动物性食品微生物检验 单核细胞增生李斯特菌检验 主讲人：王福红

知识目标： 能力目标： 理解单核细胞增生李斯特菌的生物学特性。 了解单核细胞增生李斯特菌的致病性。 掌握单核细胞增生李斯特菌标准检验方法。 会制备单核细胞增生李斯特菌检验用培养基。 会对单核细胞增生李斯特菌进行检验。

单核细胞增生性李斯特菌 病原性:单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。 存在范围:它广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。

传播媒介:人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约占85%~90%的病例是由被污染的食品引起的。 抵抗力:较强，在土壤、粪便、青储饲料和干草内能长期存活，对碱和盐抵抗力强，60～70℃经5～20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min可杀死此菌。该菌对青霉素、氨苄青毒素、四环素、磺胺均敏感。

一、生物学特性 形态及染色：该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约0.5um×1.0um～2.0um，直或稍弯，两端钝圆，常呈v字型排列，偶有球状、双球状，兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养基中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性，该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。 电镜下的李特氏菌

培养特性： 有动力，可见倒立伞状生长 肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。 固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。 血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。 0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂（TSAYE）和改良MC Bride（MMA）琼脂上，用45º角入射光照菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落为蓝色、灰色或蓝灰色。

生化特征 该菌过氧化氢酶阳性 发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。 不利用枸椽酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性。 V-P、甲基红试验和精氨酸水解阳性。

血清学特性 根据菌体（O）抗原的鞭毛（H）抗原，将单增李氏菌分成13个血清型，分别是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e、和“7”13个血清型。致病菌株的血清型一般为1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b，后两型尤多。

二、致病性 单增李氏菌是一种细胞内寄生菌，宿主对它的清除主要靠细胞免疫功能。 易感人群:新生儿、孕妇及40岁以上的成人，此外，酗酒者、免疫系统损伤或缺陷者、接受免疫抑制剂和皮质激素治疗的患者及器官移植者也易被该菌感染。 传播途径:眼及破损皮肤、粘膜进入人体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿，栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接解也是本病传播的可能途径，且有上升趋势。 临床表现，健康成人个体出现轻微类似流感症状，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者等表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、自然流产、脑膜炎、败血症直至死亡。

单增李氏菌的抗原结构与毒力无关，致病性与毒力机理如下： 寄生物介导的细胞内增生，附着及进入肠细胞与巨噬细胞。 抗活化的巨噬细胞，单增李氏菌有细菌性过氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬细胞内的过氧化物（为杀菌的毒性游离基团）分解。 溶血素，即单增李氏菌素O，可以从培养物上清液中获得，活化的细胞溶血素，有α和β两种，为毒力因子。

三、检验方法 食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验应按《食品安全国家标准 食品微生物检验》单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法 GB4789.30-2010 进行。

检验程序 增菌培养 分离培养 初筛 鉴定 生化自动化鉴定 结果 报告

1.增菌 增菌第一步 均质：以无菌操作取样品25g（mL）加入到含有225mL LB1增菌液的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min～2min；或放入盛有225mL LB1增菌液的均质杯中，8000r/min～10000 r/min均质1min～2min。 培养：30℃±1℃，24h。 增菌第二步 移取0.1mL，转种于10mL LB2增菌液内 培养：30℃±1℃，18h～24h。

李氏增菌肉汤（LB） 用 途：用于李斯特氏菌的选择性增菌培养。 用 途：用于李斯特氏菌的选择性增菌培养。 原 理： 胰胨、多价胨和酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子；李斯特氏菌可耐受较高含量的氯化钠，同时对肠球菌起抑制作用；磷酸二氢钾和磷酸氢二钠为缓冲剂；七叶苷为可发酵的糖类；萘啶酮酸和吖啶黄为选择性抑菌剂。

2.分离培养 取LB2二次增菌液划线接种于 PALCAM琼脂平板 李斯特氏菌显色培养基上 培养：36℃±1℃，24h～48h，观察各个平板上生长的菌落特征。

PALCAM琼脂平板 用 途：用于单增李氏菌选择性分离 用 途：用于单增李氏菌选择性分离 原 理：蛋白胨提供生长必须的碳氮源；酵母膏粉和淀粉提供碳氮源、维生素和生长因子；氯化钠可维持均衡的渗透压；葡萄糖提供碳源；李斯特氏菌水解七叶苷与铁离子反应形成黑色的6,7-二羟基香豆素；甘露醇是可发酵的糖，酚红是pH指示剂；氯化锂和其它的抗生素能抑制革兰氏阴性菌和大多数革兰氏阳性菌；琼脂是培养基的凝固剂。

单增李氏菌PALCAM琼脂平板菌落特征 典型菌落：小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。

单增李氏菌显色培养基菌落特征

3.初筛 试验步骤：自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落，分别接种在 木糖发酵管 鼠李糖发酵管 培养：36℃±1℃，24h TSA-YE平板上划线纯化 培养：30℃±1℃，24h～48h 观察结果：选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。

3.初筛-木糖生化试验 试验原理：有些细菌可以利用木糖产酸，使pH降低，指示剂颜色发生变化。溴甲酚紫指示剂的变色范围是PH5.2-6.8，有黄色变为紫色。 试验方法： 自选择性琼脂平板上分别挑取5 个以上典型或可疑菌落，接种木糖发酵管，36±1℃培养24h。 观察结果。

木糖试验结果：单增李氏菌不利用木糖，阴性。 培养基颜色有紫色变成黄色为阳性。 不变色为阴性。 阴性（紫）、阳性（黄）

3.初筛-鼠李糖生化试验 试验原理：有些细菌可以利用鼠李糖产酸，使pH降低，指示剂颜色发生变化。溴甲酚紫指示剂的变色范围是PH5.2-6.8，有黄色变为紫色。 试验方法： 自选择性琼脂平板上分别挑取5 个以上典型或可疑菌落，接种鼠李糖发酵管，36±1℃培养24h。 观察结果。

鼠李糖试验结果：单增李氏菌利用鼠李糖，阳性。 培养基颜色有紫色变成黄色为阳性。 不变色为阴性。 阴性（紫）、阳性（黄）

3.初筛-TSA-YE平板上划线纯化 试验原理：可促进单核增生李斯特氏菌的生长。 试验方法： 自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落，接种TSA-YE 平板上划线纯化，于30 ℃±1 ℃培养24 h～48 h。 观察结果。

胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA-YE)平板 用 途：用于单增李氏菌分纯、培养。 原 理：胰蛋白胨、多价胨和酵母浸粉提供氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；葡萄糖提供碳源；磷酸氢二钾为缓冲剂。

胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA-YE)平板菌落特征 典型菌落：灰白色菌落。 不典型菌落：淡蓝色或蓝灰色菌落。

3.初筛 观察结果：选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。

4.鉴定-染色镜检 染色镜检：李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为（0.4m～0.5m）×（0.5m～2.0m）；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。

4.鉴定-动力试验 试验原理：有鞭毛的细菌可以运动。 试验方法： 直接挑取出培养物接种半固体培养基，36±1℃培养24h。 观察结果：李斯特氏菌有动力，呈伞状生长或月牙状生长。

4.鉴定-生化鉴定 试验过程：挑取纯培养的单个可疑菌落， 过氧化氢酶试验 过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行 糖发酵试验 MR-VP试验

（1）过氧化氢酶试验 试验原理：某些细菌能产生触酶，触酶能使过氧化氢快速分解成水和氧气。 试验方法： 挑取纯培养物于一无菌管中，加2mL新配制的3%过氧化氢溶液，立刻观察。 观察结果。

过氧化氢酶试验结果:李氏特菌产生过氧化氢酶，阳性。 液面出现气泡者为阳性反应。 无气泡者为阴性。

（2）糖发酵试验 试验原理：有些细菌可以利用糖产酸，使pH降低，指示剂颜色发生变化。溴甲酚紫指示剂的变色范围是PH5.2-6.8，有黄色变为紫色。 试验方法： 挑取纯培养物，接种葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇发酵管，36±1℃培养24～48h。 观察结果。

糖发酵结果：单增李氏菌利用葡萄糖、麦芽糖、甘露醇，阳性。 培养基颜色有紫色变成黄色为阳性。 不变色为阴性。 阴性（紫）、阳性（黄）

(3)MR试验 试验原理：某些细菌能分解葡萄糖产生大量酸性产物，使甲基红指示剂变红。甲基红指示剂的变色范围是PH4.4-6.2。 试验方法：

MR试验结果：单增李氏菌MR阳性。 液体呈红色者为阳性 黄色者为阴性 橙色者为可疑 - +

(4)VP试验 试验原理：某些细菌能分解葡萄糖产生乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰（丁二酮），二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物。 试验方法： 挑取纯培养物接种葡萄糖蛋白胨水，36±1℃培养24～48h。 向VP培养基中加6％α-萘酚-乙醇溶液0.5mL，40％氢氧化钾溶液0.2mL，充分振摇试管，观察结果。

VP试验结果：单增李氏菌VP阳性。 + 接种前 － 液体呈红色者为阳性 黄色者为阴性

4.鉴定-溶血试验 试验步骤： 将羊血琼脂平板底面划分为 20 个～25 个小格 挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落 刺种阳性对照菌(单增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌)

4.鉴定-溶血试验 注意事项:穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂 培养:36℃±1℃,24～48h 结果:于明亮处观察，单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，伊氏李斯特氏菌产生大的透明溶血环。

4.鉴定-协同溶血试验 试验步骤: 在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌 挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间 注意问题:垂直线两端不要触及平行线 培养:30℃±1℃,24～48h 结果观察:单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强，斯氏李斯特氏菌的溶血也增强，而伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增强。

5.生化鉴定试剂盒或系统 可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统等对5.3 中3 个～5 个纯培养的可疑菌落进行鉴定。

6.结果报告 综合以上生化试验和溶血试验结果，报告25 g（mL）样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌。

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