CHO + NADH+H+(反应) 谷丙转氨酶(习惯名) 丙氨酸:α-酮戊二酸氨基转移酶(系统名) 丙氨酸+α-酮戊二酸 → 丙酮酸 + 谷氨酸(反应) 脲酶(习惯名) 尿素:水解酶(系统名)

(二)酶的系统分类方法 根据酶所催化反应的性质,由酶学委员会规定,将 酶分为六大类: 1、氧化还原酶类:催化氧化还原反应 2、转移酶类:催化底物之间基团的转移反应 3、水解酶类:催化底物的水解反应 4、裂合酶类:催化底物裂解或缩合反应 5、异构酶类:催化同分异构体的底物之间相互转换 6、合成酶类

1、氧化还原酶类:催化氧化还原反应 通式: AH2 + B→BH2 + A 乳酸+NAD+→丙酮酸+NADH+H+ 其中:A 为质子供体,B 为质子受体 通式: AH2 + B→BH2 + A 乳酸+NAD+→丙酮酸+NADH+H+ 如:乳酸脱氢酶催化的反应:

2、转移酶类:催化底物之间基团的转移反应 通式: AR+B→BR+A 其中:R 为转移基团,R 不为 2H 如:己糖激酶、转氨酶、脂酰转移酶、糖基转移酶等。 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应:

例如,脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应: 通式: AB + H2O →AH + BOH 3、水解酶类:催化底物的水解反应 催化底物的水解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶 及脂酶等。 例如,脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应:

4、裂合酶类:催化底物裂解或缩合反应 通式: AB A+B 例如,延胡索酸水合酶催化的反应: 催化底物裂解或缩合反应,主要包括脱水酶、脱氨酶、 脱羧酶、醛缩酶等。 例如,延胡索酸水合酶催化的反应:

5、异构酶类:催化同分异构体的底物之间相互转换 通式: A B 其中:A、B为同分异构体 5、异构酶类:催化同分异构体的底物之间相互转换 如 磷酸甘油酸变位酶、6-磷酸葡萄糖异构酶等。 葡萄糖异构酶催化的反应

CH3COC0A+CO2+ATP →HOOCCH2COC0A+AMP+PPi 6、合成酶类 也称连接酶类,催化两种或两种以上化合物合成一种化合 物的反应。反应需吸收能量,通常与 ATP 的分解相偶联, ATP 分解产生能量用于合成反应。 通式: A+B+ATP→AB+ADP+Pi 或 A+B→AB+AMP+PPi CH3COC0A+CO2+ATP →HOOCCH2COC0A+AMP+PPi 如,乙酰辅酶A羧化酶催化的反应:

五、酶的系统编号 根据上述酶的系统分类方法,国际酶学委员会还对每个酶 做了统一编号,一个酶只有一个编号,因此不会混淆。 酶的系统编号由“EC”加四个阿拉伯数字组成,每个数字之 间以“ . ”隔开。

§3.2 酶的结构与功能的关系 一、酶活性中心与必需基团 二、酶高级结构与功能的关系 三、酶原激活

一、酶的活性中心与必需基团 (一)酶的活性中心概念 (二)酶的活性中心以外的必需基团 (三)酶活性中心证明方法 (四)酶的活性中心的一级结构

(一)酶的活性中心概念 ● 酶分子中直接参与与底物相结合并与酶的 催化作用有关的部位就称为酶的活性中心 (active center)。 催化中心:催化发生化学反应的部位,决定 酶催化能力的大小 结合中心:与底物相结合的部位,决定酶与 底物的专一性

● 酶的活性中心往往是若干个 在一级结构上相距很远,但在 空间结构上彼此靠近的氨基酸 残基集中在一起形成具有一定 空间结构的区域,该区域与底 物相结合并将底物转化为产物, 对于结合酶来说,辅酶或辅基 往往是活性中心的组成成分。 凝乳蛋白酶的一级结构 和空间结构

活性中心由少量残基构成并且在一级结构上可能相距较远

溶菌酶的活性中心 ●谷氨酸35和天冬氨酸52是催化基团; ●色氨酸62和63、天冬氨酸101和色氨酸108是结合基团; ●A~F为底物多糖链的糖基,位于酶的活性中心形成的裂隙中。

溶菌酶的活性中心

(二)酶的活性中心以外的必需基团(essential group) ● 酶的分子中还存在着许多功能基团,例如,-NH2、-COOH -SH、-OH 等,但并不是这些基团都与酶活性有关。一般 将与酶活性有关的基团称为酶的必需基团。 ●必需基团可分为四种: 接触残基(contact residue) 辅助残基(auxiliary residue) 结构残基(structure residue) 非贡献残基(noncontribution residue)

(三)酶活性中心证明方法 1、切除法 2、化学修饰法 3、亲和标记法 4、X-射线衍射法:

1、切除法 对小分子且结构已知的酶多用此法。用专一性的酶切 除一段肽链后剩余的肽链仍有活性,说明切除的肽链与 活性无关,反之,切除的肽链与活性有关。

2、化学修饰法 ●选用适当的化学试剂与酶蛋白中的氨基酸残基的侧链 基团发生反应,引起共价结合、氧化或还原等修饰, 称之为化学修饰。 -SH、-OH、咪唑基、氨基、羧基、胍基 等 ●酶分子中可以修饰的基团有:

●用作修饰的试剂很多,目前已有七十多种,但专一性 的修饰剂不多。 ●活力中心判断方法: 某一基团被修饰后,酶的活性显著下降或无活性,可初 步判断该基团与酶的活性有关;反之,与酶的活性无关。

●缺点:也有可能酶活性部位外的某个氨基酸残基侧链的 修饰而影响酶分子的正常空间结构,而导致酶活性的丧 失。为排除这种可能,常在底物保护下用同一试剂对酶 作用,若不能被修饰,说明该基团确实处于活性部位; 反之,底物存在下,该基团可被同一试剂修饰,且使酶失 活,在则该基团不是活性部位的基团,而是结构基团。

根据修饰剂是否专一性结合酶的活性中心的 特定基团,化学修饰可分为: 非特异性共价共接修饰 特异性的共价修饰

(1)非特异性共价共接修饰: 修饰试剂既可与酶的活性部位的某特异基团结合,又 可与酶的非活性部位的同一基团结合,称之为非特异 性共价修饰。 此法适用于所修饰的基团只存在与活性部位,在非活性 部位不存在或极少存在。判断标准是: ① 酶活力的丧失程度与修饰剂的浓度成正比; ② 底物或竞争性抑制剂保护下可防止修饰剂的抑制作用。

(2)特异性的共价修饰: 修饰剂专一性地结合于酶的活性部位的特定基团,使 酶失活。 如:DIFP(二异丙基氟磷酸)可专一性地结合丝氨酸 蛋白酶活性部位的丝氨酸-OH 而使酶失活。DIFP 一般 不与蛋白质反应,也不与含丝氨酸的蛋白酶原或变性的酶 反应,只与活性的酶且活性部位含丝氨酸的酶结合。

3、亲和标记法 根据酶与底物能特异性的结合的性质,设计合成一种含反 应基团的底物类似物,作为活性部位的标记试剂,它能象底 物一样进入酶的活性部位,并以其活泼的化学基团与酶的活 性基团的某些特定基团共价结合,使酶失去活性。 胰凝乳蛋白酶最适底物: N-对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰乙酯或甲酯 亲和标记试剂: N-对甲苯磺酰-苯丙氨酰氯甲基酮(TPCK) 分子中的氯甲基酮部分可使酶的 His 57 烷基化形成酶 -TPCK 衍生物而使酶失活

4、X-射线衍射法: 把一纯酶的 X-射线晶体衍射图谱和酶与底物反应后 的X-射线图谱相比较,即可确定酶的活性中心。

(四)酶的活性中心的一级结构 ●应用化学修饰法对多种酶的活性中心进行研究发现,在酶 的活性中心处存在频率最高的氨基酸残基是:丝氨酸、组氨 酸、天冬氨酸、酪氨酸、赖氨酸和半胱氨酸。如果用同位素 标记酶的活性中心后,将酶水解,分离带标记水解片段,对 其进行一级结构测定,就可了解酶的活性中心的一级结构。 ●对各种蛋白水解酶进行类似的分析,功能类似的酶在一级 结构上有惊人的相似性。见下表:

…Ser.Cys.Gly.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro.Val… 酶 氨 基 酸 顺 序 牛胰蛋白酶 …Ser.Cys.Gly.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro.Val… 牛胰凝乳蛋白酶 …Ser.Cys.Met.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro.Leu… 猪弹性蛋白酶 …Gly.Cys.Gln.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro.Leu… 猪凝血酶 ..Asp.Ala.Cys.Gln.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro.… 从上表可知,一些丝氨酸蛋白酶在活性丝氨酸附近的氨基酸 几乎完全一样,而且这个活性丝氨酸最邻近的5-6氨基酸顺序, 从微生物到哺乳动物都一样,说明蛋白质活性中心在种系进化 上有严格的保守性。

二、酶的活性与高级结构的关系 酶的活性不仅与一级结构有关,而且与其高级结构 密切相关。就某种程度而言,在酶的活性表现上,高级 结构甚至比一级结构更为重要。高级结构是形成酶特定 空间结构的保证,高级结构破坏,酶失去活性。

三、酶原激活 ●无活性状态的酶的前体称为酶原(zymogen)。 ●酶原向活性的酶转化的过程称为酶原的激活。 ●酶原激活实际上是酶的活性中心形成或暴露的过程。

胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶原的激活 激活条件 活化的酶 水解掉的肽段 胃蛋白酶原 H+或胃蛋白酶 胃蛋白酶 44肽 胰蛋白酶原 肠激酶或 胰蛋白酶 六肽 糜蛋白酶原A 糜蛋白酶 α-糜蛋白酶 两个二肽 羧肽酶原A 羧肽酶A 几个碎片 弹性蛋白酶原 弹性蛋白酶

胰蛋白酶原的激活过程

胰凝乳蛋白酶原、 胰蛋白酶原的激活过程

胃蛋白酶原的激活过程

酶原激活的生理意义: ●在于避免细胞内产生的蛋白酶对细胞进行自身消化,并 可使酶在特定的部位和环境中发挥作用,保证体内代谢 的正常进行。 ●酶原还是生物体储存酶的一种方式。 除消化道的蛋白酶外,血液中有关凝血和纤维蛋白溶解 的酶类,也都以酶原的形式存在,凝血过程是一系列与凝血 有关的酶或凝血因子的激活过程。

酶原激活的级联反应:凝血机制

防止酶原超前激活的措施:以胰蛋白酶为例 胰腺中的胰蛋白酶抑制剂:胰蛋白酶底物的类似物,Mr为 6×103,与胰蛋白酶有很高的亲和力 α1-抗胰蛋白酶(或称抗弹性蛋白酶): Mr 为 5.3×104 的血浆蛋白质 该抑制剂对弹性蛋白酶的抑制作用大于胰蛋白酶; 与蛋白酶活力部位不可逆结合是蛋白酶失活; 肺气肿患者血清中该抑制剂明显低于正常人