生物芯片与高通量筛选

测试情况总结 本次平时测试结果作为平时成绩，检查同学听课质量，平均96分，总体效果良好。 存在问题：部分同学答题不够认真，掌握不够准确，特别第一和二部分必须准确，问答题必须内容充实。 大家建议：增加互动，放慢讲课速度，突出重点，内容丰富短时间难以消化吸收，参考文献和参考书推荐等。 应答：时间有限、教室条件差、人数太多（82人）、专业较多，考虑放慢速度、进行必要互动、加强交流。

主要内容 生物芯片 基因芯片（DNA芯片） 蛋白质芯片（Protein Chips） 细胞芯片 组织芯片 高通量筛选

生物芯片 生物芯片(biochip) 是指采用微量点样等方式,将核酸片段、多肽分子、组织切片和细胞等生物样品有序地固定于支持物(如玻片、硅片、尼龙膜等载体) 的表面,组成密集二维阵列,然后与已标记的待测生物样品中的靶分子进行杂交、或用免疫组织化学、原位杂交等技术使待检分子可视化,最后通过特定的仪器如激光共聚焦扫描仪或电荷偶联摄影像机(CCD) 对可视化信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析,从而判断样品中靶分子的相对数量。由于常用玻片/ 硅片作为固相支持物,且在制备过程模拟计算机芯片的制备技术,所以称之为生物芯片技术。

生物芯片 根据芯片上固定的生物物质的不同,生物芯片分为基因芯片( Genechip) 、蛋白质芯片(proteinchip) 、细胞芯片(cellchip) 、组织芯片(tissuechip) ;如芯片上固定的是寡核苷酸或DNA ,就称为基因芯片或DNA 微阵列(DMA Microarray) ;又如芯片上固定的是组织,就称为组织芯片。

基因芯片（Gene Chips） 定义：就是按特定的排列方式固定有大量基因探针/基因片段的硅片、玻片、塑料。 基因芯片技术是高效地大规划获取相关生物信息的重要手段。 应用领域: 主要有基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序。

基因芯片作用原理 采用高速打印或光刻合成技术可在硅片、玻璃或尼龙膜上制造DNA 微阵列即基因芯片； 样品DNA/RNA 通过PCR 扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子, 与微阵列杂交后通过荧光扫描仪器扫描及计算机分析即可获得样品中大量基因序列及表达的信息。

Flow chart of cDNA microarray

基因制备方法 分为两大类: 一类是原位合成; 一类是直接点样； 原位合成适用于寡核苷酸; 直接点样多用于大片段DNA , 有时也用于寡核苷酸, 甚至mRNA。 原位合成有两种途径。一是光刻法; 一是压电打印法。光刻法可以合成30n t 左右, 打印法可以合成40250n t, 光刻法每步缩合率较低, 一般说喷印法特异性应比光刻法高。此外, 喷印法不需特殊的合成试剂。 与原位合成法比较点样法较简单, 只需将预先制备好的寡核苷酸或cDNA 等样品通过自动点样装置点于经特殊处理的玻离片或其它材料上即可。

芯片的种类 电子芯片：带有阳电荷的硅芯片、芯片经热氧化, 制成1mm ×1mm 的阵列、每个阵列含多个微电极, 在每个电极上通过氧化硅沉积和蚀刻制备出样品池。将连接链亲和素的琼脂糖覆盖在电极上, 在电场作用下生物素标记的探针即可结合在特定电极上。 三维芯片： 三维生物芯片实质上是一块显微镜载玻片, 其上有10, 000 个聚乙烯酰胺凝胶条, 每个凝胶条可用于靶DNA , RNA 和蛋白质的分析。先把已知化合物加在凝胶条上, 再用3cm 长的微型玻璃毛细管将待测样品加到凝胶条上。每个毛细管能把小到012n l 的体积打到凝胶上。

基因芯片应用 基因表达谱分析 新基因发现 基因突变及多态性分析 基因组文库作图 疾病诊断和预测 药物筛选 基因测序

基因表达谱分析 基因芯片技术可清楚地直接快速地检测出以1: 300, 000 水平出现的mRNA , 且易于同时检测成千上万的基因。 Lockhart 等人对芯片技术定量检测基因表达及其敏感性、特异性进行了研究。在阵列的杂交实验中, 从克隆cDNA文库或直接从细胞mRNA 制备标记RNA 靶, 用于杂交的RNA 靶通过体外转录反应掺入荧光素标记的核糖核苷酸制备, 然后随机地将该RNA 靶裂解为平均50—100 个碱基大小的片段, 样品与阵列杂交30 分钟到22 小时, 阵列的荧光影像用特制的扫描共聚焦显微镜检测。

新基因发现 定量检测大量基因表达水平在阐述基因功能、探索疾病原因及机理、发现可能的诊断及治疗靶等方面是很有价值的。 如该技术在炎症性疾病类风湿性关节炎(RA ) 和炎症性肠病( IBD) 的基因表达研究中,由RAIBD 组织制备探针, 用Cy3 和Cy5 荧光素标记, 然后与靶cDNA 微阵列杂交, 可检测出炎症疾病诱导的基因如TNF－ 或粒细胞集落刺激因子, 同时发现一些以前未发现的基因如HME 基因和黑色素瘤生长刺激因子。

DNA序列分析 人类基因组计划的实施促进了更高效率的、能够自动化操作的测序方法的发展。芯片技术中杂交测序( SBH ) 技术及邻堆杂交(CSH) 技术一种新的高效快速测序方法。 用含65，536 个8聚寡核苷酸的微阵列, 采用SBH 技术, 可测定200bp 长DNA 序列, 采用67, 108, 864 个13 个聚寡核苷酸的微阵列, 可对数千个碱基长的DNA 测序。SBH 技术的效率随着微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加而提高, 但微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加则提高了微阵列的复杂性, 降低了杂交准确性。CSH 技术弥补了SBH 技术存在的弊端, CSH 技术的应用增加了微阵列中寡核苷酸的有效长度, 加强了序列准确性, 可进行较长的DNA 测序。

突变体和多态性的检测 SHB 技术可大规模地检测和分析DNA 的变异及多态性。 Guo 等人利用结合在玻璃支持物上的等位基因特异性寡核苷酸(A SO s) 微阵列建立了简单快速的基因多态性分析方法。将A SO s 共价固定于玻璃载片上, 采用PCR 扩增基因组DNA , 其一条引物用荧光素标记, 另一条引物用生物素标记, 分离两条互补的DNA 链, 将荧光素标记DNA 链与微阵列杂交, 通过荧光扫描检测杂交模式, 即可测定PCR 产物存在的多种多态性, 该方法对人的酪氨酸酶基因第4 个外显子内含有的5 个单碱基突变进行分析, 结果显示单碱基错配与完全匹配的杂交模式非常易于区别。这种方法可快速、定量地获得基因信息。

疾病诊断和预测 Cancer Array 肿瘤基因芯片 生长因子基因芯片 肿瘤转移基因芯片 染色体稳定和DNA修复基因芯片 生长因子基因芯片   肿瘤转移基因芯片 染色体稳定和DNA修复基因芯片 雄性激素信号通路与前列腺癌基因芯片 肿瘤信号转导基因芯片   肿瘤药物耐受和代谢基因芯片 血管生成基因芯片 乳腺癌和雌激素受体信号通路基因芯片 癌通路发现者基因芯片

基因芯片－状况 自从1996年美国Affymetrix公司成功地制作出世界上首批用于药物筛选和实验室试验用的生物芯片。 美国的Hyseq公司、Syntexi公司、Nanogen公司、Incyte公司及日本、欧洲各国都积极开展DNA 芯片研究工作；摩托罗拉、惠普、IBM等跨国公司也相继投以巨资开展芯片研究。 预计在今后五年内生物芯片销售可达200-300亿美元；据《财富》杂志预测(97.3)，在21世纪，生物芯片对人类的影响将可能超过微电子芯片。

基因芯片－状况 我国在生物芯片研究方面刚刚起步，98年10月，中科院将基因芯片列为“”九五”特别支持项目，利用中科院在微电子技术、生化技术、物理检测技术方面的优势，组织跨所、跨学科合作。 现在在微阵列芯片和基于MEBS的芯片方面有大的突破，在DNA芯片设计、基片修饰、探针固定、样品标记、杂交和检测等方面的技术都有较大的进展，已研制出肝癌基因差异表达芯片、乙肝病毒多态性检测芯片、多种恶性肿瘤病毒基因芯片等有一定实用意义的基因芯片和DNA芯片检测仪样机。

蛋白质芯片 蛋白质芯片技术是指把制备好的蛋白质样品固定于经化学修饰的玻片、硅片等载体上,蛋白质与载体表面结合,同时仍保留蛋白质的物化性质和生物活性。蛋白质芯片是高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术。 蛋白质芯片主要分两种: 1）一种类似于ＤＮＡ芯片,即在固相支持物表面高密度排列的探针蛋白点阵,可特异地捕获样品中的靶蛋白,然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析。 2）另一种就是微型化的凝胶电泳板。在电场作用下,样品中的蛋白质通过芯片上的孔道分离开来,经喷雾直接进入质谱仪中进行检测,以确定样品中蛋白质的分子量及种类。

抗体蛋白质芯片原理

原理 蛋白质芯片是将已知蛋白点印在固定于不同种类支持介质上,制成由高密度的蛋白质或多肽分子的微阵列组成蛋白微阵列,其中每个分子的位置及序列为已知,并将待测蛋白质与该芯片进行孵育反应,再将荧光标记的蛋白质与芯片 蛋白质复合物反应,当荧光标记的靶分子与芯片上的分子结合后,可通过激光扫描系统或电荷偶联照像系统(ＣＣＤ）, 对荧光信号的强度进行检测,进一步对杂交结果进行量化分析,检测蛋白质的存在情况。

蛋白质芯片应用

蛋白质芯片应用 疾病诊断和疗效判定 研究蛋白质的相互作用 发现药物或毒物作用靶位和作用机制

发展 日开发出廉价蛋白质芯片 ：开发成功可迅速检测癌症等疾病的廉价蛋白质芯片。把目前数十万日元一个的蛋白质芯片价格降到了仅为几千日元。预计这种芯片在4年内可以使用。 光学蛋白质芯片是一种基于椭圆偏振光原理，利用抗原和抗体以及受体与配体特异性的结合，将分子间的相互作用转换为可直接读取的灰度值，对检测样品进行定量检测的方法。它由于无须对探针分子进行标记，因此有利于对蛋白质进行活性分析。应用后冠心病检测加速。

发展 中国科学家研制的丙型肝炎蛋白质芯片获国家药监局颁发的生物制品一类新药证书。这不仅是我国的第一个获新药证书的硅基材料蛋白质芯片，也是迄今为止世界上惟一得到政府药品监督管理机构颁发新药证书的蛋白质芯片。 两英寸大小的蛋白质芯片已由深圳益生堂生物企业有限公司投产。只需要２微升（一滴血的十分之一）血清或血浆，１小时后就能检测出结果。而每次的检测费用只有１００元左右。

细胞芯片 新型的细胞芯片, 其原理是应用细胞膜表面不同的抗原物质, 与结合在玻片上的不同抗体发生特异性结合, 通过自动捕获能力将所获细胞固定在特定区域, 以此对淋巴瘤细胞进行诊断和分类。 细胞芯片的制作: 每种抗体与pH10－12 的Tris2HCl 缓冲液等体积稀释, 通过生物芯片点样仪自动点样, 将8 种抗体分别点在醛基玻片上的各自区域, 每一抗体点4 个点, 直径约2mm 左右, 形成4 ×8 微阵列。点样后迅速将玻片置于湿盒中,4 ℃冰箱水化, 过夜。

细胞芯片应用 疾病诊断 胸腔液中淋巴瘤细胞检测

发展 最近出现了一种细胞微阵列芯片，他是将不同的质粒DNA点在玻璃片上做成质粒DNA芯片，接着在脂质转染试剂处理好的芯片上培养细胞，被转染的细胞因此获得了外源DNA赋予的新性状，因此也称为反向转染(reverse transfection). 这种技术不但可以用于 cDNA、融合肽或RNA分子的分析，而且还可以用于研究一些细胞因子、化学抑制剂或放射性标记对基因表达的影响.

组织芯片 Kononen 等(1998) 年在《自然》杂志上首次报道了组织芯片这一高通量的技术。 组织芯片技术可以将数十个甚至上千个不同个体的临床组织标本按预先设计的顺序排列在一张玻片进行分析研究，是一种高通量、多样本的分析工具。它使科研人员第一次有可能同时对几百甚至上千种正常或疾病以及疾病发展不同阶段的自然病理生理状态下的组织样本，进行某一个或多个特定的基因，或与其相关的表达产物的研究。

应用 如Kononen等使用标准免疫组化方法利用组织芯片技术研究了645例各种乳腺癌组织标本，试验数据与传统病理切片相应研究结果完全一致；同时他们还发现有关p53等6种基因的检测结果表明，新鲜与石蜡包埋的组织标本的检测结果没有差异。 Hedenfalk等结合组织芯片技术和基因芯片技术检测了原发性乳腺癌及组织标本。 Hoos等用组织芯片技术对59例成纤维细胞瘤进行免疫表型分析。Mucci等用组织芯片证实了神经内分泌因素与前列腺癌进展的关系。

高通量筛选（High Throughput Screen， HTS）

新药发现

细胞分析平台HTS

HTS 90年代初期,一个实验室采用传统的方法,借助20余种药物作用靶位,一年内仅能筛选75000个样品;到了1997年HTS发展的初期,采用100余种靶位,每年可筛选1000000个样品;而到1999年,由于HTS的进一步完善,每天的筛选量就高达100000种化合物[2],因而,称之为超高通量筛选(ultrahigh-throughput screening)。这种新的飞跃,将大大加速新药发现的速度。

HTS 高通量药物筛选技术是20世纪80年代后期发展起来的一种用于寻找新药的高新技术,由于该技术的快速、高效等特点,受到国际药物研究机构的极大重视。 高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的新的技术体系,它以分子水平和细胞水平的实验方法为基础,以微板形式作为实验工具载体,以自动化操作系统执行实验过程,以灵敏快速的检测仪器采集实验数据,以计算机对实验获得的数据进行分析处理,在同一时间内对数以千、万计的样品进行检测,并以相应的数据库支持整个技术体系的正常运转。

HTS原理 高通量筛选分析通常在96孔板上进行,采用自动化技术对流体进行分配并对微孔板进行处理,化合物、药物活性的检测在微孔板中进行,这种分析模式至今仍被广泛采用,但许多研究机构已转向384孔板或孔数更高、体积更小的分析模式。 现今,国外许多制药公司已把高通量筛选作为发现先导化合物的主要手段。典型的高通量筛选模式为每次筛选1000个化合物；而超高通量筛选可每天筛选10万多个化合物。随着分析容量的增大,分析检测技术、液体处理及自动化,还有连续流动以及信息处理已成为制约高通量筛选发展的瓶颈。因此,为减少成本和降低操作费用,高通量筛选须向自动化、分析微量化方向发展。

HTS的样品 采用HTS进行筛选的样品主要有组合化学库、天然化合物、化学合成化合物、反义核酸、肽核酸、可溶性蛋白等。 目前已将生物芯片技术用于HTS药物筛选研究,如正在改进Caliper′s显微流态芯片以用于HTS。

HTS筛选模型 高通量药物筛选模型可以根据其生物学特点分为以下几类：①受体结合分析法。②酶活性测定法。③细胞因子测定法。④细胞活性测定法。⑤代谢物质测定法。⑥基因产物测定法等等。

FMAT 8100 HTS荧光高通量筛选系统（美国AB公司） FMAT8100系统是全世界第一台全自动Macro-Confocal共聚焦式高通量荧光筛选系统,她由Appliedbiosystems公司和Becton Dickinson(BD公司)共同合作研制. 它具有样品量大（最多60块96孔或384孔/板）；筛选速度快（75000样品/天）；操作简便、无需进行放射性标记等特点. 待测样品与荧光分析试剂自动混合后直接分析荧光强度,不必洗脱,并可自动机械传送样品板,对每一样品孔进行准确的定量检测.

基于亲近闪烁检测(SPA)的HTS 基于亲近闪烁检测(Scintillation Proximity Assay，SPA)方法的高通量药物筛选技术平台由国家新药筛选中心在国内建立； 上世纪90年代由葛兰素史克等跨国制药公司首先开发应用，具有特异性强、灵敏度高、成本低廉和操作简便等优点，非常适合于自动化的药物高通量筛选； 利用SPA技术对数十个定向合成化合物进行过氧化物增殖子活化受体g(PPARg)结合力的测定中，发现了几个具有良好生物活性的“苗头”化合物，为创新药物的研究开发提供了方向。

SPA原理 亲近闪烁检测法(Scintillation Proximity Assay，SPA)：该技术使用能激发产生冷光的特制平板或圆球微粒，其底部或外层包被有连接分子，能高容量地结合药物靶位(如受体、酶等生物活性分子)，后者与同位素标记的配体特异性结合，在近距离释放射线能量激发产生冷光，继而被探测器所监测；不能特异性结合的小分子，其标记同位素所发出的射线能量大部分被水溶液散射，而不足以激发产生冷光。这一方法在实验过程中无需分离步骤，可连续观测，适用于自动化操作和高通量药物筛选。

第十二讲 走进21世纪的我国新药研究与开发