《现代生物技术》 第二章 基因工程 王旻 中国药科大学 生命科学与技术学院

参考书 1、基因工程原理 吴乃虎 科学出版社 第二版 1998 2、分子克隆实验指南 第二版 J.萨姆布鲁克等 科学出版社 1992 3、现代生物技术导论 瞿礼嘉等 高等教育出版社 1998 4、现代生物技术概论 何忠效等 北京师范大学出版社 5、生物制药技术 王旻等 化学工业出版社 2003 6、基因工程 楼士林等 科学出版社 2002 7、生物技术与生物药物 王旻等译 化学工业出版社 2006

第一节 基因工程的发展历史和基本概念 一、基因工程的发展历史

基因工程发展史有关的重要事件 年份 重要事件 1869 1944 1953 1958 1961 1965 1966 1967 1970 1972~1973 1974 1975~1977 1982 1985 1997 2000 F.Miescher首次从鲑鱼精子中分离到DNA O.T.Avery等人在肺炎链球菌转化实验中发现遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质 J.D.Watson和H.C.Creck提出了DNA分子结构的双螺旋模型 M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA半保留复制模型 M.W.Nirenberg等人应用合成的mRNA分子[poly(U)]破译出了第一批遗传密码 F.Jacob和J.Monod提出了调节基因表达的操纵子模型 证明细菌的抗药性通常有一类叫”质粒”的额外染色体携带 M.W.Nirenberg,S.Ochoa,H.G.Khorana共同破译了全部的遗传密码 发现了可将DNA连接起来的DNA连接酶 H.O.Smith等分离到第一种核酸内切限制酶,它可以在特定位点将DNA分子切割开来 以H.Boyer,P.Berg等人为代表的一批美国科学家发展了重组DNA技术,并于己于1972年得到第一个重组的DNA分子,1973年完成第一个细菌基因的克隆 首次实现了异源真核生物基因在大肠杆菌中的表达 F.Sanger及A.Maxam和W.Gilbert发明了快速的DNA序列测定技术.1977年第一个全长5387bp的嗜菌体φX174基因组测定完成 第一个基因工程药物-胰岛素在美国和英国获准使用 第一批转基因家畜(兔,猪和羊)诞生 多莉羊诞生 人类基因组草图绘制完成

基因工程历史中的三个重要事件 1、1972年，美国斯坦福大学的P. Berg博士率先完成了DNA体外重组试验。（分享1982年诺贝尔化学奖） SV40DNA+λ嗜菌体DNA EcoR1 T4DNA连接酶 重组DNA

2、具有性状功能的基因能否重组？ 1973年，美国斯坦福大学的S.Cohen等人成功地进行了另一个体外DNA重组试验。 R6-5 +pSC101 EcoR1 T4DNA连接酶 重组DNA转入大肠杆菌重组菌 Kanr Tetr Kanr + Tetr

3、不同物种、尤其是真核基因能否在原核生物中重组与表达？ 1974年，S.Cohen与H.Boyer合作进行了如下试验，结果表明：动物基因的确进入到大肠杆菌细胞，并转录出相应的RNA.

以上试验的重要意义有三点： 1、说明像pSC101这样的质粒分子是可以作为基因克隆的载体，能够将外源DNA分子导入宿主细胞。 2、说明像非洲爪蟾这样真核动物的基因是可以被成功地转移到原核细胞重并实现其功能表达。 3、说明了质粒-大肠杆菌不失为一种成功的基因克隆体系，可以作为基因克隆的模式系统进行深入研究。

二、基本概念 定义：基因工程是指按照人们的意愿，在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之转入到原先没有这类分子的宿主细胞内，形成能持续稳定繁殖的新物种。其目的是为人类提供有用产品及服务。

三、主要步骤与内容： 1、获得目的基因 2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能自我复制并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。 3、将重组DNA分子转移到适当的宿主细胞中，并与之一起增殖。 4、从大量细胞繁殖群体中，筛选出获得重组DNA分子的宿主细胞克隆。 5、从这些筛选出来的宿主细胞克隆中，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究用。 6、将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。

定义：凡在基因工程中应用的酶统称为工具酶。 第二节 基因工程的工具酶 定义：凡在基因工程中应用的酶统称为工具酶。

一、限制酶 (restrict enzymes) （一）限制与修饰现象 大多数的细菌对于噬菌体的感染都存在一些功能性障碍，即所谓的寄主控制的限制(restriction)和修饰(modification)现象，简称R/M体系。 作用：一是保护自身的DNA不受限制，而是破坏外源DNA使之迅速降解。

定义：凡在识别并切割双螺旋DNA分子内特定核苷酸顺序的酶统称为限制酶。 （二）限制酶的命名和分类 定义：凡在识别并切割双螺旋DNA分子内特定核苷酸顺序的酶统称为限制酶。 （1）限制酶命名：

（2）限制酶分类： 根据酶的性质，可分为三类

（三）第Ⅱ型限制酶的作用性质 1、基本特性： （1）识别位点为4~8个核苷酸序列； （2）识别位点即为切割位点； （3）位点上核苷酸顺序通常呈双重旋转对称结构，即呈回文结构。 EcoR I的切割位点 EcoR I的识别序列 5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’

切割方式通常有三种： ①在识别顺序两条链对称轴上同时切断磷酸二酯键，形成齐平末端。如HaeⅢ， PvuII。 ②在识别顺序两条链对称轴上两侧同时从5‘ 端切断磷酸二酯键，形成5‘ 磷酰基端2~5个核苷酸单链粘性末端。如EcoRⅠ。 ③在识别顺序两条链对称轴上两侧同时从3‘ 端切断磷酸二酯键，形成3‘羟基端2~5个核苷酸单链粘性末端。入PstⅠ。

PvuII等产生的平头末端 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’ PvuII 37 ℃ 5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’

5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ EcoRI等产生的5‘粘性末端 5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’ EcoRI 37 ℃ 5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P Ho-G-C-T-C … 5’ 退火 4-7 ℃ OH P 5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’ P OH

5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ PstI等产生的3‘粘性末端 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ PstI 37 ℃ 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ 退火 4-7 ℃ OH P 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ P OH

2、同裂酶 识别顺序与切割方式均相同者，为之同裂酶。 例如HpaII和MspI识别顺序都是CCGG,切割方式亦相同。 …C CGG… …GGC C…

3、同尾酶 它是与同裂酶对应的一类限制酶，它们虽来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶。 例如BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶。他们切割后都形成GATC4个核苷酸组成的粘性末端。 BamHI … GGATCC … … CCTAGG … BclI … TGATCA … … ACTAGT …

显然，由同尾酶所产生DNA片断，是能够通过其粘性末段之间的互补作用而彼此连接起来。因此，在基因克隆实验中很有用处。有一对同尾酶分别产生的粘性末端结合形成的位点，称之为“杂种位点”。必须指出，这类杂种位点的结构，一般是不能够在被原来任何一种同尾酶所识别和切割的。

同尾酶生产的粘性末端的连接 退火 5' TGATCA ACTAGT 5' GGATCC CCTAGG BamHI BclI 5' T T4-DNA ligase 5' TGATCC ACTAGG GGATCA CCTAGT 5' 5' TGATCC ACTAGG GGATCA CCTAGT 5'

二、DNA连接酶（ligase）及DNA分子体外连接 （一） DNA连接酶和T4DNA连接酶 1976年发现，广泛存在于细胞内。目前应用的多数来自于大肠杆菌，称为E.coliDNA连接酶。分子量74000dal,辅因子NAD+,其作用是封闭双螺旋骨架上具有5‘-磷酰基和3’-羟基的缺口，形成磷酸二酯键。 nick OH P 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ nick P OH DNA连接酶 （T4DNA连接酶） 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’

修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶来自于T4噬菌体感染的E.coli，为T4噬菌体自身的表达产物。分子量6.8万dal，辅因子位ATP，该酶既能连接粘性末端，亦能连接齐平末端。 修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键 5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C … 5’ nick P OH T4-DNA连接酶 5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C … 5’

连接多个平头双链DNA分子： 5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’ T4-DNA连接酶 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’

（二）粘性末端DNA片段的连接（连接酶的作用） 用DNA连接酶，可催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组分子。 具体做法是，在体外将具有粘性末端的DNA限制片断，插入到适当载体分子上，再用DNA连接酶连接，从而可以按照人们的意图构建出新的DNA杂种分子。

同种内切酶生产的粘性末端的连接 退火 5' GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 5' EcoRI 5' G T4-DNA ligase 5' GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 5' 5' GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 5'

用粘性末端构建重组体DNA的最主要缺点： 1、无法控制外源基因的插入方向； 2、由限制酶产生的具有粘性末端的载体DNA分子，在连接反应混合物中会发生自我环化作用，经连接酶作用，形成共价闭环的稳定环形结构。克服该缺点的方法是，用碱性磷酸酶预先处理线性的载体DNA分子，以移去末端的5‘磷酸基团，于是在连接反应中，它自身的两个末端之间就再也不能被连接酶共价连接起来了。

（三）平末端DNA片段的连接 1、同聚物加尾法 是由美国斯坦福大学的P.Labban和D.Kaiser1972年发展起来的，可以连接任何两段DNA分子的普遍性方法。 原理：利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)转移核苷酸的特殊功能，将同种核苷酸（dNTP)加到DNA分子单链延伸末端的3‘-OH上。如果在目的基因两侧加polydA，则在载体两侧加polydT。长度一般10~40个残基。 缺点：插入的片段难以回收。无法控制外源基因插入方向。

人工粘性末端的连接 平头末端 GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG 人工粘性末端的连接 平头末端 5' G 3' C G C 3' C 3'G 3' C G 5' TdT dTTP TdT dATP GTTTTTTTTTT 3' C G CAAAAAAAAAA 3' C 3' TTTTTTTTTTG 3' AAAAAAAAAAC G 退火 T4-DNA ligase 5' GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG 5' 5' GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG 5' 加热 S1 GT CA T TG A AAAA AC CA GT A AC T TTTT TG TG AC CA GT

人工粘性末端的连接 3‘突出末端 GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C 人工粘性末端的连接 3‘突出末端 Sph I 5' GCATG 3' C G CTGCA 3' 3' GTACG Pst I C 5' 3' ACGTC G TdT dCTP TdT dGTP GCATGCCCCCC 3' C G CTGCAGGGGGG 3' C 3' CCCCCCGTACG 3' GGGGGGACGTC G 退火 5' GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG 5' 5' GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG 5' Klenow T4-DNA ligase Pst I Pst I 5' GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG 5' 5' GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG 5'

人工粘性末端的连接 5‘突出末端 GAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGG GGATCCCCCCCAATTC 人工粘性末端的连接 5‘突出末端 EcoR I BamH I 5' G CTTAA 5' 5' AATTC 5' GATCC G G G 5' CCTAG 5' Klenow 补平 Klenow 补平 5' GAATT 5' AATTC 5' GATCC GGATC CTTAA 5' TTAAG CTAGG CCTAG 5' 5' TdT dGTP TdT dCTP GAATTGGGGGG AATTC GATCC GGATCCCCCCC CTTAA GGGGGGTTAAG CCCCCCCTAGG CCTAG 退火 T4-DNA ligase BamH I BamH I 5' GAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGG GGATCCCCCCCAATTC CCTAGGGGGGGTTAAG 5' 5' GAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGG GGATCCCCCCCAATTC CCTAGGGGGGGTTAAG 5'

2、衔接物（linker)连接法 所谓衔接物是指用化学方法合成的一段由10~12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸段片断。 将衔接物的5‘末段和待克隆的DNA片段的5’末端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后通过T4DNA连接酶的作用是两者连接起来，接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和载体分子，由此使两者都产生出彼此互补的粘性末端。 优点：克隆后还可回收原插入片断。

补平 GGAATTCC CCTTAAGG GGATCGGAATTCC CCTAGCCTTAAGG Klenow T4-DNA ligase 5' GGATCC CCTAGG 5' BamHI 5' G 5' GATCC CCTAG 5' G 5' Klenow 补平 5' GGATC 5' GATCC CCTAG 5' CTAGG 5' T4-DNA ligase GGAATTCC EcoR I linker CCTTAAGG EcoR I EcoR I GGATCGGAATTCC GGAATTCCGATCC 5' CCTTAAGGCTAGG CCTAGCCTTAAGG 5'

DNA衔接物连接法尽管有诸多优点，但明显的缺点是，如果待克隆的DNA片段或基因的内部也含有与所加的衔接物相同的限制位点，这样在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把所克隆的基因切成不同的片段，从而对后继的亚克隆及其他操作造成麻烦。

3、DNA接头(adaptor)连接法 DNA接头是由美国康奈尔大学吴瑞博士于1977年发明的，它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接后，便会使后者成为具有粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。 问题：各个DNA接头分子的粘性末端之间，会通过互补碱基间的配对作用，形成如同DNA衔接物一样的二聚体分子，失去接头的本来意义。克服的方法是将5‘末端的磷酸修饰移去，其结果为暴露出的5’-OH所取代。如此一来，虽然两个接头分子粘性末端之间仍具有互补碱基配对的能力，但终因DNA连接酶无法在5‘-OH和3’ –OH之间形成磷酸二酯键而不会产生出稳定的二聚体分子。

能将目的基因携带至宿主细胞并可在其中自主复制的遗传因子谓之为基因工程载体 第三节 基因工程载体（vector） 能将目的基因携带至宿主细胞并可在其中自主复制的遗传因子谓之为基因工程载体

相关概念 有用基因亦称为目的基因或插入物 用于接受重组DNA的扩增载体及其插入物或表达目的基因的受体细胞谓之宿主 插入物的扩增过程称为分子克隆 携带重组DNA分子的宿主为基因工程细胞（菌）或重组细胞（菌）

基因工程载体的必备条件 1、具有有效运载能力 2、携带外源性目的基因前后在宿主内功能自主复制 3、在宿主内能控制外源基因表达活动 4、坚定方便，装卸手续简单 5、能携带大小不同的外源性目的基因、载体分子量要小, 载力要大 6、容易控制、安全可靠、稳定性好

三大类基因工程载体 细菌质粒 病 毒DNA 基因真核表达 植物表达（烟草花叶病毒） 动物表达（腺病毒） 噬菌体DNA

一、细菌质粒 ㈠、质粒的生物学性质 细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的 自主复制的遗传物质。 绝大多数的质粒都是由环形双链DNA组成的复制子。 （现发现有线性质粒，酵母的杀伤质粒是一种RNA质粒）

环形双链质粒分子具有三种不同构型 1、共价闭合环形DNA（SCDNA）：两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构; 2、开环DNA（OCDNA）：两条链中只有一条保持完整环形结构，另一条链出现一至数个缺口; 3、线性分子DNA（LDNA）通称L构型：质粒DNA经过适当的核酸内切酶切割后，发生双链断裂而形成; 以上三种不同的构型的同一种质粒，尽管分子量相同，但在琼脂糖凝胶电泳中，电泳迁移率不同，顺序是SCDNA、LDNA、OCDNA

质粒的生物学性质 ①分子量小，差异显著，小的分子量为106dal,大的可达108dal。 ②易于在宿主间转移和迁移。 ③在宿主内可伴随宿主染色体复制而复制，与宿主呈共生关系。 ④且其存在与否与宿主生死无关。 ⑤编码宿主染色体不具有的基因，赋予宿主细胞额外遗传特性 （如抗生素抗性）

㈡、质粒的分类 迄今为止，人们已在大肠杆菌的各种菌株中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了较详尽研究，了解比较透彻的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。由于这些质粒的存在，寄主细胞便获得了各自不同的性状特征，我们可以依据这些特征来鉴别这三种不同类型的质粒。

1、F质粒 又叫F因子(fertility factor)或性质粒(sex plasmid), 转移到原先不存在该质粒的受体胞中去而得名。 是在某些大肠杆菌细胞中发现的一种具有代表性的单 拷贝的接合型质粒，其大小约为 94kb左右，总共编码 19个转移基因（tra)。

在寄主中，F质粒有三种不同的存在方式 1、以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，其上不带有 任何来自寄主染色体的基因或DNA区段。这样的细胞 样的细胞叫做Hfr(High frequential recomhimant) 高频重组细胞

2、R质粒 通称抗药性因子。 在其结构中编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能 够将此种抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者 也获得同样的抗菌素抗性能力。

3、Col质粒 即所谓产生大肠杆菌素因子。 它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。

革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其他成员

F因子属接合型质粒，而Col质粒和R质粒中，既有 属于接合型的，也有属于非接合型的。 从基因工程的角度考虑，感兴趣的主要是非接合型 质粒，这是因为接合型的质粒不仅能够自我从一个 细胞转移到另一细胞，而是还能够转移染色体记号。 因此，如果使用接合型质粒作载体，在理论上存在 着发生使DNA跨越生物种间遗传屏障的潜在危险性。

㈢、重要的质粒载体 目前常用于基因克隆的质粒载体均为人工构建。 经改造后达到这些要求： ①其分子结构中必须具有多个单一限制酶切割位点，且切点最好位于选择性标记上 ②构建重组质粒后必须具有转化功能 ③最好带有两个以上强选择性标记 ④分子量较小，为松弛型复制控制，易于操作 ⑤宿主范围小，无感染性，不受其他质粒诱动。

Col E1质粒属大肠杆菌Col类质粒中的一种，由于携 细菌素是一类特殊蛋白质，它通过同敏感细胞细胞壁的融合作用，而抑制一种或数种在细胞内进行的生命过程，如DNA复制、转录、翻译以及能量代谢等，从而使这些细胞停止生长。

总结： ①分子量4.2×106dal，携带Col质粒的许多菌能产生细菌素 ② Col E1 编码大肠杆菌素E1基因和大肠杆菌素E1 免疫基因。有单一EcoRⅠ切点，切开接入外源 基因后，虽失去大肠杆菌素E1能力，但却不影 响DNA复制能力 ③属松弛型复制，多拷贝，拷贝数可大1000-3000

pSC101是一种严紧型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌 质粒载体，平均每个寄主细胞仅有1-2个拷贝。 其分子大小为9.09kb，编码一个四环素极性基因(tetr), 该质粒对EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ、XhoⅠ、 PvuⅡ和SmaⅠ等7种限制酶有单一识别位点。 其中HindⅢ、 BamHⅠ和SalⅠ等3个位点克隆外源DNA 都会使tetr失活。（插入失活效应）

pSC101质粒载体性质： ①严紧型复制控制 低拷贝 1-2个拷贝/细胞 ②9.09kb ①严紧型复制控制 低拷贝 1-2个拷贝/细胞 ②9.09kb ③编码一个tetr， 有EcoRⅠ、 HindⅢ、BamHⅠ等7个 酶切单一位点，可插入失活。 非洲爪蟾核糖体基因即是用该质粒克隆 缺点：低拷贝，表达效率低。

pSC101是第一个成为用于克隆真核DNA的大肠杆菌 质粒载体，1973年成功地将带有非洲爪蟾核糖体基 因的EcoRI DNA片段，连接到pSC101复制子上。

应用pSC101质粒载体在大肠杆菌细胞中克隆非洲爪蟾的基因

3、pBR322 是一种人工构建的重要质粒 ②具有低分子量，高拷贝 ③外源DNA插入不影响复制功能 ④有多种核酸内切限制酶单切割位点 特点：①带有多种抗药性的强选择记号 ②具有低分子量，高拷贝 ③外源DNA插入不影响复制功能 ④有多种核酸内切限制酶单切割位点 命名: p：表示质粒 BR:分别取自两位主要构建者F.Bolioax 和R.L.Rodrignez姓氏的头一个字母 322:指实验室编号

pBR322质粒构建过程：

普通型载体pBR322的结构图

pBR322质粒载体的优点 ①自身分子量小 4363bp ②同时具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号 ③具有较高的拷贝数

pBR322由三个不同的部分组成 1、来源于pSF2124质粒易位子Tn3的ampr 2、来源于pSC101质粒的tetr 3、来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点

4、pUC质粒载体 pUC质粒是在pBR322载体质粒的基础上，组入了一个在其5‘端带有一段多克隆位点的lacZ’基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。 pUC取名是根据它们的加州大学(University of California)的科学家J.Messing和J.Vieria于1987年首先构建的

(1)pUC质粒载体的结构 pUC系列质粒载体包括以下四个组成部分： ①来自pBR322质粒的复制起点ori）； ②氨苄青霉素抗性基因Ampr，但它的DNA中核苷酸序列已发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的识别位点； ③大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及编码α-肽链的DNA序列，此结构称为lacZ`基因； ④位于lacZ’基因中的靠近5`端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能。

pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’ 的显色原理 Plac MCS pUC18/19 b a b-半乳糖苷酶的a-肽段 5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷 5-溴-4-氯靛蓝（蓝色） X-gal

476bp片段含有E.coli的lacZ基因的 5’-序列，表达半乳糖苷酶的α片段。 LacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O。 lacZ之内有M13的多功能连接器——多克隆位点（MCS）。

(2)pUC质粒载体的优点 ①具有更小的分子量(2686bp)和更高的拷贝数(500～700) ②适用于组织化学方法检测重组体 ③具有多克隆位点MCS区段，可以更方便的插入外源基因

二、噬菌体载体和柯斯载体(cosmid) 及单链DNA噬菌体载体(M13) 1、λ噬菌体的结构和性质 λ噬菌体为双链DNA病毒，宿主为E.Coli。在宿主内有溶菌和溶源两种形式，在溶源方式中，噬菌体感染宿主后其DNA整合到宿主染色体DNA中，伴随宿主染色体复制而复制。

λ噬菌体DNA是有48502bp组成的线性双螺旋分子，分子量3.1×107dal。 迄今已定位的基因至少61个，其中一半参与了噬菌体生命周期的活动，我们称这类基因为λ噬菌体的“必要基因 ”；另一部分基因，当它们被外源基因取代后，并不影响噬菌体的生命功能，我们称这类基因为λ噬菌体的“非必要基因”。这为其作为基因工程噬菌体的基础。

野生型的λ噬菌体DNA两端各具12个核苷酸组成的粘性末端，可用来构建柯斯质粒（cosmid）。

l 噬菌体生物学特性： 生物结构 cos l - DNA 溶菌控制基因 头部合成基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因 阻遏基因 早期控制基因 尾部合成基因 阻遏基因 重组基因 删除与整合基因 CCCGCCGCTGGA 5’ COS 3’ 3’ COS 5’ TCCAGCGGCGGGG

2、 λ噬菌体DNA克隆载体 野生型的λDNA不适宜作为克隆载体。因为⑴其分子量较大，⑵常用的限制酶切点较多。如EcoRI切点5个，HindⅢ切点7个，而这些切点大多位于溶菌周期生长所必须基因内，容纳不下比其更大的外源性DNA片段，必须对其进行改造。

改造方法： ①将噬菌体感染到具有EcoR I限制修饰体系的和不具有EcoR I 限制修饰体系的两种寄主细胞中循环生长，使λDNA 的EcoR I 位点发生修饰作用或产生点突变，使其一些EcoR I 位点不能再被EcoR I 切割。最终筛选获得仅有1-2个限制酶位点的λDNA。 ②将λDNA在体外用限制酶消化，再将未切割部分包装并感E.Coli。如野生型λDNA 上有7个HindⅢ限制位点，从图中可看出，E.Coli位点1 和2之间片段的缺失，可降去两个HindⅢ位点1和2。

按此上方法，可构建两类λ噬菌体派生载体 ①取代型载体或替换型载体（replacement vector） 它具有成对的克隆位点，这两个位点之间的λDNA 区段可以被外源插入的DNA片段所取代。如λEMBL4 和Charon40。 (图5-12)

②插入型载体（insertion vectors） 只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点（也有一些具有两个插入位点）。外源性DNA克隆到插入型的λ载体分子上会使噬菌体的某中生物功能丧失，即所谓插入失活效应。如免疫功能失活的和大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活的两种亚型。

凯伦噬菌体载体（Charon bacteriophage） 我们把这些经过改造的噬菌体载体称为： 凯伦噬菌体载体（Charon bacteriophage） 凯伦噬菌体是F.R.Blattner等人于1977年在λ噬菌体基础上发展出来的一种特殊的噬菌体载体。凯伦是古希腊神话中的一位老摆渡工，专司运送亡灵到阴间。 这类载体有插入型的如Charon2,亦有替换型的如Charon30。 他们在基因工程实验中用途十分广泛。

许多Charon载体带有编码β-半乳糖苷酶基因以及它的操控基因和启动子的lac 5取代区段，如Charon 4噬菌体可以在Xgal琼脂培养基上产生出深蓝色的噬菌斑。而当含有lac 5的EcoRI片段被外源DNA取代后，所形成的重组噬菌体就只能产生出无色的噬菌斑，可以很方便的进行重组体筛选。（图5-13）

载体遗传标记检测 显色筛选法的基本操作： 显色筛选法 lacZ' 将外源基因克隆在Charon噬菌体载体的lacZ’标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，清亮噬菌斑；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色噬菌斑 ori Ap r Ap + X-gal 重组子（Apr + lacZ-）

3、λDNA载体重组分子的体外包装 以λ噬菌体DNA为载体构成的重组DNA分子必须 包装成完整病毒颗粒后才具有感染宿主的能力。

λ噬菌体的正常包装过程 1、先按滚环复制合成多连体的DNA， 2、这些DNA 在具备噬菌体头部前体和A基因产物的条件下，从cos为点处被切割成λDNA 单体分子，并被很快装填到头部外壳里边， 3、它具有的12bp长的粘性末端，又会重新环化起来， 4、基因产物便渗入到完整的头部，接着通过基因W和基因F II产物的作用，把头部与尾部结构连成一体，最终形成成熟的λ噬菌体颗粒。

体外包装过程 利用两个琥珀突变种噬菌体，一个是Dam λ噬菌体，产生头部蛋白。另一个是λ噬菌体Eam突变体产生尾部蛋白。上述溶菌物与重组DNA混合后，基因E产物（主要为外壳蛋白）在基因A产物作用下，与基因D产物一起将重组DNA包装成噬菌体头部，在基因W及基因F产物作用下，将头部和尾部连接成完整噬菌体颗粒。

特点： 经包装后重组DNA分子转化率提高100-1000倍。 这类载体可以有效克隆15kb大小的外源基因。

(二)科斯质粒载体（Cosmid vectors） 1、概述 λ噬菌体一般有效克隆外源基因范围仅为15kb左右，但有些基因可达35-40kb，甚至更大，同时λ噬菌体不能够同时克隆两个连锁基因。 为此，1978年，J.Collins及B.Hohn等人发展出科斯质粒载体，可满足以上需要。 “cosmid”一词是由英文“cos site-carrying plasmid”缩写而成，其愿意是指带有粘性末端位点(cos)的质粒。

定义： 科斯质粒是人工构建的，含有λDNA 的粘性(cos)末端序列、质粒复制起始区及质粒一个抗药性标记的、兼具质粒与λ噬菌体DNA载体双重性质的特殊载体。（图5-18）

2、Cosmid的特点 目前已有许多不同类型的科斯质粒载体，其特点如下： ① 具有λ噬菌体的特性； ②具有质粒载体特性； ③具有高容量的克隆能力； ④具有与同源序列的质粒进行重组的能力。

3、科斯克隆 应用科斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA的技术，叫做科斯克隆(cosmid cloning)。

先用特定的核酸内切酶局部切割真核生物DNA，产生较高分子量的外源DNA片段，与经同样酶切割过的科斯质粒线性分子进行体外连接反应，由此形成的连接产物群体中，有一定比例的分子是两端各有一个cos位点的长度为40kb左右的真核DNA片段，而且这两个cos为点在取向上是一致的，它可作为Ter体系的一种通用底物。当加入λ噬菌体的包装连接物时，它将能识别并切割这种两端由 cos 位点包围着的35-45 kb长的真核DNA片段，并把这些分子包装进入噬菌体的头部。（图5-19）

(三)单链DNA噬菌体M13载体 1、概述 噬菌体M13宿主为丝状E.Coli，其遗传物质为单 链环状DNA，故称为单链DNA噬菌体。其DNA分子长度为6500bp。M13是一种雄性大肠杆菌特有的噬菌体，因此它们只能感染带有F性须的大肠杆菌菌株。 其复制过程如下：

M13噬菌体的生物学特性： 感染周期 （+）DNA II V - DNA + DNA RFDNA RFDNA RFDNA

2、M13克隆体系中β半乳糖苷酶显色反应 M13克隆体系，包括M13噬菌体本身和寄主菌株两个组成部分。但无论M13载体，还是大肠杆菌寄主菌株（如JM101），单独都不能产生有功能活性的β半乳糖苷酶，而这种酶的活性可以用X-gal显色法测定出来。

安慰诱导剂 在M13体系中，已将Lac阻遏基因的Iq突变引入宿祖细胞。该Iq突变基因可产生出10余倍超量的阻遏物。这些阻遏物的存在可以抑制Lac操纵子的表达。IPTG是一种乳糖类似物，再无乳糖的条件下，他可以诱导细胞合成半乳糖苷酶。因此，IPTG被称为β半乳糖苷酶的安慰诱导物。

3、M13载体系列的优点 ①单链DNA噬菌体的复制是以双链环形DNA为中 间媒介的，这种RFDNA可以如同质粒DNA一样， 在体外进行纯化和操作。 ②不论是RFDNA还是ssDNA，它们都能够转染感 受态的E.Coli寄主细胞产生出噬菌斑 ③单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA多寡 的制约，因此，并不存在包装限制。

④应用这类单链DNA噬菌体，可以容易地控制外 DNA分子。这种单链DNA分子可按双脱氧链终 止法做核苷酸序列测定，也可用于制备具放射 性同位素标记的DNA探针，可以进行寡核苷酸 定点突变。 总之，M13载体兼具质粒载体与λ噬菌体的优点。

DNA序列测定法 采用Sanger双脱氧链终止DNA测序法： 测序三要素： 1、模板——DNA母链。新合成链按碱基互补原则（A-T，C-G）进行。 2、引物——DNA短链。起起始合成作用。 3、酶、底物（dATP、dTTP、dGTP、dCTP)和非正常底物（ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP) 。

非正常底物

三、真核基因病毒载体 病毒载体优点是： 1、有很高的拷贝数； 2、强大的启动子，可保证外源基因的高效表达； 3、可保证糖基化。 常用的有SV40病毒载体及昆虫杆状病毒载体。

真核基因表达载体应具备的条件： 1、含有原核基因的复制起始序列（如ColEI起始序列ori）以及筛选标记（如使E.Coli具有 Ampr的β-内酰胺酶基因 ）。这样便于在E.Coli细胞中进行扩增和筛选。 2、含有真核基因的复制起始序列（如SV40病毒的复制序列、酵母自主复制序列）以及真和细胞筛选标记（如氨基糖苷G418抗性基因，在酵母中与自养有关的基因）。

3、含有有效的启动子序列（可包含增强子序列等各种顺式作用元件cis-acting element），保证在其下游的外源基因进行有效的转录起始。 4、RNA聚合酶II所需的转录终止和poly(A)加入的信号序列。 5、合适的供外源基因插入的限制性内切酶位点。

SV40病毒载体(simian vacuolating virus 40 vector) SV40病毒DNA位环状双螺旋结构，长度为5224bp，其基因组分为早期区域和晚期区域，前者在整个病毒生长循环中均可表达，后者则在DNA复制开始后的一段时间内表达，产生病毒外壳蛋白。

SV40 DNA ori VP2 T VP3 VP1 t

pV2(gpt)即为一个SV40载体 它包括pBR322的大肠杆菌复制起始位点；氨苄青霉素抗性基因；大肠杆菌谷氨酸丙氨酸酶基因gpt和SV40的哺乳动物细胞复制起始位点以及其他一些在哺乳动物细胞中表达所必须的序列。 重组子可以通过对gpt进行筛选。

利用SV40载体 生产外源蛋白 过程的示意图:

SV40 DNA为载体的取代克隆方式又分为早期基因区域取代及晚期基因区域取代两种类型。 晚期基因区域取代方式是以外源性DNA片段取代晚期基因区域，构成的重组DNA在宿主中可以复制，但不能产生重组病毒颗粒，因而采用早期基因缺失的SV40病毒突变种作为辅助病毒与晚期取代重组DNA或和感染宿主，则晚期区域取代重组DNA可获得标记营救，辅助病毒产生的晚期基因产物与重组病毒的早期基因产物一起可形成完整病毒颗粒。

早期区域取代方式是以外源性DNA片段取代早期基因区域，但重组DNA形成病毒颗粒与早期区域基因产物T抗原供应有关，故同样可采用晚期基因区域缺失的SV40突变种作为辅助病毒进行标记营救，即可形成完整病毒颗粒。 SV40病毒载体的宿主为动物细胞。表达产物有糖基化。目前很多基因工程药物如EPO，TPA，β-珠蛋白可用其表达。

第四节 基因的分离和获得

获得目的基因，是基因工程研究中最重要的内容，也是基因工程操作中的关键。 每种基因都由四种碱基组成，具有极相似的理化性质，这给分离特定的基因带来很大困难。 尽管如此，人们仍可通过各种方法有效地分离出所要的基因。

基因的分离和获得的常用方法 一、基因分离的物理方法 二、鸟枪法(Shot gun) 又称霰弹法 三、cDNA文库的建立与基因的分离 四、基因组文库法 五、基因的化学合成 六、聚合酶链反应技术（PCR）

一、基因分离的物理方法 根据DNA分子的两条链存在着G≡C，A=T碱基配对。 如DNA分子中某段的G≡C碱基对含量高，则其热稳定性就高，其溶解温度（Tm）就高。这样，人们通过控制溶解温度使富A=T区解链变性，而富G≡C区仍维持双链。 当利用单链核酸酶S，酶去除解开的单链部分，得到富G≡C区的DNA片段 。

二、鸟枪法(Shot gun) 又称霰弹法 用限制性内切酶将基因组DNA进行切割，得到很多在长度上与一般基因大小相当的DNA片段（1000bp），然后，将这些片段混合物随机地重组入适当的载体，转化后在受体菌（如：E.Coli）中进行扩增，再用适当的筛选方法筛选出你所要的基因。

鸟枪法克隆目的基因的基本战略 + 1、随机酶切成基因相当大小的片段（约1000bp)； 2、重组入适当载体（质粒）； 3、转化进宿主菌（E.coli)，扩增； 4、筛选出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。 鸟枪法适用于原核细菌 目的基因的克隆分离 +

鸟枪法克隆目的基因的优缺点 优点：操作简单，命中率较高。 缺点：盲目性大，阳性片段不一定正好是基因，样本多，可能会漏。

三、cDNA文库的建立与基因的分离 是以mRNA为模版，用反转录酶合成互补DNA的方法。

cDNA文库组建步骤如下： 1、分离表达目的基因的组织或细胞。 2、从组织和细胞中制备总RNA和mRNA 3、第一条cDNA链的合成 4、第二条cDNA链的合成 5、cDNA上接头的加入 6、双链cDNA与载体的连接 7、从众多的重组体中筛选出特定的基因

cDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA第一链的合成 mDNA 引物 退火 逆转录酶 dNTPs cDNA第一链 5‘ppp’5 G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ 引物 退火 5‘ppp’5 G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 逆转录酶 dNTPs 5‘ppp’5 G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ cDNA第一链

cDNA第二链的合成 自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺失 5‘ppp’5 NaOH 煮沸 Klenow dNTPs S1 G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ NaOH 煮沸 TTTTTTTTTTTTTTp 5’ OH 3’ Klenow dNTPs TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ S1 TTTTTTTTTTTTTT AAAAAAAAAAAAAA

cDNA第二链的合成 置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺失 AAAATTTOH 3’ RNaesH 5‘ppp’5 G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ RNaesH DNApol dNTPs 5’ AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTTOH 3’ AAAAAAAAAAAAAAp 5’ S1 T4-DNA ligase 5’ TTTTTTTTTTTTTT 3’ 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’

cDNA第二链的合成 引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列 dCTP NaOH 退火 Klenow dNTPs 5‘ppp’5 G AAAAAOH 3’ 3‘ HO TTTTTp 5’ dCTP 5‘ppp’5 G AAAAACCCCCCCOH 3’ 3‘ HO CCCCCCC TTTTTp 5’ NaOH 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 退火 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 5‘ p GGGGGGG Klenow dNTPs 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGG AAAAAOH 3’

双链平头的cDNA通常克隆入载体中的三种方法： 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段的回收

cDNA法克隆目的基因的局限性 并非所有的mRNA分子都具有polyA结构 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短 分离纯化困难 仅限于克隆蛋白质编码基因,没有内含子，不能用于真核表达。

四、基因组文库法 所谓基因组文库是将基因组DNA通过限制性内切酶 部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机地同相应 的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基 因组DNA的所有序列。

基因组文库构建程序 1、随机酶切成较大的DNA片段（10~30Kb，平均20Kb)，对这些片段进行分离； 2、重组入适当载体（噬菌体）； 3、转化进宿主菌（E.coli)，扩增，构建成基因文库； 4、从基因组文库中筛选出含有目的基因组的重组子。

基因组文库与鸟枪法的不同点 1、克隆的DNA片段较大（10~30Kb，平均20Kb)，而鸟枪法为1000bp; 分离方法如：蔗糖密度梯度离心 凝胶电泳 4、载体不同。基因组文库法为噬菌体，而鸟枪法为质粒。 值得注意的是，从基因组文库所分离获得的基因序列包含有内含子，因此不能直接在原核细胞中表达，但更适合作为如转基因动物等的真核表达系统。

五、基因的化学合成 随着寡核苷酸化学合成的自动化，基因的化学合成变得更经济、容易和准确。 前提条件：对基因的结构序列清楚 。 分为：基因片段的全化学合成 基因的化学—酶促合成

化学合成的单元操作 DMT： 二甲氧基三苯甲基 脱取代基 氧化 缩合 玻璃珠 连接臂 激活 DMT O CH G O H H H H O H 2 O H H H H DMT： 二甲氧基三苯甲基 O H Me O P H N Me Me CH CH Me Me H 脱取代基 氧化 缩合 H 玻璃珠 连接臂

基因片段全化学合成 根据目的基因全序列，分别合成正负链单链DNA片段 混合退火 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体

基因的化学——酶促合成 根据目的基因的全序列，分别合成单链DNA片段 混合退火 Klenow酶聚合 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体

基因的化学合成的优点 1、可以合成细菌偏爱的密码子 2、可以定向改变个别氨基酸 3、可以在两端加上需要的限制酶切点 4、可以通过自动化仪器合成

六、聚合酶链反应技术（PCR） 定义：聚合酶链反应技术是指在四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以寡聚合苷酸为引物，以单链DNA为模板，经DNA聚合酶催化，合成DNA互补链达到基因扩增目的的过程。

PCR技术反应周期包括三个步骤： 1、高温变性：通过加热使得复制双螺旋DNA变性分 离为单链，作为模板。（>91℃，1分钟）。 2、低温退火：（约50℃，1分钟）使专门设计的一 对寡核苷酸引物在此低温条件下分别与单链模 板DNA两端的互补区段互补结合。 3、适温延伸：将反应混合物的温度上升到72℃， 保温1分钟。

PCR原理图

PCR反应的必要条件： 须知基因两端的部分序列 PCR反应中的几个关键因素 1、Taq DNA聚合酶 2、引物的长度 3、模板

PCR反应的优点： 1、操作简单 2、通用性好 3、成功率高

第五节 重组DNA向宿主细胞内转移技术

一、CaCl2处理后的细菌转化与转染 （一）转化和转染的基本含义 1、转化（Transformation) 自然的转化是指将携带某种遗传信息的DNA分子引入宿主细胞，通过同源重组作用。获得具有新遗传性状的生物细胞的过程。 基因工程操作中的转化是泛指将重组DNA转入宿主中的方法。

肺炎链球菌感染小鼠致死和不致死实验

2、转染作用（Transfection) 自然界中，通过噬菌体或病毒的感染作用将一个细胞的遗传信息传递到另一个细胞的过程称为转染作用。

（二）感受态细胞（Competent cells) 定义：能从其周围摄入DNA的细胞称为感受态细胞。 基因工程中，宿主细胞需经人工处理成能吸收重组DNA分子的敏感状态，才能用于转化，这种敏感细胞称为人工感受态细胞。

感受态细胞的制取一般是将细菌（如大肠杆菌等）用一定浓度的冰冷CaCl2处理而得。

为了得到较好的感受态细胞，需注意以下几点： 1、细胞要处于对数生长期 2、整个制备过程要在低温（0~4℃）进行 3、为了提高转化率，可选用复合氯化钙溶液

（三）转化程序 1、获得携带目的基因的重组DNA分子 2、选择符合要求的宿主细胞 3、对数生长期的宿主细胞的获得 4、 CaCl2处理，转化 5、重组细胞的筛选

（三）转化程序 1、获得携带目的基因的重组DNA分子 2、选择符合要求的宿主细胞 3、对数生长期的宿主细胞的获得 4、 CaCl2处理，转化 5、重组细胞的筛选

大肠杆菌感受态细胞的质粒转化实例： 取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组DNA连接液，混匀 冰浴放置半小时 在42℃保温 2 分钟（热脉冲） 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟 加入1 ml 新鲜培养基，于37℃培养 1 小时（扩增） 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选

二、高压电穿孔法 通过调节外加电场的强度，电脉冲的长度和用于转化的DNA浓度，可将外源DNA导入细菌和真核细胞。

三、聚乙二醇介导的原生质体转化 将活跃生长的细胞或菌丝体用消化细胞壁的酶（如driselase）处理变成球型体后，在适当浓度的聚乙二醇6000（PEG-6000）的介导下，将外源DNA转化入受体细胞中。 本方法适用于转化酵母细胞以及其他真菌细胞

四、磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染 将被转染的DNA同正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后，通过内吞作用进入受体细胞。 这是将外源基因导入哺乳类细胞中进行瞬时表达的常规方法。

五、原生质体融合 通过带有多拷贝重组质粒的细菌原生质体同培养的哺乳细胞直接融合。 经过细胞膜融合，细菌内容物能转入动物细胞中，质粒DNA被转移到细胞核中。

六、脂质体法 将DNA包裹于脂质体微囊中，然后，进行脂质体微囊与宿主细胞膜融合，将外源DNA导入。

七、细胞核的显微注射法 将目的基因重组体通过显微注射装置直接注入细胞核中，此法多用于转基因动物。

八、激光打孔技术 用激光束在细胞上打孔，使溶解在高渗溶液中的DNA进入细胞内部。

第六节 阳性重组DNA的鉴别与分析

一、阳性重组DNA的鉴定 （一）表现型分析法

抗生素抗性基因分析法 抗药性筛选法的基本操作： 先将转化液涂布含有Ap的平板 再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上 挑选 影印

X-gal显色反应筛选重组体 显色筛选法的基本操作： lacZ' 将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，淡黄色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落 ori pUC18 Ap r Ap + X-gal 重组子（Apr + lacZ-）

（二）原位杂交技术（in situ hybridization） 根据核酸杂交原理，利用基因探针检出培养板上重组 转化体菌落位置的技术称之为原位杂交技术。

影印 原位杂交技术方法图示 感光 洗涤 杂交

原位杂交技术步骤 生长着转化菌落或嗜菌斑的平板→原位转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，得到一个与平板菌落或嗜菌斑分布完全一致的复制品→ 裂解菌体或嗜菌斑→碱变性→酸中和→洗涤去处细胞碎片→烘烤→加入标记探针杂交，放射性自显影→获得杂交阳性的菌落或嗜菌斑→经对照，从原始平板中找出阳性菌落供进一步研究。

（三）免疫分析法（immune test） 利用抗原-抗体反应来检测含目的基因的重组转化体或嗜斑的技术称为免疫分析法。 条件：只要目的基因在宿主中表达相应蛋白质，并能获得相应抗体，即可用本技术检测相应DNA。

分为： 1、放射性抗体检测法 2、免疫沉淀检测法

放射性抗体检测法（radioactive antibody test) 裂解菌落 用膜吸附抗原 备份 携有抗体的 聚乙烯膜 释放抗原 洗涤 与I125标记的第二抗体保温 烘干,放 射自显影

免疫沉淀检测法 在琼脂培养基中加入目标蛋白的特异性抗体 然后涂布转化液 37℃ 培养 经培养后，目的重组子菌落变会分泌出目标蛋白，后者与特异性抗体发生免疫沉淀反应，在菌落周围形成白色的圆斑 此法简便快速，但灵敏度低，抗体消耗量大

二、阳性重组DNA的分析

(一)、重组质粒分离及再转化

（二）Southern印迹转移技术（Southern blot） 利用毛细管作用原理，将凝胶电泳分离后的DNA片段转移至硝酸纤维素膜上，并根据核酸杂交原理进行分析的技术称为Southern blot。 本方法将分子大小与探针杂交结合起来。

（southwestern sreening） （三）DNA-蛋白质筛选法 （southwestern sreening） DNA-蛋白质筛选法是用来专门检测同DNA特异结合的蛋白质因子的一种方法。这种方法能用于筛选并分离表达融合的克隆。 合成这种融合蛋白的重组DNA分子中的外源DNA编码一种能专门同某一特定DNA序列结合的DNA结合蛋白质（DNA binding protein）。

基本操作程序为： 1、用硝酸纤维素膜进行转移，使其中的蛋白质吸附在滤膜上； 2、将此滤膜同放射性标记的含有DNA结合蛋白质特异结合区的双链DNA寡核苷酸探针杂交； 3、根据放射自显影结果筛选出阳性反应克隆。 优点：将DNA杂交技术用于蛋白质筛选。方便快速，无需抗体。

第七节 外源基因在宿主细胞中的高表达 一、有效的转录起始与基因的高效表达 二、mRNA的稳定性与基因高效表达 三、有效地翻译启始与基因的高效表达 四、遗传密码应用的偏倚性与基因高效表达 五、 mRNA的加工与基因高效表达 六、 mRNA序列上终止密码的选择 七、表达质粒拷贝数及稳定性与基因高效表达 八、外源基因的稳定性与基因高效表达

一、有效的转录起始与基因的高效表达 关键：选择强的可调控的启动子。 理想状况是：在发酵的早期阶段，表达载体的启动子被紧紧地阻遏，这样可以避免出现表达载体不稳定，细胞生长缓慢或由于产物表达而引起细胞死亡等问题。当细胞生长到一定的密度，通过各种诱导（如温度、药物等)使阻遏物失活，快速启动转录。 原核细胞中这类启动子有：Lac、Trp、λPL、λPR等。

二、mRNA的稳定性与基因高效表达 措施： 1、利用RNase缺失的受体菌 2、mRNA的5’端与3’端的正确加工，提高mRNA的稳定性

三、有效地翻译启始与基因的高效表达 1、首选AUG为起始密码子； 2、正确的SD序列； 3、 SD序列与起始密码子之间的距离以9±3为宜； 4、除SD序列外，处于起始密码5’端的核苷酸应为A和U； 5、如果在起始密码AUG后的序列是GCAU或AAAA，能使翻译效率提高； 6、在翻译起始区周围的序列应不形成明显的二级结构。

四、遗传密码应用的偏倚性与基因高效表达 真核细胞与原核细胞对遗传密码的偏倚性不同，再不同表达系统中，使用偏倚性密码，尤其对于基因编码序列的5’端使用偏倚性密码，能有效提高表达效率。

五、 mRNA的加工与基因高效表达 绝大多数较高等的真核基因含有内含子，这些内含子在mRNA的加工过程中，在细胞核中被加工去除而产生成熟的mRNA。但许多哺乳动物类细胞中外源基因的表达需要内含子存在，如果在转基因动物中表达外源基因时，最好用基因组基因而非cDNA。

六、 mRNA序列上终止密码的选择 1、首选UAA 2、用一串连的终止密码，而不是只是一个终止密码，以保证翻译有效终止。

七、表达质粒拷贝数及稳定性与基因高效表达 一般来讲： 质粒拷贝数多，基因表达水平高； 质粒稳定性高，表达好。

八、外源基因的稳定性与基因高效表达 1、通过组建融合基因，产生融合蛋白； 2、产生可分泌的蛋白质； 3、以包含体的形式表达； 4、选择合适的宿主表达系统。

第八节 蛋白质工程(Protein Engineering) 一、概述 定义：蛋白质工程是指通过蛋白质化学、晶体学和动力学的研究，获取关于蛋白质物理、化学等各方面的信息，在此基础上，对编码该蛋白质的基因进行有目的的改造，并通过基因工程等手段将其进行表达和分离纯化，最终得到比天然蛋白质更好的产物。 蛋白质工程中最常用的技术是定点诱变技术（site-directed mutagenesis 或 site-specific mutagenesis ）

对蛋白质可以进行10个方面的改造： 1、改变酶的Km与Vmax，以改变酶的催化效率 2、改变蛋白质的pH或温度稳定范围，改变蛋白的作用条件 3、改变酶在非水溶剂的反应性 4、使酶不需要加入辅助因子，简化持续生产过程 5、提高酶对底物的亲和力，以增强酶的专一性，减少不必要的副反应 6、增强蛋白对胞内蛋白酶的抗性，从而简化操作过程，提高产率 7、改变酶的别构调节部位，减少反馈抑制，提高产率 8、提高蛋白的抗氧化能力 9、根据需要改变酶的底物专一性 10、改变蛋白发生作用的种属特异性

二、蛋白质工程的主要步骤 1、分离纯化需改造的目的蛋白 2、了解其一级结构及高级结构，了解其结构-功能关系 3、获取编码该蛋白的基因序列 4、设计改造方案 5、对基因序列进行改造 6、将经过改造的基因序列重组入表达载体，进行表达 7、分离纯化表达产物，并对其功能进行检测

三、基因诱变的方法举例

1、用M13DNA进行的寡核苷酸介导诱变

2、寡核苷酸介导的PCR诱变

3、改进型双引物诱变

4、化学合成法诱变

四、蛋白质工程的应用实例

1、提高β-干扰素的专一活性和稳定性

2、对水蛭素的改造 3、胰岛素的蛋白质工程 4、肿瘤坏死因子（TNF）的改造 5、降钙素的改造