酶免疫技术 Enzyme Immunoassay

免疫标记技术是用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应 荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定 敏感性、特异性、精确性及应用范围

免疫荧光技术 放射免疫技术 免疫酶技术 免疫电镜技术 免疫胶体金技术 发光免疫测定

                                               免疫标记技术

酶免疫技术 Enzyme Immunoassay（EIA） 一、概述 抗原抗体反应＋酶催化反应 肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光光度计 特异、敏感 可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。

                                               酶免疫标记用于抗原检测

（一）基本原理 酶标记抗体或抗原： 抗体或抗原的免疫学反应特异性 ＋ 酶活性 酶是一种有机催化剂： 使底物基质水解而呈色 使供氢体由无色还原型变为有色氧化型 ∴ 可用呈色反应显示酶的存在。 　　很少量的酶即可导致大量的催化过程，所以极为敏感。

（二）常用的酶及其底物 酶活性高；具有抗原抗体共价结合的基团；标记后不影响酶活性及抗原、抗体反应性；产物易判定或测定；酶活性不受样品中其他成分的影响（用于均相测定的酶标抗原与抗体结合后酶活性出现抑制或激活）；无害；稳定，价廉、易得。 常用酶 底物 显色 辣根过氧化物酶 邻苯二胺、H2O2 橙黄色 四甲基联苯胺、 H2O2 蓝色 碱性磷酸酶 对硝基本磷酸脂 黄色

（三）标记方法 酶结合物 技术简单、产率高；不影响酶和抗体（抗原）的生物活性；所得酶标记物稳定；较少形成酶与酶、抗体与抗体、抗原与抗原的聚合物。

戊二醛交联法：抗原-戊二醛-酶 改良过碘酸钠标记法：过碘酸钠氧化酶的羟基为醛基，再与抗体蛋白的氨基结合。HRP-CH2-NH-IgG

（四）酶标记物的纯化及鉴定 1、纯化 游离酶：增加非特异染色 游离抗原（抗体）：竞争降低特异性染色 葡聚糖凝胶层析法 50%饱和硫酸铵沉淀提纯法

2、鉴定 免疫活性鉴定：免疫电泳/双扩/ELISA 酶标记率测定：分光光度法

（五）固相酶免疫测定仪（酶标仪） 比色 测定波长、吸光度范围、光学系统、检测速度、震板功能、温度控制、定性和定量的软件，自动洗板、温育、加样 450nm、492nm、620nm、630nm、650nm、405nm

（六）类型 酶免疫组织化学技术 酶免疫测定 均相酶免疫测定 液相酶免疫测定 异相酶免疫测定 固相酶免疫测定 高敏感、高特异，几乎所有可溶性抗原抗体系统均可用该法检测

酶免疫组织化学技术：检测组织或细胞中抗原或抗体 酶免疫测定：用酶标记抗原或抗体做标记物，检测液体样品中可溶性抗原或抗体含量的微量分析技术。 根据抗原抗体反应后是否需将结合和游离的酶标记物分离，分为均相和异相 均相：酶标抗原+非标记抗原+限量抗体，酶标记物发生抗原抗体反应后，酶活性减弱或增强。 异相：反应后，分离形成复合物的酶标记物并检测。根据是否采用固相材料以吸附抗原或抗体分为液相和固相。 液相：待测抗原+酶标抗原+抗体，一次性温育 待测抗原+抗体，温育，加酶标抗原，温育 固相：固相预先吸附抗原或抗体，在其表面反应

二 、酶免疫组织化学技术 Enzyme Immunohistochemistry Technique（EIHCT） (酶)免疫组织化学（免疫细胞化学）：指带显色剂（酶）标记的特异性抗体或抗原在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原或抗体进行定性、定位、定量测定的技术。 免疫反应特异性 组织化学的可见性

免疫组化技术近年来得到迅速发展。50年代还仅限于荧光免疫组化技术，50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的酶免疫组化技术。 荧光免疫组化技术局限性：荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清 酶免疫组化技术：能克服上述不足，且敏感性更高，对石蜡切片标本尤为适用，酶显色产物具有较高的电子密度，可用电镜观察。

步骤： 抗原的提取与纯化 免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体及纯化 标记抗体 标本处理 抗原抗体反应和呈色反应 显微镜观察

标本 取材新鲜、固定及时、形态保存良好、抗原性不被破坏 活体组织切片或印片 各种体液、穿刺液（细胞沉淀涂片） 培养细胞

1 标本的固定与保存： 固定使细胞内蛋白凝固，终止胞内酶活化，防止细胞自溶，保存抗原性 固定剂：乙醇、丙酮、戊二醛等 切片：冰冻、石蜡 2 酶消化：打开固定过程中由于醛键形成而被封闭的抗原决定簇（胃蛋白酶等）

3 免疫染色 标记抗体与标本中抗原反应形成复合物，洗去未结合成分，直接镜检。

对照试验（control）： Positive：已知抗原阳性的切片 Negative：不含已知抗原的切片 空白对照：排除组织自发荧光、内源性酶、生物素等

4 结果观察 染色 特异性染色 非特异性染色 显色部位 特定细胞或间质 细胞或间质均匀染 色或更强 4 结果观察 染色 特异性染色 非特异性染色 显色部位 特定细胞或间质 细胞或间质均匀染 色或更强 显色定位 特定，有结构性 无特定部位，无结 构性 显色程度 同一部位呈不同 无分布规律，某一片 程度显色 均匀着色

非特异性染色：非抗原抗体反应出现的阳性染色。 原因：非特异性蛋白吸附于高电荷的胶原或结缔组织上。 防止方法：采用与第二抗体相同来源的动物血清吸附封闭底物组织上的带电物质；2%牛或人白蛋白封闭。

                                                      免疫酶细胞化学技术

                                                       免疫组织化学染色

（二） EIHCT类型 1、酶标记抗体免疫组化技术 2、非标记抗体酶免疫组化技术 将酶通过交联剂结合在抗体（抗抗体）分子上，形成酶标记抗体（抗抗体），与标本中相应抗原或抗原抗体复合物反应后，再经酶对底物显色，对标本中抗原进行定性和定位。 2、非标记抗体酶免疫组化技术 用酶免疫动物制备抗酶抗体（Ab3），将酶与Ab3结合，然后用第二抗体（ Ab2）作桥， Ab2既可与Ab3 Fc段结合，又可与结合在组织抗原上的Ab1 Fc段结合。酶显色。

（1）直接法：■-Ag + Ab*E → ■-Ag-Ab*E 优点：简单、快速、特异 （2）间接法：■-Ag + Ab1 + Ab2*E → 1、酶标记抗体免疫组化技术类型： （1）直接法：■-Ag + Ab*E → ■-Ag-Ab*E 优点：简单、快速、特异 缺点：一种酶标抗体只能测一种抗原，敏感性较差 （2）间接法：■-Ag + Ab1 + Ab2*E → ■-Ag-Ab1-Ab2*E 优点：一种酶标抗体能测多种抗原，实用性敏感性较直接法好 缺点：敏感性低于非标记抗体酶法与三步法 （3）三步法：■-Ag + Ab1 + Ab2*E + Ab3*E → ■-Ag-Ab1-Ab2*E-Ab3*E 优点：敏感性高于上二 缺点：操作繁琐、费时

2、非标记抗体酶免疫组化技术类型： （1）酶桥法： ■-Ag +Ab1(兔源) +Ab2(羊抗兔)+ 抗-HRP(兔源) + HRP （2）PAP法：过氧化物酶（P）-抗过氧化物酶（AP），预先制成复合物 减少操作步骤 （3）双桥PAP法： ■-Ag-Ab1(兔源) -Ab2(羊抗兔)-PAP-Ab2(羊抗兔)-PAP 增加酶分子，提高敏感性 （4）APAAP法：用碱性磷酸酶代替过氧化物酶，建立的碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶法 既可Ag，也可查Ab。避免了酶标抗体的缺点。

3、酶免疫电镜技术（Immune electron microscopy，IEM） 用酶标抗体与组织或细胞抗原结合，显色后在电镜下观察。免疫反应特异性与电镜高分辨力结合。 亚细胞水平和超微结构，高精确度、高灵敏度

示踪物：电子致密物质。Singer (1959)首创此项技术，使用铁蛋白标记。 30多年来，经过许多学者的不断改进和发展，除铁蛋白外，主要有过氧化物酶和胶体金。 过氧化物酶分解DAB的产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，经过Os04处理后变黑，具有高电子密度，十分适合于电镜观察。而且HRP的分子量(40kDd)比铁蛋白(750kDa)将近小20倍，酶标抗体较易透过经适当处理后的组织细胞膜，能用于定位细胞内抗原。但酶反应产物的分辨率不如颗粒性标记物高(如铁蛋白，胶体金)。

检测方法：由标记抗体法，改进为应用双功能抗体法、搭桥法及PAP法等。 免疫电子显微镜技术

三、酶联免疫分析技术 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay （ELISA） 1971年瑞典学者Engvail和Perlmannn,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验。 简便、快速、敏感、特异、实验设备简单、应用范围广、无同位素污染

                                                                                                             酶联免疫井

（一）基本原理 酶联免疫吸附试验是一种固相免疫测定技术。 先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应 加入酶标抗体与免疫复合物结合，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分 最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析的方法。

（二）类 型 根据检测目的和操作步骤不同： 双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法 dot-ELISA BAS-ELISA

双抗体夹心法 此法常用于测定抗原，适用于多价大分子抗原的检测，而不能用于测定半抗原等小分子物质。

                                                       双抗体夹心法

间接法 此法是测定抗体最常用的方法。

此法也可用于测抗原。

                                                       间接法

竟争法 此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。

捕获法 此法用于血清中某种抗体亚型成分测定。以IgM测定为例： 样本 （IgM1、2） 抗人IgMμ链抗体 抗人IgMμ链抗体 IgM1 特异抗原（Ag1） 抗人IgMμ链抗体 IgM1 Ag1 Ab1*E 抗人IgMμ链抗体 IgM1 Ag1 抗人IgMμ链抗体 IgM2 Ab1*E 抗人IgMμ链抗体 IgM2

（三）技术要点 1 固相载体： 与Ab或Ag有较高结合容量，结合稳定；可结合AgAb及亲和素或链酶素等大分子蛋白；生物大分子固化后应保持活性，活性基团朝向反应溶液；固相化方法简便快速经济。 塑料：非共价或物理吸附。小试管、小珠、板条 微颗粒：化学耦联，结合容量大，均匀分散在液体中，反应快，可磁化，方便分离。 膜载体：硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜、尼龙膜，非共价结合，吸附力强

2 免疫吸附剂 指与固相载体结合的Ag或Ab。将Ag或Ab固相化的过程称包被（coating）。用1-5%牛血清白蛋白或5-20%小牛血清等结合包被后固相载体表面剩余的少量未吸附位点，为封闭（blocking）。 共价、非共价 PH、离子强度、温度、时间、浓度 一般用PH9.6的碳酸盐缓冲液，4℃过夜或37℃2-6h

3 包被抗原和酶标抗体最佳工作浓度 包被抗原 包被抗体 酶标抗体浓度

四、膜载体的酶免疫测定 Membranced-Based Enzyme Immunoassay 载体：微孔膜 标记物：酶、各种有色微粒子（彩色胶乳、胶体金、胶体硒等） 免疫渗滤试验：对穿流 免疫层析试验：对横流

（一）斑点-酶联免疫吸附试验（dot-ELISA ） 原理：似ELISA，但载体为硝酸纤维素（NC）膜。更灵敏、节约、简便，易保存 以检测抗体为例： Ag Ab1？ Ab2-E 底物

（二）斑点-酶免疫渗滤试验 Immunofiltration Assay，IFA 原理：以NC膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。以胶体金为标记物的金免疫渗滤试验省却了酶对底物的反应，更加简便快速。

以双抗体夹心法HCG为例：标本中HCG与NC膜上抗-HCG结合，再加胶体金标记的抗-HCG抗体，形成双抗体夹心复合物（红色）

（三）免疫层析试验 Immunochromatography Assay，ICA 原理：滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用向另一端移动，移动过程中待测物与固定于膜上某区域的抗原或抗体结合而被固相化，通过标记物染色。

如：尿HCG测定 结合物垫 吸水材料 样品垫 吸水材料

（四）免疫印迹技术 Immunoblotting Test，IBT 又称蛋白质印迹(Western blotting) 是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） + 蛋白转运 + 酶免疫技术 将含有目标蛋白(抗原)的样品→SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或非变性电泳(Native-PAGE)等分离→转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面→将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。

                                                       免疫印迹技术

五、生物素与亲和素系统酶联免疫吸附试验 Biotin-Avidin System ELISA（BAS-ELISA） 　　生物素-亲和素系统 (biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。 多级放大效应-灵敏 生物素与亲和素之间高度亲和力-特异 稳定 适用性强（与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合）

生物素(biotin，B) 生物素在机体内以辅酶形式参与各种羧化酶反应，故又称为辅酶R或维生素H。分子中有两个环状结构，其中I环为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要部位；II环为噻唑环，上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构。

亲和素 (avidin，A) 与生物素结合后稳定，亲合素由4个相同的亚基组成，能结合4个分子的生物素。亲合素与生物素之间的亲和力极强，二者能快速结合，且反应不受外界干扰，具有高度特异性和稳定性。

BAS-ELISA： （1）BA-ELISA ■-Ab+待测Ag+Biotin-Ab+Aidin*E+底物 （2）BAB-ELISA ■-Ab+待测Ag+Biotin-Ab+Aidin+Biotin*E+底物 （3）ABC-ELISA ■-Ab+待测Ag+Biotin-Ab+Aidin-Biotin*E+底物

发光免疫标记技术 Luminescence Immunoassay，LIA 发光免疫分析技术 　　新型超微量分析技术：发光分析+免疫反应。 自动化、快速、简便 发光分析的高灵敏性 抗原抗体反应的高度特异性

一、发光与化学发光剂 一种物质由电子激发态回复到基态，释放出的能量表现为光的发射。 光照发光：发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，回复到基态时发出波长较长的光。(荧光) 生物发光 化学发光

生物发光 　　生物发光是指发生在生物体内的发光现象，如荧火虫的发光。是发生在生物体内的一种化学发光。

化学发光 　　伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质在进行化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应产物分子激发到电子激发态。当电子从激发态回到基态时产生辐射，多余的能量以光子的形式释放出来，这一现象称为化学发光。

发光剂：发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物。 荧光素 化学发光剂 生物发光剂 化学发光标记物：化学发光剂与抗体或抗原结合在一起的复合物。

发光免疫分析的类型 　　根据发光免疫分析中发光反应的不同体系和标记物及标记方法的不同，大体上可分为以下三种类型： 　　化学发光免疫分析：以化学发光物质标记抗原或抗体，免疫反应后，直接引发化学发光反应进行检测。 　　化学发光酶免疫分析：用参与某些发光反应的酶来标记抗原或抗体。免疫反应后，加入发光试剂，测定发光体系的发光强度进行抗原或抗体测定。 　　生物发光免疫分析：利用生物发光物质或参与生物发光反应的辅助因子标记抗原或抗体。免疫反应后，运用生物发光反应进行检测。

                                                       发光免疫标记技术原理

胶体金标记技术 胶体金标记技术 (Immunogold labeling technique) 是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。

基本原理 　　胶体金是由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。利用它在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电吸引而形成牢固结合，除抗体蛋白外，胶体金还可与其他多种生物大分子结合。根据胶体金的一些物理特性，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物所具有的免疫-生物学特性，使其在免疫学、组织学、病理学及细胞生物学标记研究工作中得到广泛应用。

1971年Faulk和Taylor首创胶体金标记免疫电镜技术。 1978年，Geobegan等将胶体金标记抗体用于普通光镜下检测B淋巴细脑表面膜免疫球蛋白，建立了光镜水平的免疫金染色。 近年来，胶体金标记技术进一步发展应用于免疫转印、流式细胞术、液相免疫测定、固相斑点金／银染色及斑点金免疫渗滤测定法等多种标记免疫检测方法。

                                            胶体金标记技术

                                                      胶体金标记技术