中华稻蝗染色体C带核型特征分析

一 、目的与要求 1、了解染色体常规核型和染色体C-带核型的概念。 2 、掌握染色体C-带显色技术。

二 、原理 染色体是遗传物质的载体，如果染色体发生变化了，生物的外在性状必然发生变化。染色体数目的变化比较容易察觉，但是染色体结构和组成成分的变化就比较难以发现。染色体显带技术使不可察觉的染色体结构和成分变化转变为可以定量表述的带型变化，染色体带型结构的研究大大推动了昆虫细胞分类学的研究和发展。 染色体分带技术：染色体经物理、化学因素处理后，再进行染色，使其呈现特定的深浅不同带纹（band）的方法。

染色体分带技术可分为两大类，一类是产生的染色带分布在整个染色体和长度上，如Q、G和R带；另一类是局部性的显带，它只能使少数特定的带或结构染色，如C、T和N带等。其中C-带主要显示着丝粒附近的异染色质，故称为C-带。其他异染色质均可显示。染色体标本经一定浓度的酸（HCl）和碱[Ba(OH)2]处理后，在缓冲盐溶液（2×SSC）中温育1小时，再以Giemsa染液染色即可显带[1]。 染色体C-带核型包括染色体C-带结构特征、C-带位置、染色强度，异染色质含量等。 而染色体常规核型是指有丝分裂中期染色体特征的总和，包括染色体的数目、大小和形态特征等方面。

作为细胞分类学指标，染色体C-带核型可以从不同层次上反映其生物类群间的分类关系。染色体C-带在同一属内有一明显而恒定的C-带结构模式，往往构成“标志性C-带带纹”，由此可以进行属级分类单元的比较。例如，所研究过稻蝗属物种的L2染色体除都具有着丝粒C-带而外，每个具体物种还具有各自标志性的染色体C-带带纹，但不同物种间该染色体的标志性带纹位置多变，其中，中华稻蝗该染色体具有端带，小稻蝗该染色体具有近着丝粒居间带，山稻蝗该染色体具有亚中部居间带，而日本稻蝗该染色体兼具有亚端部居间带和端带。因此C-带核型分析可为蝗虫分类提供细胞学依据。

三、实验用品 1、仪器 解剖镜、OLYMPUS 光学显微镜、冰箱、液氮罐、恒温水浴锅、离心机等。 2 、用具 载玻片、盖玻片、培养皿、解剖针、眼科镊子、剪刀、微量进样器、以及药品配制和存放所需要的一系列玻璃器皿。 3 、供试药品 0.05%秋水仙素、低渗液（0.075M氯化钾）甲醇、冰醋酸、酒精（70%）卡宝品红染液、盐酸（0.2N）、氢氧化钡（5%）、柠檬酸钠、氯化钠（2×SSC）、吉姆萨染液。

四、实验方法 1、预处理 将野外采集到的蝗虫雄性个体注射0.05%的秋水仙素溶液（3-8ul，视个体的大小而定），此步骤可提供较多的中期细胞分裂相。7小时后，将活的虫体腹部侧处（2-4节体腔内背板侧下方）剪一小口，用尖头镊子夹出精巢（保留虫体，以备鉴定），然后放入低渗液10分钟后，转入卡诺固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），24小时之后再换固定液，换至精巢发白为止。最后移至70%酒精中保存备用。若标本需长期保存，应放入4℃冰箱中。

2、染色体制片 （1）压片法 用镊子夹取精巢的精小管，置于载玻片上，在解剖镜下剔去表面的结缔组织，并切去末端膨大部分（约是精小管1/4-1/3处），此过程进行时应随时滴加固定液以防止蒸发干燥，将取好的3-5个精小管末端放到预先滴上1-2滴40%-60%的冰醋酸溶液的载玻片上，加盖片软化15分钟，然后施加压力，使细胞分散（在压片过程中应注意大拇指翘起垂直加压）。将压片置液氮罐中快速冷冻后，用刀片揭去盖玻片，在室温无尘处自然干燥（或放入恒温干燥箱），经老化3-8天后进行后续分带处理。对于常规核型观察，制片可直接用品红染色后观察[2, 3]。

（2）滴片法 从经预处理的雄性蝗虫体内取出精巢，经低渗处理，并置生理盐水中剔出脂肪等附着物，切取精小管端部，置于研钵中进行研磨。待研成匀浆后，倒入离心管中用500转/分的转速离心后去沉淀，或可用尼龙砂箔进行过滤，然后，以1000转/分离心10分钟，去上清，滴加固定液吹打均匀，再行离心1-2次使充分固定，最后加入适当固定液吹打均匀，取出冰箱内预冷的洁净载玻片，滴加细胞悬液1-2滴，过火焰干燥，或室温下自然干燥，老化2-3天后，进行后续分带处理。新鲜材料可采用此法。

（3）涂片法 将精小管末端部置于预冷洁净的载玻片上，滴加一滴固定液后，迅速用尖头镊子将材料夹碎弃除大块状物，再加一滴固定液，吹散细胞，过火焰干燥，老化后，进行分带处理。注意用新鲜材料效果较好。 以上制片方法除用于精巢材料外，对于胃盲囊、卵巢等组织也同样适用。

3、 C带显带步骤： （1）饱和Ba(OH)2处理 将老化的玻片置于装有饱和Ba(OH)2溶液的染色缸中，然后在60℃左右恒温水浴锅内处理10-30分钟。在C 带显带技术中，此步最为关键。Ba(OH)2处理时间与老化时间长短、标本种类、及细胞分裂所处的时期等因素有关，另外与药品的生产厂家，存放的时间长短也有关。对于不同物种染色体标本进行大批量分带处理之前，应进行梯度试验，以找出药液与处理时间的最佳组合，以便节省时间，提高效率。

（2）2×SSC液温育 经Ba(OH)2处理后的玻片，应立即置于同温度的蒸馏水下冲洗，以便去除钡垢，否则Ba(OH)2极易与空气中的CO2形成钡垢（BaCO3 ），而影响后续的染色和观察。去垢后再以蒸馏水冲洗置2×SSC液中于60℃水浴锅中温育1个小时以上（可过夜），然后再以蒸馏水冲洗。此步处理时间长短并不是至关重要。 （3）吉姆萨溶液染色 将上述染色体玻片标本放入10%的吉姆萨染液中染色20分钟以上，再用蒸馏水冲净玻片表面的染液，然后在磷酸缓冲液中浸泡10分钟，最后用蒸馏水冲洗即可（扣染也可以）。

（4）封片 室温无尘干燥后，以中性树胶封片，制成永久玻片标本。 （5）镜检、标记 在光学显微镜下观察，选取所需的分裂相。 （6）摄影及染色体C-带核型 选取分散良好的精原细胞有丝分裂中期、初级精母细胞减数分裂中期Ⅱ和后期Ⅱ的分裂相进行拍照，保存为JPEG格式。将拍照好的显微图像经Photoshop软件对其亮度、对比度等信息校正后，打印出照片。然后将染色体逐一剪下，依长度递减顺序依次粘贴于质地较厚的白纸上，最后进行编号。一般是将X染色体排于最后位置。

4、染色体C－带带型分析 C-带显示结构异染色质 ，为便于测量、分析和比较。选用精原细胞有丝分裂中期染色体以及精母细胞减数分裂中期Ⅱ和后期Ⅱ染色体进行观察和测量统计。 1）、染色体C-带位置 （1）着丝粒C-带（也称着丝粒区C-带）：指着丝粒本身及其相邻部分的C-带纹。 （2）端部C-带：指染色体末端区域的C-带纹。 （3）居间C-带：在着丝粒C-带和端部C-带之间范围内的C-带纹。根据其所在位置又细分为近着丝粒带、中间带、亚中间带和亚端带等。

2）、染色体上C-带的相对含量 指某条染色体上C-带实际长度与该染色体组总实际长度比值，用百分率来表示。 3）、C-带结构异染色质含量 即染色体上C-带相对长度之和。也可通过每一染色体组中所有染色体上C-带纹总长度与染色体组总长度的比值计算，数值结果是一致的，一般用百分率来表示。 此值在不同物种中存在着恒定的差异，因此也可作为一项重要分类指标。 4）、每对同源染色体上相对应的C-带是否纯合 即在某一特定位置相配对的两条染色体是否都具有带纹，带纹大小、染色程度是否一致，如非上述，则按杂和计。

5）、特定染色体C-带带纹的着色程度 在同样的处理程序下，染色体组中各染色体C-带带纹上存在恒定的深浅不同的着色反应，这也是C-带分析中不可忽视的一项内容，它表示C-带结构异染色质在质上的差异。本文中以四级表示法：特强：染色极深；强：染色较深；中：染色程度中等；弱：染色极淡。 6）、染色体组中，各类C-带纹的总个数（包括着丝粒带、端带、各类居间带） 根据以上C-带各项统计结果，列表表示，并据此绘制出中华稻蝗染色体C-带带型示意图。 选取20个左右染色体形态清晰、分裂相良好的细胞，置于Olympus 显微摄影仪上进行拍照，测算照片上的染色体和C-带带纹相对长度等有关数据，分析蝗虫的染色体核型、C-带带型。

五、实验结果 中华稻蝗 属斑腿蝗科稻蝗属，染色体数目均为2n♂=23，2n♀=24，性别决定机制XO型，常染色体和性染色体均为端部着丝粒染色体。染色体组式：2L+6M+3S+X，其中包括大型染色体2对，中型染色体6对，小型染色体3对，X染色体中型，在染色体组中长度列第3位。都具有着丝粒C-带带纹。从染色体C-带带型分析可以看出中华稻蝗L1染色体具有弱染端带，L2染色体具有强染端带，M8染色体具有弱染近着丝粒居间带，S10染色体具有强染端带（图1-1）。

图1-1 中华稻蝗部分种群染色体C带核型图版 A 福州种群；B长沙种群；C长春种群 1-11为常染色体编号，X为X染色体

六、作业： 1、对中华稻蝗染色体C带带纹进行核型分析。 2、说明染色体C带核型分析的意义。

参考文献 [1]. 汪堃仁, 薛绍白, 柳惠图. 细胞生物学（第二版）.北京,北京师范大学出版, 1997, 322-327． [2]. 马恩波，郑哲民．斑腿蝗科10个种NOR定位和分类学意义．动物学研究，1993， 14(3)：271-276． [3]. 马恩波．稻蝗属一新种及其染色体C带核型分析（直翅目：蝗总科）．动物分类学报，1995b，20（2）：200-203．