第三章 多肽和蛋白质类药物

第一节、概述 1953年人工合成了第一个有生物活性的多肽——催产素 以后，20世纪50年代都集中于脑垂体所分泌的各种多肽 激素的研究。 60年代，研究的重点转移到控制脑垂体激素分泌的各种 多肽激素的研究。 70年代，神经肽的研究进入高潮。生物胚层的发育渊源 关系表明，很多脑活性肽也存在于肠胃组织中，从而推动 了肠胃激素研究的进展。

一、多肽和蛋白质药物基本知识 基本概念 多肽：指分子大小和结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类 化合物。一般来说，50个以下氨基酸 组成的化合物，称为 多肽。 多肽类药物是以多肽激素和多肽细胞生长因子为主的一大 类内源性活性成分。 蛋白质药物包括蛋白质类激素、蛋白质细胞生长调节因子 、血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白、蛋白酶抑制剂等， 其作用方式从对机体各系统和细胞生长的调节，扩展到被 动免疫、替代疗法和抗凝血等。

二、多肽、蛋白质类药物分类 按来源分 习惯分法 生化药物——来源于动植物有机体 基因工程药物——来源于基因工程菌表达生产的药物 多肽生化药物、细胞生长因子、抗体药物、抗菌肽、 酶类药物

生化药物 多肽类激素、多肽抗生素：消化道多肽、下丘脑多肽、脑多肽、激肽等；动、植物蛋白。 酶类与辅酶类药物：蛋白水解酶类、凝血酶及抗栓酶，辅酶Q10等。

基因工程药物 基因工程药物 激素类及神经递质类药物：人生长激素释放抑制因子，人胰岛素，人生长激素 细胞因子类药物：人干扰素，人白细胞介素，集落刺激因子，促红细胞生成素 酶类及凝血因子类药物：单克隆抗体、疫苗、基因治疗药物、白介素、生长因子、内啡肽、反义药物、人生长激素、促红细胞生成素、肿瘤坏死因子等

三、多肽和蛋白质的结构特征 蛋白质结构可分为一、二、三、四级结构： 一级结构为初级结构，指蛋白质多肽链中的氨基 酸排列顺序，包括肽链数目和二硫键位置。 二、三、四级结构为高级结构或空间结构，高级 结构和二硫键与蛋白质的生物活性有重要关系。

α螺旋与β折叠 蛋白质的高级结构包括二级，三级与四级结构： 二级结构指蛋白质分子中多肽链骨架的折叠方式， 即肽链主链有规律的空间排布，一般有α螺旋结构 与β折叠形式。 α螺旋与β折叠

三级结构是指一条螺旋肽链，即已折叠的肽链在分子 中的空间构型，即分子中的三维空间排列或组合的方 式，系一条多肽链中所有原子的空间排部。 四级结构是指具有三级结构的蛋白质的各亚基聚合而 成的大分子蛋白质。

胰岛素的四级结构可以由两个以上的分子量为6000 或12000的小亚基聚合而成。 所谓亚基就是含有二条或多条多肽链的蛋白质，这 些多肽链彼此以非共价链相连，每一条多肽链都有 自己的三级结构，此多肽链就是该蛋白质分子的亚 单位（亚基）。 二条亚基的四级结构

蛋白质分子的构象又叫空间结构、 高级结构、立 体结构、 三维构象等，它是指蛋白质分子中所有 原子在三维空间中的排布。 这种空间排布的变化，仅涉及到氢键等次级键的 生成与断裂，但不涉及共价键的生成与断裂。 丰富多彩的蛋白质世界

蛋白质分子的空间结构与生物活性 蛋白质分子只有在其立体结构呈特定的构象 （conformation)时才有生物活性， 形成稳定的蛋白质分子构象的作用力有氢键、疏 水作用力（hydrophobic force)、离子键、范德华 力、二硫键与配位键。 除二硫键为共价键外，其余都是非共价键，维持 蛋白质构象是弱作用力。

维持蛋白质构象的作用力 蛋白质分子中二级结构α螺旋、 β折叠的形成依靠 氢键，可以说蛋白质分子内部布满了氢键。 蛋白质分子中二级结构α螺旋、 β折叠的形成依靠 氢键，可以说蛋白质分子内部布满了氢键。 疏水作用力也称疏水键，系两个疏水基为了避开 水相而群集在一起的作用力，在维持蛋白质三级 结构起重要作用，也是形成生物膜的主要作用 力。

范德华力对稳定和维持三级，四级结构十分重要。 离子键对于维持蛋白质四级结构是不可缺少的。不 少蛋白质含有金属离子，而金属离子是通过配位键 与蛋白质结合，故结合蛋白质是由氨基酸成分与非 氨基酸通过配位组成。 金属离子配位键

四、多肽和蛋白质的物化性质 1. 酸碱性 多肽是小分子，化学性质与氨基酸类似，含有20 个以上氨基酸残基的多肽与蛋白质没有明显界限； 多肽是小分子，化学性质与氨基酸类似，含有20 个以上氨基酸残基的多肽与蛋白质没有明显界限； 蛋白质是呈两性解离的电解质，通常在等电点时， 蛋白质的溶解度最小，不稳定，易于从溶液中沉淀 析出。 各种蛋白质分子都有自己的等电点。

2. 离子结合 蛋白质存在两性，其表面带有一定量的电荷，可 与阴离子或阳离子结合。 很多离子与蛋白质形成不溶性的盐，可作为蛋白 质的沉淀剂。

3、旋光性 多肽、蛋白质分子总体旋光性由构成氨基酸各个 旋光度的总和决定，通常是右旋，它由螺旋结构 引起。 蛋白质变性，螺旋结构松开，则其左旋性增大。 4、 紫外吸收 大部分蛋白质均含有带苯丙氨酸，酪氨酸与色氨 酸，苯核在紫外280nm有最大吸收。氨基酸在紫 外230nm显示强吸收。

5. 胶体性质 蛋白质分子量大，分子大小达到胶粒1～100nm范围。 球状蛋白质的表面多亲水基团，具有强烈地吸引水分子作 用，使蛋白质分子表面常为多层水分子所包围，称水化膜 ，从而阻止蛋白质颗粒的相互聚集。 蛋白质分子扩散速度慢，不易透过半透膜，粘度大，在分 离提纯蛋白质过程中，可利用蛋白质的这一性质除去小分 子杂质——透析(dialysis)。

五、蛋白质不稳定的原因 共价键改变引起蛋白质不稳定的化学反应有水解， 氧化和消旋化， 此外还有蛋白质的特有反应，即二硫键断裂与交换 1、蛋白质药物由于共价键破坏引起不稳定性 共价键改变引起蛋白质不稳定的化学反应有水解， 氧化和消旋化， 此外还有蛋白质的特有反应，即二硫键断裂与交换 有时几种反应同时进行 蛋白质在其等电点（IP）时一般最稳定，溶解也最少。 在蛋白质等电点相应的pH所有离子的净电荷为零， 因而减少了电荷排斥和蛋白质伸展的趋势。

(1)蛋白质水解 蛋白质可被酸，碱和蛋白酶催化水解，使蛋白质分 子断裂，分子量逐步变小，成为分子量大小不等的 肽段和氨基酸。 水解分完全水解与不完全水解。 (2)蛋白质的氧化 蛋白质中具有芳香侧链的氨基酸可以在一些氧化剂 作用下氧化。 常用氧化剂有分子氧、过氧化氢、过甲酸、 氧自由 基等。

(3)外消旋作用(racemization) 某些旋光性物质在化学反应过程中，由于不对称碳 原子上的基团在空间位置上发生转移，使D-或L-型 化合物转变为D-型和L-型各50%的混合物，彼此旋 光值抵消，失去旋光性，这种现象称为外消旋作用。 当蛋白质用碱水解时往往会使某些氨基酸产生消旋 作用。

(4) 二硫键及其交换 二硫键（-S-S-）又叫二硫桥或硫硫桥，是很强的化 学键。 它是由两个半胱氨酸侧链上的疏基（-SH） 脱氢相连而成。 二硫键把同一肽链或不同肽链（肽链间）的不同部 分连接起来，对稳定蛋白质的构象起重要作用。 蛋白质分子中二硫键的数目愈多，则结构稳定性和 抗拒外界因素的能力也愈强。 蛋白质分子中二硫键断裂接着重排能够改变蛋白质 的三级结构，因此影响其生物活性。

2 、由非共价键引起的不稳定性 引起蛋白质不可逆失活作用的三种主要类型 聚集（aggregation)，宏观沉淀和表面吸附与蛋白质 变性， 这些都是由于与空间构象有关的非共价键引起。 非共价的静电力、氢键、疏水的相互作用以及蛋白 质的水化，可以因温度于pH而发生改变。

蛋白质的不可逆失活，一般以自然状态开始可逆的伸 展，随着温度的增加，溶液中的蛋白质分子在熔融温 度(Tm)从天然的状态转变为伸展状态。 溶液pH可以影响静电的相互作用。 Tm为50%分子伸展时的温度。

蛋白质聚集(凝集，aggregation)是蛋白质分子结合 的微观过程。 (1)蛋白质的聚集与沉淀 蛋白质聚集(凝集，aggregation)是蛋白质分子结合 的微观过程。 蛋白质沉淀(precipitation)指可见蛋白质颗粒的生成。 不可逆的聚集往往是由于蛋白质伸展所致。 蛋白质溶液振摇可以导致聚集与沉淀， 这是由于空气氧化，界面变性，吸附于容器 或机械应力所致。

(2)蛋白质的吸附 蛋白质和多肽吸附于容器、滤器或输液系统材料的 表面， 当蛋白质溶液浓度较低时，由于吸附药物损失相对 就较高。

(3)蛋白质的变性 蛋白质在受到一些物理因素或化学试剂影响会导致 蛋白质性质发生变化， 破坏蛋白质分子三维结构有关氢键及其他弱键(二级结构以上的高级结构的破坏)，导致蛋白质生物活性的丧失(抗原性改变，生物功能丧失)同时还伴随一些物化常数的变化。 如发生溶解度的降低、旋光值改变、 光吸收系数的增大、粘度改变、 聚集，沉淀等。 但蛋白质的一级结构即肽键没有被破坏, 这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。

天然蛋白质的严密结构在某些物理或化学因素作用下 ，其特定的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变 和生物学活性的丧失，如酶失去催化活力，激素丧失 活性，称之为蛋白质的变性作用(denaturation)。 变性蛋白质和天然蛋白质最明显的区别是溶解度降低

具有呈现全部生物功能所需要的精确的构象。 蛋白质的变性也可以说是从肽链的折叠（refolding)状态变 到伸展（unfolding)状态。 天然蛋白质在体内条件下， 具有呈现全部生物功能所需要的精确的构象。 变性作用是天然蛋白质分子结构的松解， 即由原来有规则，紧密结构变成 无规则，松散结构。

盐析 当变性程度较轻时，如去除变性因素，有的蛋白质 仍能恢复或部分恢复其原来的构象及功能，变性的 可逆变化称为复性。 变性可以分可逆变性和不可逆变性。 当变性程度较轻时，如去除变性因素，有的蛋白质 仍能恢复或部分恢复其原来的构象及功能，变性的 可逆变化称为复性。 盐析

影响蛋白质变性的因素 ①温度的影响： 蛋白质在50~60°C的溶液中，经过一定时间，往往 发生变性。 有些蛋白质热变性是可逆的，有些是不可逆的。 不可逆热变性往往发生沉淀和聚集现象。 一般来说，热变性仅涉及非共价键的变化。

脱水 ③有机溶剂的影响： 大多数蛋白质水溶液在加入一定量的有机溶剂后蛋 白质就开始析出沉淀。 ②pH对蛋白质构象的影响： 大多数蛋白质水溶液在加入一定量的有机溶剂后蛋 白质就开始析出沉淀。

④盐的影响：盐对蛋白质构象稳定性的影响是很复 杂的。 蛋白质水溶液中加入少量无机盐会增加蛋白质表面 负荷，增强蛋与水的作用从而使蛋白质在水中溶液 度增大，这种现象称为盐溶（salting in)。 在高盐浓度情况下，本来与蛋白质结合的自由水与 盐解离产生的离子进形配位，蛋白质表面水层被破 坏，最终导致蛋白质之间的相互作用增加而发生聚 集，这种现象叫盐析（salting out)。

⑤ 表面活性剂对蛋白质构象的影响： 长链的脂肪酸（如月桂酸）或相应的表面活性剂 （如十二烷基硫酸钠）很容易与蛋白质反应， 常常引起蛋白质解离，在很低的浓度下，就能引 起蛋白质变化。

五、多肽或蛋白质类药物共性特点 1．蛋白质或多肽类药物大多为内源性物质，临床使用剂 量小，药理活性高，副作用小，很少有过敏反应； 1．蛋白质或多肽类药物大多为内源性物质，临床使用剂 量小，药理活性高，副作用小，很少有过敏反应； 2．蛋白质或多肽类药物稳定性差，在酸碱环境或体内酶 存在下极易失活； 3．蛋白质或多肽类药物分子量大，还时常以多聚体形式 存在，很难透过胃肠道粘膜的上皮细胞层，故吸收很少， 不能口服给药，一般只有注射给药一种途径； 4．蛋白质或多肽类药物体内生物半衰期较短，从血中消 除较快，因此在体内的作用时间较短，往往不能充分发挥 其作用。

六、多肽、蛋白质类药物的评价方法 1、液相色谱法 液相色谱法是评价蛋白质的纯度与稳定性有力的工具。 在蛋白质分析中通常采用反相高压液相色谱法RP-HPLC、 离子交换色谱IEC与分子排阻色谱SEC。 反相色谱是以非极性固定相与含水的极性流动相为基础的 分析方法。 应用反相HPLC，由于有机溶剂，疏水的相互作用及分离 时所用低pH值，会使蛋白质变性。 然而该方法对几种蛋白质特别有用，并被广泛地用于胰岛 素制剂的质量分析。

2、光谱法 通过对蛋白质吸收、辐射、散射光的定量分析可以提供有价 值的信息，了解蛋白质的量、构象和聚集倾向。 通过对蛋白质吸收、辐射、散射光的定量分析可以提供有价 值的信息，了解蛋白质的量、构象和聚集倾向。 用于评价蛋白质药物的光谱方法有紫外可见吸收光谱UV 、 旋光色散ORD、圆二色谱CD、荧光、红外IR和拉曼Raman 光谱。 紫外吸收常用于测定溶液中蛋白质的浓度。 光散射可用测定制剂中蛋白质的聚集数量， 散射强度是单位体积散射中心数的函数。

3、电泳 电泳技术是根据在电场的作用下，蛋白质在载体凝胶上产生 特征性迁移，迁移率是所带净电荷和它的大小函数，以此来 分离混合蛋白质。 在蛋白质的分析中广泛使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯胺凝胶 电泳（SDS-PAGE），等电点聚焦(isoclectric focusing，IEF) 和毛细管电泳（EC）法。 SDS-PAGE电泳用于测定蛋白质亚单位组成和分子量。 EC优点是：分辨率高、灵敏度高、分析时间短、易于自动 化。

4、生物活性测定与免疫测定 生理活性检测是利用体内模型或体外组织或细胞对活性蛋 白质多肽的特异生物学反应，通过剂量(或浓度)效应曲线 进行定量（绝对量或比活性单位）。 用理化方法代替生物活性测定时，需建立两种方法之间的 相关性。 免疫测定优点是可用于定量化学分析不能检测的情况。

第二节 多肽类药物 某些分子量较小的多肽具有类似蛋白质的活性, 且功能更显著。这类多肽称为多肽药物。现已为新药的研制和开发提供了一个新的途径。

二肽（dipeptide）：2 amino acid residues —— 由两个以上氨基酸通过酰胺键连接起来的化合物。 二肽（dipeptide）：2 amino acid residues 寡肽（oligopeptide ）：2~10 amino acid residues 多肽（polypeptide ）：> 10 amino acid residues 多肽

一个氨基酸的氨基 与另一个氨基酸的 羧基之间失水形成 的酰胺键称为肽键 （Peptide band)

19.2.1多肽的结构 在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排 列顺序称为氨基酸顺序 通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨 基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为 羧基端或C-端。 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸开始，以C-端氨基酸 为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln

多肽的命名

命名以C-端氨基酸为母体 丝氨酰-甘氨酰-色氨酰-丙氨酰-亮氨酸

一、多肽药物的生理功能 提高免疫力 1 抗衰老 2 预防心脑血管疾病 3 4 改善消化系统，调节神经系统等

1、提高免疫力 免疫力低下的身体极易招致细菌、病毒、真菌等感染。因此免疫力低下最直接的表现就是容易生病。体质虚弱、营养不良、精神萎靡等表现。每次生病都要很长时间才能恢复，而且常常反复发作。

2、抗衰老 多肽药物能够消除体内多余自由基。 生物体是一个不稳定的化学体系，体内的自由基通过氧化作用攻击生物大分子物质，导致组织细胞内DNA、蛋白质、脂膜的损伤，加速机体老化。 多肽药物能够消除体内多余自由基。

3、预防心脑血管疾病 生物活性肽能够防治血栓、高血脂、高血压。

4、改善消化系统，调节神经系统。 活性多肽治疗慢性胃肠道疾病。 在生物体内作为神经递质，传递信息。

二、多肽药物的特点 多肽的分子量比蛋白质小，又比氨基酸的 大。蛋白质结构复杂，人体不易吸收和利 用，减弱了其活性和生理功能。与之相比 ，多肽，特别是小肽、寡肽具有极强的活 性和多样性。

1、多肽药物主要类型 多肽抗生素 细胞因子模拟肽 抗病毒多肽 多肽药物 抗肿瘤多肽 用于心血管疾病的多肽 多肽导向药物 诊断用多肽 多肽疫苗

多肽抗生素 多肽抗生素是指分子量在10kDa以下，具有某 种抗菌活性的多肽类物质。特点： 以物理的方式作用于细菌细胞膜，使细胞膜穿孔， 细胞质外溢而达到杀菌的目的。膜通道的形成能力 对抗菌肽的活性起决定性作用。 只对原核生物细胞产生特异性的溶菌活性，对最低 等的真核生物及某些植物的原生质体、某些肿瘤细 胞等也有一定的杀伤力，而对人体正常的细胞无损 伤作用。

多肽抗生素的作用机制 抗菌活性 免疫活性 抗氧化作用 结合矿物质 杀虫、抗病毒作用

多肽疫苗 多肽疫苗是按照病原体抗原基因中已知或预测的某段抗原 表位的氨基酸序列，通过化学合成技术制备的疫苗。 多肽疫苗是按照病原体抗原基因中已知或预测的某段抗原 表位的氨基酸序列，通过化学合成技术制备的疫苗。 传统疫苗一般由两种方式制备，一种为能诱发免疫力却不 致病的减毒疫苗，例如黄热病、脊髓灰质炎和麻疹疫苗或 卡介苗；另一种为灭活疫苗（例如百日咳杆菌、狂犬病毒 、伤寒杆菌）。 从丙肝病毒(HCV)外膜蛋白E2内筛选出一种多肽，它可刺激 机体产生保护性抗体；疟疾多价抗原多肽疫苗；宫颈癌、 人乳头瘤病毒多肽疫苗已进入II期临床试验。

抗病毒多肽 病毒通过与宿主细胞上的特异受体结合吸附细胞，依赖 其自身的特异蛋白酶进行蛋白加工及核酸复制。 病毒通过与宿主细胞上的特异受体结合吸附细胞，依赖 其自身的特异蛋白酶进行蛋白加工及核酸复制。 从肽库内筛选与宿主细胞受体结合的多肽，或能与病毒 蛋白酶等活性位点结合的多肽，用于抗病毒的治疗。 加拿大、意大利等国家已从肽库内筛选到很多具有抗病 毒性的小肽，有些小肽已进入临床试验阶段。

多肽导向药物 很多毒素(如绿脓杆菌外毒素)、细胞因子(如白细胞介素系 列)等有较强的肿瘤细胞毒性，但在人类长期或大量使用量 时也可损伤正常细胞。将能和肿瘤细胞特异结合的多肽与这 些活性因子进行融合，则可将这些活性因子特异性地集中在 肿瘤部位,可大大降低毒素、细胞因子的使用浓度，降低其 副作用。

抗肿瘤多肽 肿瘤的发生是多种因素作用的结果，但最终都要涉及癌基 因的表达调控。 肿瘤的发生是多种因素作用的结果，但最终都要涉及癌基 因的表达调控。 很多与肿瘤相关的基因以及对肿瘤产生作用的调控因子， 筛选与这些基因及与调控因子特异结合的多肽，已成为寻 找抗癌药物的新热点。 生长抑素已用于治疗消化系统内分泌肿瘤；美国学者发现 了一个能在体内显著抑制腺癌的六肽；瑞士科学家发现一 个能诱导肿瘤细胞凋亡的八肽

多层次多阶段激发抗肿瘤免疫 增强提呈肿瘤抗原 阻碍肿瘤新生血管网络的建立 干扰肿瘤细胞DNA 合成及抑制肿瘤细胞增殖 参与调控细胞周期 参与诱导细胞凋亡 抑制组蛋白去乙酰化 靶向泛素-蛋白酶体通路

细胞因子模拟肽 利用已知细胞因子的受体从肽库内筛选细胞因子模拟肽， 近年成为国内外研究的热点。 利用已知细胞因子的受体从肽库内筛选细胞因子模拟肽， 近年成为国内外研究的热点。 国外已筛选到了人促红细胞生成素，人促血小板生成素， 人生长激素、人神经生长因子及白细胞介素1等多种生长 因子的模拟肽,这些模拟肽的氨基酸序列与其相应的细胞 因子的氨基酸序列不同，但具有细胞因子的活性，并且具 有分子量小的优点。

用于心血管疾病的多肽 很多植物中药有降血压、降血脂、溶血栓等作用，不仅可 用作药物，亦可用作保健食品。 很多植物中药有降血压、降血脂、溶血栓等作用，不仅可 用作药物，亦可用作保健食品。 我国科学家从大豆内加工分离出的活性小分子多肽，可通 过小肠直接吸收，能防治血栓，高血压和高血脂,还能延 缓变老,提高肌体肿瘤力。 从人参、茶叶、银杏叶等植物内也分离出很多用于心血管 疾病的小肽。

抗高血压肽 抗高血压肽主要是通过抑制血管紧张素Ⅰ转换酶，进而影 响肾素-血管紧张素-醛固酮系统来实现对血压的影响。 抗高血压肽主要是通过抑制血管紧张素Ⅰ转换酶，进而影 响肾素-血管紧张素-醛固酮系统来实现对血压的影响。 血管紧张素转化酶（ACE）在血压调节过程中起着非常重要 的作用，人体的肾脏可以分泌肾素，作用于血管紧张素原 释放出无活性的血管紧张素Ⅰ，ACE可以从无活性的血管紧 张素Ⅰ的C-末端水解掉两个氨基酸，形成有活性的血管紧 张素Ⅱ，血管紧张素Ⅱ是已知最强的缩血管物质之一，可 引发高血压。同时ACE可水解血管舒缓激肽使其失活，而血 管舒缓激肽可以舒张血管，使血压降低。

抗血栓肽 水蛭素是迄今为止发现的凝血酶最强的天然抑制剂，天然水 蛭素是由65 个氨基酸组成的小肽，对凝血酶有很高的亲和 性，从而使凝血酶失去水解纤维蛋白原为纤维蛋白的能力， 阻止纤维蛋白的凝固，阻止凝血酶催化的止血反应及凝血酶 诱导的血小板反应，达到抗凝的目的。 从北美水蛭中发现，是一种由39个氨基酸残基组成的多肽， 其本身的RGD序列（Arg-Gly-Asp）竞争性的抑制纤维蛋白原 与血小板表面的受体GPⅡb/Ⅲa的结合，从而具有抗血小板 聚集的功能，可阻断血栓的最终形成。

诊断用多肽 多肽在诊断试剂中最主要的用途是用作抗原检测病毒、细 胞、支原体、螺旋体等微生物和囊虫、锥虫等寄生虫的抗 体，多肽抗原比天然微生物或寄生虫蛋白抗原的特异性强 ，且易于制备，因此装配的检测试剂，其检测抗体的假阴 性率和本底反应都很低，易于临床应用。 现在用多肽抗原装配的抗体检测试剂包括：甲、乙、丙、 庚或肝病毒、艾滋病病毒、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒 、风疹病毒、梅毒螺旋体、囊虫、锥虫、莱姆病及类风湿 等。使用的多肽抗原大部分是从相应致病体的天然蛋白内 分析筛选获得，有些是从肽库内筛选的全新小肽。

其它药用小肽 小肽药物除在上述几大方面已取得较大进展外,在其它很 多领域也取得一些进展。比如stiernberg等发现一个合成 肽(TP508) 肽能促进伤口血管的再生，加速皮肤深度伤口 的愈合。Pfister等发现一个小肽(RTR)4能防止碱损伤角 膜内炎症细胞的侵润,抑制炎症反应。 Carron等证实其筛 选的2个合成肽能抑制破骨细胞对骨质的重吸收。 免疫活性肽主要通过对淋巴细胞功能的调节，对抗体生成 的影响，对单核巨噬细胞功能的影响，对细胞因子分泌的 调节，以及通过影响淋巴细胞钙离子转导、第二信使NO、 cAMP和cGMP的活性等方式调节机体的免疫功能。

2、多肽药物研究中的难点 多肽药物主要通过降解排泄以及受体介导的内吞 等作用在体内被清除，其中分子量小于20KDa的 多肽在代谢时易肾小球滤过；通过肾小管时又被 其中蛋白酶部分降解并从尿中排出。因而半衰期 短。

为维持一定的疗效，需要大剂量反复用药，长期频繁注射 给患者带来痛苦，而且易引发一系列副反应。 多肽的稳定性不好

解决途径有以下几点： 定点突变 通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能 增加多肽稳定性的残基, 可提高多肽稳定性。 化学修饰 多肽的化学修饰方法很多, 研究最多的是聚乙二醇( PEG) 修饰 添加剂 通过加入添加剂, 如糖类、多元醇、明胶、氨基酸和某 些盐类, 可提高多肽稳定性。 冻干 多肽发生的一系列化学反应如脱酰胺、β- 消除、水解 等都需要水参与, 水还可作为其他反应剂的流动相。另外, 降低水分含量可使多肽的变性温度升高, 因此, 冻干可提高 多肽稳定性。

3、多肽药物研究进展 化学修饰 基因融合 点突变 制剂改造 近几年各国学者主要从以下方面方面着手进行长 效多肽药物的研发。 增加多肽药物半衰期

生物技术的发展极大促进了多肽药物的研制开发 ，目前已有40种以上重要治疗药物上市，720 多种生物技术药物正进入临床试验或FDA审评， 其中200种以上的药物进入最后的批准阶段。

4、我国多肽类药物的发展方向 1）开发新的多肽类药物资源 1.1 动物脏器等的进一步综合利用在动物的脏器、组织内含 有难以计数的不同类别的活性肽类物质，每种物质都具有特 定的生理功能或活性。 1.2 植物资源的充分利用由植物来源的活性多肽目前已引起 人们的关注。 1.3 昆虫多肽的开发昆虫是世界上最大的生物种群，除海洋 之外，几乎所有的生态环境都有昆虫存在。 1.4 海洋生物资源的利用海洋是一个蕴藏着许多生物活性物 质的宝库。 1.5 微生物资源的利用微生物种类难以计数，不同种类的微 生物代谢各异，因此微生物是产生生物活性物质的源泉，包 括活性肽，如在临床上广泛使用的免疫抑制剂环孢素就是微 生物产生的多肽。

2 ）利用现代生物技术进行多肽类药物的生产和改进 2.1 新型活性肽突变体的研究：为了改变天然活性肽的某 些性质，通过基因定位突变的手段对其结构进行改造。 2.2 融合多肽的研究：水蛭素12肽/尿激酶融合蛋白，具有 溶栓和抗栓的双重功能；穿膜肽HIV-Tat49-57/CTL 表位 融合多肽疫苗，穿膜肽HIV-Tat49-57可将人黑色素瘤分 化抗原MART-1 的HLA-A2 限制性CTL 表位多肽携带进入 活细胞；作用于HIV包膜蛋白亚基gp41的多肽类融合抑制 剂，具有抑制HIV 与靶细胞融合的活性等。 2.3 克隆天然活性肽基因、重组表达新的多肽类药物：克 隆天然活性肽基因、重组表达新的多肽类药物仍将是多肽 类药物产业化的主要方向之一。 2.4多肽表面展示技术：它使表达的外源肽以融合蛋白的形 式展现在噬菌体或细胞表面，其总体称为表面展示库。

2.5 利用酶工程生产多肽类药物。采用酶工程生产的多肽类 药物需通过固定化动物细胞来降低生产成本，这对于通过酶 解蛋白质以生产活性肽的产业降低生产成本非常重要。 2.6 利用植物细胞工程开发研制多肽类药物。近年来从植物 中获得天然活性多肽成为多肽类药物的一个新的重要来源， 随着植物基因工程的发展，以植物细胞培养技术为基础生产 天然的多肽类药物,特别是稀有植物产生的活性肽大有可为 。

2.7 利用转基因动植物生产多肽类药物。利用转基因动植 物生产多肽类药物生产多肽类药物产量高，成本低，利用 无土培养植物的根分泌表达活性多肽值得重视。 2.8 利用组合化学与药物高通量筛选相结合的技术开发多 肽类药物。组合化学技术使一次合成成千上万的多肽成为 可能，药物高通量筛选又可从成千上万的化合物中快速筛 选出具有特殊生物活性的化合物。将组合化学技术与药物 高通量筛选技术相结合，仍将是多肽类药物开发的重要途 径。

3）多肽类药物的新剂型和新型给药系统的研制 多肽类药物相对分子质量较大，脂溶性差，难以透过生物 膜，一般只能注射给药。 因此，非注射剂型的研制也是我国多肽类药物寻求创新的 一条出路。多肽类药物非注射途径可以分为肺部途径、黏 膜途径(鼻腔黏膜、口腔黏膜等)、透皮途径、口服途径等 ，每一种给药途径均需要研制与之相适应的制剂或给药系 统。

4）多肽类药物的化学修饰 将多肽与生物可降解的高分子可溶性化合物通过一定化学 手段结合成复合物，可赋予多肽类药物一些新的优良性能 ，如：免疫原性降低或消失、不良反应减少；循环的半衰 期延长；专属性强；物理、化学及生物稳定性增强。 通常选用的高分子化合物有右旋糖酐、清蛋白、聚乙二醇 (PEG)等，其中以PEG最为常用。通过对原来的多肽类药物 进行化学修饰不失为一种有效的改进方法，将成为我国多 肽类药物今后发展的一个途径。

5）新的适应症的发现 对于多肽类药物新的适应症的研究也很重要。有些多肽类 药物具有广泛的生物活性，但由于研究不够深入，往往只 利用其某一方面，而忽略了其他方面的作用或视为副作用 。因此，对多肽类药物多种药理作用的研究利用，也是今 后开发值得进行的工作。

三、多肽类药物的制备方法 多肽类化合物在自然界中广泛存在，天然产物中已知的活 性多肽主要是由分泌细胞、内分泌腺组织、体液或胞质中 产生获得的。 体外可通过基因工程、噬菌体展示技术或人工化学合成的 方法获得。

1.天然多肽类药物制备方法 在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚 单位。 在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚 单位。 但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。 这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。 如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽； 蛇毒多肽等。

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Leu-脑啡肽

天然多肽类药物制备一般流程 生物材料的选择与前处理 组织或细胞的破碎 提取 脱盐 冻干

多肽类物质种类繁多，实际的分离和纯化工作需要根据 其各自不同的理化性质选择不同的纯化方法，常用的包 括冻融法、酶解法、盐析法、超滤法、有机溶剂沉淀法 、等电点沉淀法、高效液相色谱、分子排阻色谱、离子 交换色谱、亲和层析、疏水层析、毛细管电泳等。 红外光谱、质谱、核磁共振、圆二色谱法以及氨基酸序 列分析等方法可对多肽结构进行分析。

2.多肽类药物的化学合成 多肽的合成是50年代开始，在有机溶剂中进行的均相反应 ，因此叫作液相合成法，此法在合成分子量不太大的多肽 时是比较成功的，但在合成更大的蛋白质时，产物还不能 表现出全部活力且不能结晶。 1962年建立的固相合成的新方法，对小肽的合成是很成功 的，对大分子的合成，如124肽的核糖核酸酶，还不能达 到天然物质的全部活力。 目前试图合成大的蛋白质以及建立快速简便的合成方法是 多肽合成化学的特征。

在多肽合成中，一般需要以下几个主要步骤： ①氨基保护和羧基活化； ②羧基保护和氨基活化； ③接肽和除去保护基团。 1）基团保护 要实现控制多肽合成，如N-末端氨基酸残基的自由-NH2、C-末端氨基酸残基的自由-COOH以及侧链上的一些活泼基团，加以封闭或保护。待肽链形成之后，再将保护基除去。作为保护基，必须既能在接肽时起到保护作用，在接肽以后，能很容易地除去，且不致引起肽链的断裂。

应用最多的氨基保护剂是苄氧羰酰氯（Cbz-Cl），可用催化氢化法或钠氨法（用金属钠在液氨中处理）除去保护基，也可用叔丁氧羰酰氯（BOC-Cl）作保护剂，用稀盐酸或乙酸在室温除去保护基。 羧基保护剂通常用无水乙醇或甲醇在盐酸存在下进行酯化，使羧基接上烷基。除去保护基可在常温下用氢氧化钠皂化法。 有些氨基酸还有其他功能基团，在合成肽时，都要用适当的保护基团加以保护。例如组氨酸的咪唑基、丝氨酸的羟基、酪氨酸的酚基、半胱氨酸的巯基等，都可用苄基（—B2）保护，用钠氨法除去。谷氨酸和天门冬氨酸的β－及γ-羧基可用β-及γ-苯甲酯保护，用催化氢化法除去。精氨酸的胍基用对甲基磺酰基（Tos-）保护。

2）多肽的液相合成法 接肽反应除用缩合剂来完成外，还可以用分别活化参与形成肽链的氨基和羧基的方法来完成。因活化氨基的反应激烈，而且常常产生消旋化，所以，总是采用羧基活化的方法，合成肽的常规方法是从C-端向N-端进行。 肽的合成法可分为阶梯伸长法和片断缩合法。阶梯伸长法是将带有R-O-CO-型保护基的氨基酸（不是肽）的羧基活化，从肽的C-端开始每次接上一个氨基酸，逐步递增的办法。这是合成比较小的肽或肽段常采用的方法。片断缩合法是由小肽缩合成大肽的方法，为了避免消旋，常用叠氮法接肽。

3）片断缩合法 由小肽合成大肽时常用叠氮法，因叠氮法有较好的产品光 学纯度（不消旋）。 由小肽接成大肽时，为了保证光学纯度，应尽量利用Gly 和Pro这两个氨基酸的C-末端接肽。

4）多肽的固相合成法 在固相合成中，肽链的延长是在不溶性的聚苯乙烯树脂载体上进行的。合成多肽的C-末端先和氯甲基聚苯乙烯树脂（氯化苄酯树脂）反应形成苄酯，然后按肽链一级结构的顺序将氨基端已被保护的氨基酸逐个加上去，使肽链延长。 固相法比液相法操作简便，时间缩短，可以自动化。在我国医药工业用。人工合成催产素、促黄体生成素释放因子（LRH），不仅产量高，而且比天然产品好。

四、重要的多肽类药物制备方法 3.黄海葵毒素 4.降钙素（Calcitonin， CT） 1. 胸腺素（thymocin) 2.表皮细胞生长因子（EGF） 3.黄海葵毒素 4.降钙素（Calcitonin， CT）

1. 胸腺素（thymocin)

1）结构与性质 胸腺素组分5是由80℃热稳定的40～50种多肽组成的 混合物，分子量在1000～15000之间，pI为3.5～9.5。 2）用途 原发性和继发性免疫缺陷病，如反复上呼吸道感染; 自身免疫性疾病，如肾病、红斑狼疮、类风湿关节炎、重 症肌无力;变态反应性疾病，如支气管哮喘；细胞免疫功 能减退的中老年人和老年人疾病，并可抗衰老；肿瘤的辅 助治疗。

3）生产工艺—提取法

4）工艺工程控制要点 （1）提取：匀浆、 14000×g 离心 （2）加热去杂蛋白：80℃加热15min （3）沉淀： 丙酮粉（ -10℃，低温有机溶剂沉淀法）得组分3 （4）分段盐析： 先加低饱和度的盐→去杂蛋白，得组分4→再提高饱和 度→沉淀目标物得组分5 （5）超滤： 关键是选择超滤膜（根据分子量选），取分子量在 15000以下的超滤液。 （6）脱盐、干燥： 超滤液经Sephadex G-25脱盐后，冷冻干燥

5）生产工艺—固相合成法

2.表皮细胞生长因子 1962年从中提取出一种多肽能直接刺激表皮的生长和角化，故命名为表皮生长因子（EGF）。 EGF分子量为6.2KD,等电点 pH4.5 。 EGF能促进细胞的增殖;实验证明EGF对体外培养的细胞的增殖刺激作用不限于上皮细胞，其作用是广谱的。

3.黄海葵毒素 海洋生物中有许多含有多肽或蛋白质毒素往往具有特殊的 药物功能。如海葵毒素等的强心功能，棘皮、软体等动物 的抗癌肽的抗癌功能等。 黄海葵强心肽就是其中一种。人们已从黄海葵中分离出具 有强心作用的黄海葵强心肽A、B、C。 AP—A由49个氨基 酸组成，Mr为5500，属碱性多肽。

4. 降钙素（Calcitonin， CT） （1）结构和性质 降钙素分子量约3500，溶于水和碱性溶液，不溶于丙酮、乙醇、氯仿、乙醚、苯、异丙醇及四氯化碳等，难溶于有机酸。水溶液中2~7℃ 可保存7天。 降钙素在人及哺乳动物体内，主要存在于甲状腺、甲状旁腺、胸腺和肾上腺等组织中，鱼类则在鲑、鳗、鳟等的终鳃体里含量较多。各种不同动物来源的降钙素，氨基酸排列顺序有些差异。

（2）生产工艺 制造降钙素的原料主要有猪甲状腺和鲑、鳗的心脏或心包膜。用化学合成和基因工程技术制备降钙素已获成功。 工艺路线：

3）工艺过程 提取、分离、精制： 制丙酮粉、离心与过滤（工业考虑）、离子洗脱分离。 4）作用与用途 降钙素的主要功能是降低血钙。由于降钙素有抑制破骨细胞活力的作用，所以能抑制骨盐的溶解吸收，从而阻止钙从骨中释出。 血钙高可促使降钙素分泌增加，使血钙降低，血钙低时可促使甲状旁腺素分泌增加而使血钙升高，两者互相制约，共同维持血钙平衡。

第三节 蛋白质类药物

一、概述 蛋白质类药物指用于预防、治疗和诊断的蛋白质类物质生物药物。  一、概述 蛋白质类药物指用于预防、治疗和诊断的蛋白质类物质生物药物。 鉴于一些蛋白质和多肽生化药物有一定的抗原性、容易失活、在体内的半衰期短、用药途经受限等难以克服的缺点，对一些蛋白质生化药物进行结构修饰、应用计算机图像技术研究蛋白质与受体及药物的相互作用、发展蛋白质工程及设计相对简单的小分子来代替某些大分子蛋白质类药物，并且起到增强或增加选择性疗效的作用等，已成为前瞻性的重要任务之一。

主要蛋白质类药物有以下几类： 1、蛋白质激素 2、血浆蛋白质 3、蛋白质类细胞生长调节因子 4、粘蛋白 5、胶原蛋白 6、碱性蛋白质 7、蛋白酶抑制剂 8、植物凝集素

蛋白质激素 垂体蛋白质激素 生长素（GH）、催乳激素（PRL）、促甲状腺素（TSH）、促黄体生成激素（LH）、促卵泡激素（FSH） 促性腺激素 人绒毛膜促性腺激素（HCG）、绝经尿促性腺激素（HMG）、血清性促性腺激素（SGH） 胰岛素及其他 胰岛素、胰抗脂肝素、松弛素、尿抑胃素 血浆蛋白质 白蛋白、纤维蛋白溶酶原、血浆纤维结合蛋白（FN）、免疫丙种球蛋白、抗淋巴细胞免疫球蛋白、Veil’s病免疫球蛋白、抗－D免疫球蛋白、抗－HBs免疫球蛋白、抗血友病球蛋白、纤维蛋白原、抗凝血酶Ⅲ、凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ

蛋白质类细胞 生长调节因子 干扰素α、β、γ（IFN）,白细胞介素1～7（IL），神经生长因子（NGF），肝细胞生长因子（HGF），血小板衍生的生长因子（PDGF），肿瘤坏死因子(TNF)，集落刺激因子(CSF)， 组织纤溶酶原激活因子(tPA)，促红细胞生成素(EPO)，骨发生蛋白（BMP）。 粘蛋白 胃膜素、硫酸糖肽、内在因子等。 胶原蛋白 明胶、阿胶等 碱性蛋白质 硫酸鱼精蛋白 蛋白酶抑制剂 胰蛋白酶抑制剂 凝集素 PHA、ConA

二、蛋白质类药物的制备方法 蛋白质类药物的提取分离与纯化法 蛋白质的化学合成法 基因工程法

（一)蛋白质类药物的分离与纯化 1、生物材料的选择 选择原则： 材料来源丰富易得； 有效成分含量高； 制备工艺简单，难于分离的杂质少；   （一)蛋白质类药物的分离与纯化 1、生物材料的选择 选择原则： 材料来源丰富易得； 有效成分含量高； 制备工艺简单，难于分离的杂质少； 成本低经济效益好的生物材料或微生物材料为原料。 材料选定后，必须尽量保持新鲜，尽快加工处理，否则冷冻保存。 对天然蛋白质类药物，为提高质量、产量和降低生产成本，对原料的种属、发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞都有一定的要求，了解这可使分离纯化工作事半功倍。

（1）种属：牛胰含胰岛素单位比猪胰高，牛为4000IU／kg胰 脏，猪为3000IU／kg胰脏。抗原性猪比牛的低。前者与人胰岛 素相比，只有1个氨基酸的差异，而牛有3个氨基酸的差异。 （2）发育生长阶段：幼年动物的胸腺比较发达，老龄后逐渐 萎缩，因此胸腺原料必须采自幼龄动物。 HCG在妊娠妇女60～70天的尿中达到高峰；到妊娠18周已 降到最低水平。然而HMC必须从绝经期的妇女尿中获取。 肝细胞生长因子是从肝细胞分化最旺盛阶段的胎儿、胎猪 或胎牛肝中获得的。若用成年动物，必须经过肝脏部分切除手 术后，才能获得富含肝细胞生长因子的原料。

（3）生物状态：动物饱食后宰杀，胰脏中的胰岛素含量增加， 对提取胰岛素有利，但胆囊收缩素分泌使胆汁排空，对胆汁 的收集不利。严重再生障碍性贫血症患者尿中的EPO含量增加。 （4）原料来源：血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪颚下腺中提 取，而稳定性以颚下腺来源为好，因其不含蛋白水解酶。 （5）原料解剖学部位 猪胰脏中，胰尾部分含激素较多，而 胰头部分含消化酶较多。如分别摘取则可提高各产品的收率。 胃膜素以采取全胃粘膜为好，胃蛋白酶则以采取胃底部 粘膜为好，因胃底部粘膜富含消化腺。

（6）对生物技术产品宿主菌或细胞的要求 选择生物技术产品的宿主受体菌或细胞也应考虑到后处 理的问题。大肠杆菌表达，由于其不能将所表达的蛋白质分 泌到体外，故提取时必须破壁，增加了提取的困难，而且还 可能含有毒素类有害因子。 用枯草杆菌或酵母菌作宿主菌，虽可解决这一矛盾，但 表达的蛋白质成分仍有缺乏糖基化等翻译及修饰的缺陷； 用动物细胞和昆虫细胞表达则能比较好地解决后处理及 完整表达的问题。 用肿瘤细胞作宿主细胞制成的医药产品还应考虑到其安 全性问题。

2、生物材料前处理--组织或细胞的破碎 机械法 工业上常用的有绞肉机，刨胰机，球磨机、磨粉 机。实验室常用的有匀浆机，研钵，高速组织捣碎机。 机械法 工业上常用的有绞肉机，刨胰机，球磨机、磨粉 机。实验室常用的有匀浆机，研钵，高速组织捣碎机。 物理法 压榨法、高压法和减压法，渗透压法；超声波法； 反复冻融法。 化学法 用稀酸、稀碱、浓盐、有机溶剂或表面活性剂处 理细胞，可破坏细胞结构释放出内容物。 酶解法 用外来酶处理生物材料。 动物组织/植物种子/叶片等一般使用高速组织到捣碎机；植物细胞具有坚硬的细胞壁，一般先用纤维素酶处理，细菌细胞先用溶菌酶处理，然后用超声波振荡/高速挤压或冻融交替等方法破碎。

3、提取 利用制备目的物的溶解特性，将目的物与细胞的固形 物成分或其它结合成分分离，使其由固相转入液相或从细 胞生理状态转入特定溶液环境的过程。 生理活性物质易失活与降解，采集时必须保持材料的新鲜。防止腐败、变质与微生物污染。如胰脏采摘后要立即速冻，防止胰岛素活力下降。          保存生物材料的主要方法有速冻、冻干、有机溶剂脱水，制成丙酮粉，或浸存于丙酮与甘油中等。

影响提取收率的因素 温度 酸碱度 溶剂 离子强度 表面活性剂

4、蛋白质溶液的浓缩方法 盐析浓缩 有机溶剂沉淀浓缩 葡聚糖凝胶（Sephadex）浓缩 聚乙二醇透析浓缩 超滤浓缩 真空减压浓缩与薄膜浓缩

5、分离纯化方法的选择 (1)分离纯化的早期使用方法的选择 (2)各种分离纯化方法的使用程序 (3)分离纯化后期的保护性措施 特点：提取液中的物质十分复杂，目的蛋白浓度较稀。 方法选择原则：低分辨能力到高分辨能力，而且负荷量较大为合适。 (2)各种分离纯化方法的使用程序 原则：相同性质的纯化方法一般不重复使用。纯化方法顺序先后的 安排上要考虑到有利于减少工序，提高效率。 (3)分离纯化后期的保护性措施 (4)对每一步骤方法的优势进行综合评价 每一个分离纯化步骤方法的好坏，除了从分 辨本领和重现性二方面考虑外，还注意方法本身 的回收率的高低。

6、纯化方法选择指南

7、蛋白质提纯的一般方法 (1)根据蛋白质等电点的不同 根据蛋白质在溶液中的下列性质分离蛋白质：分子大小、溶解度、电荷、吸附性质、对其他分子的生物亲和力等。 (1)根据蛋白质等电点的不同 蛋白质、多肽及氨基酸都是两性电解质，在一定pH环境 中，某一种蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，或解离成 两性离子，其净电荷为零，此时环境的pH值即为该蛋白质的 等电点。在等电点时蛋白质性质比较稳定，其物理性质如导 电性、溶解度、粘度、渗透压等皆最小，因此可利用蛋白质 等电点时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质。

两性物质的等电点会因条件不同（如在不同离子强度的 不同缓冲溶液中，或含有一定的有机溶媒的溶液中）而改变。 当盐存在时，蛋白质若结合了较多的阳离子，则等电点向较 高的pH值偏移。反之，蛋白质若结合较多的阴离子，则等电 点移向较低的pH值。 用等电点法沉淀蛋白质常需配合盐析操作，而除去不需 要的杂蛋白时，常需配合热变性操作。 等电聚焦电泳除了用于分离蛋白质外，也可用于测定蛋 白质的等电点。

蛋白质的一个主要特点是分子大。由此可以用凝胶过滤 法、超滤法、离心法及透析法等将蛋白质与其他小分子物质 分离，也可将大小不同的蛋白质分离。 (2)根据蛋白质分子形状和大小的不同 蛋白质的一个主要特点是分子大。由此可以用凝胶过滤 法、超滤法、离心法及透析法等将蛋白质与其他小分子物质 分离，也可将大小不同的蛋白质分离。 [注意] 用超滤法时，超滤膜截留分子量常与实际情况不 一致。分子量相近的蛋白质由于在介质中有呈线形溶质或者 是球形溶质的区别，可能出现不同的结果。 葡聚糖凝胶含有少量的酸性基团，故有较弱的离子交换 作用，此外还有吸附作用。在纯化蛋白质时，可采用低浓度 的盐溶液（0.01mol／L），或者用与待分离蛋白质相同的标 准蛋白质预先使凝胶柱平衡，以期不损失所分离的蛋白质。

(3)根据蛋白质溶解度的不同 蛋白质的溶解度受溶液的pH、离子强度、溶剂的电解质 性质及温度等多种因素的影响。在同一特定条件下，不同蛋 白质有不同的溶解度，适当改变外界条件，可以有选择地控 制某一种蛋白质的溶解度，达到分离的目的。 属于这一类的分离方法有蛋白质的盐溶与盐析法、结晶 法和低温有机溶剂沉淀法。 乙醇和丙酮是有机溶剂沉淀法中最常用的有机溶剂，由 于丙酮的介电常数小于乙醇，故丙酮沉淀能力比乙醇强。

离子交换剂作为一种固定相，本身具有正离子或负离子基 团，它对溶液中不同的带电物质呈现不同的亲和力，从而使这 些物质分离提纯。 (4)根据蛋白质电离性质的不同 离子交换剂作为一种固定相，本身具有正离子或负离子基 团，它对溶液中不同的带电物质呈现不同的亲和力，从而使这 些物质分离提纯。 蛋白质、多肽或氨基酸具有能够离子化的基团。对蛋白质 的离子交换层析，一般多用离子交换纤维和以葡聚糖凝胶、琼 脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为骨架的离子交换剂。主要是取 其有较大的蛋白质吸附容量、较高的流速和分辨率等优点。 对已知等电点的物质，在pH高于其等电点时，用阴离子交 换剂，在低于其等电点时，用阳离子交换剂。

主要的手段是亲和层析法，即利用蛋白质分子能与其相 应的配体进行特异的、非共价键的可逆性结合而达到纯化的 目的。 (5)根据蛋白质功能专一性的不同 主要的手段是亲和层析法，即利用蛋白质分子能与其相 应的配体进行特异的、非共价键的可逆性结合而达到纯化的 目的。 [注意] 非专一性吸附主要来自吸附剂上的离子基团和疏 水基团。解决这一问题的方法是从制备和选用吸附剂上着手。 固相化金属亲和层析（IMAC）是新发展的一种亲和层析 技术。蛋白质分子中的咪唑基和巯基可与一些金属元素（如 Cu2＋、Zn2+等）形成配位结合，使蛋白质得到分离纯化。

(6)根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合 蛋白质分子上有疏水区，它们主要由酪氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等非极性的侧链密集在一起形 成，并暴露于分子表面。这些疏水区，能够与吸附剂上的疏 水基团结合，再通过降低介质的离子强度和极性，或用含有 去垢剂的溶剂，增高洗脱剂的pH值等方法将蛋白质洗脱下来。 用含酚基疏水基团的琼脂糖纯化重组人表皮生长因子 （rhEGF），纯度可达94%，回收率达82%。

这是一种以化合物在两个不相溶的液相之间进行分配为 基础的分离过程，称之为逆流分溶。利用逆流分溶技术分离 垂体激素、氨基酸、DNA是很有效的。 (7)根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同 这是一种以化合物在两个不相溶的液相之间进行分配为 基础的分离过程，称之为逆流分溶。利用逆流分溶技术分离 垂体激素、氨基酸、DNA是很有效的。 (8)根据蛋白质受物理、化学等作用因素的影响 蛋白质易受pH、温度、酸、碱、金属离子、蛋白沉淀剂、 络合剂等的影响，由于各种蛋白质都存在着差异，可利用这 种差异来纯化蛋白质。 白蛋白在弱酸性条件下加辛酸钠可耐受67℃的温度，而 其他蛋白质将变性。

球蛋白或白蛋白在碱性条件下，可以和利凡诺作用，形 成络合物而与其他蛋白质分离。细胞色素C和胰岛素可用一 定浓度的蛋白沉淀剂如三氯醋酸沉淀，而保存其活力。 (9)根据蛋白质的选择性吸附性质 在蛋白质分离中，最广泛使用的吸附剂有结晶磷酸钙 （羟灰石）、磷酸钙凝胶、硅胶、皂土沸石、硅藻土、活性 白土、氧化铝以及活性炭等。诸如催产素、胰岛素、HCG、 HMG、细胞包素C等都可以通过吸附层析技术进行纯化。

(10)根据酶对蛋白质的作用 对于酶蛋白——超氧化物歧化酶（SOD）的提取，因SOD能 抵抗蛋白酶的水解，可用蛋白水解酶降解其他蛋白质，以便于 SOD进一步的纯化。 γ—球蛋白、ACTH在分子中有活性中心，可用蛋白酶水解 切去与生物活性无关的分子部分，保留活性分子片断，使产品 纯化。 对于无胰岛素生物活性的胰岛素原，用蛋白水解酶可切去 胰岛素原分子中的C-肽，使胰岛素激活。 一些活性多肽常与其他蛋白质分子结合而不呈现活性或不 能够被提取，用蛋白水解酶可以使其与其它蛋白质解离，恢复 其生物活性和在溶液中的正常性质。

层析chromatography 凝胶柱层析 离子交换层析 亲和层析

溶液中蛋白质的浓度可根据它们的物理、化学性质，如 折射率、比重、紫外光吸收来测定； （二）溶液中蛋白质浓度的测定 溶液中蛋白质的浓度可根据它们的物理、化学性质，如 折射率、比重、紫外光吸收来测定； 化学反应方法，如凯氏定氮、双缩脲反应、福林-酚反 应测定；也可用染色法，如氨基黑、考马斯亮蓝测定； 此外还可用荧光激发、氯胺T、放射性同位素计数等灵 敏度较高的方法。 上述方法，紫外吸收法、双缩脲法、福林－酚试剂法、 考马斯亮蓝染色法最为常用。

（三）纯度检查 测定蛋白质的纯度是化学和物理学的概念，它和蛋白质 所具有的生物活性有着更复杂的关系，蛋白质的聚合状态、 辅基的存在、蛋白质的变性作用等极大地影响其生物活性， 而这些因素的影响有些往往是用一般纯度检查的方法所查不 出来的，纯度检查的方法有： 1、HPLC 这是蛋白质纯度检查常用的有效方法。美国药典已规定 把HPLC用于胰岛素纯度的检测项目中。

2、电泳法 3．免疫化学法（适用于产生特异性抗体的蛋白） 4．生物测定法 利用动物体或动物的离体器官、细胞进行生物效价的测定，这种方法接近动物临床所产生的生物学效应，因此实际意义也更大。 5、分光光度法 （1）紫外分光光度法 （2）红外分光光度法 (蛋白分子结构有特别能级，红外提供分子指纹)

（四）化学合成法 用化学或化学-生物结合法制备非天然来源的蛋白质类药物，可追溯到20世纪60-70年代。中国科学家历经八年的时间，在国际上首次用化学方法合成了牛胰岛素，是为化学制备蛋白质的经典例子。

人工胰岛素的合成 胰岛素是蛋白质的一种，它由胰腺的胰岛B细胞分泌。有A、B两条肽链，共26种51个氨基酸组成。 第一步，先把天然胰岛素拆成两条链，再把它们重新合成为胰岛素，重新合成的胰岛素是同原来活力相同、形状一样的结晶。 第二步，在合成了胰岛素的两条 链后，用人工合成的Ｂ链同天然的Ａ 链相连接，这就是牛胰岛素的半合成。 第三步，把经过考验的半合成 的Ａ链与Ｂ链相结合。

（五）基因工程法 1982年美国Likky公司首先将重组胰岛素投放市场，标志着第一个重组蛋白质药物的诞生。 获得目的基因 组建重组质粒 构建基因工程菌 培养工程菌 目的蛋白的分离纯化 除菌过滤 半成品检定 成品检定 包装 产品

二、重要的蛋白质类药物的制备 结构与性质： 目前临床使用的胰岛素来源 胰岛素的发展历史 临床用胰岛素分类 胰岛素的制备工艺 人胰岛素品种 （一） 胰岛素 （insulin) 结构与性质： 目前临床使用的胰岛素来源 胰岛素的发展历史 临床用胰岛素分类 胰岛素的制备工艺 人胰岛素品种

1、Ins的结构 胰岛素广泛存在于人和动物的胰脏中，正常人的胰脏约含有200万个胰岛，胰岛由α-、β-和δ-三种细胞组成，其中β-细胞制造胰岛素，α-细胞制造胰高血糖素和胰抗脂肝素，δ-细胞制造生长激素抑制因子。胰岛素在β-细胞中开始时是以活性很弱的前体胰岛素原存在的，进而分解为胰岛素进入血液循环。 胰岛素由51个氨基酸组成。 不同种属动物的胰岛素分子结构大致相同，主要差别在A 链二硫桥中间的第8、9和10位上的三个氨基酸及B链C末端人 的是苏氨酸，猪的是丙氨酸,抗原性比其他来源的胰岛素要低。

胰岛素立体结构

人胰岛素（Insulin） 猪胰岛素 B30 牛胰岛素 A8 ;A10 ;B30 赖脯人胰岛素（礼来公司、速效Ins,lispro） B28 ;B29 B28 A21 ;B31 ;B32 B30去除；B29修饰 其一是赖脯胰岛素(lispro)，是用基因工程技术将人胰岛素B28位与B29位氨基酸互换；其二是门冬胰岛素(诺和锐，insulin aspart)，则是通过基因工程技术将人胰岛素B28位的脯氨酸替换为门冬氨酸。这些胰岛素类似物不易形成六聚体，皮下注射后主要以单体形式存在，其主要特点为：可溶性，自我结合力较低，皮下注射后局部吸收更快，起效时间更短(10～20分钟)，达峰时间40分钟，作用持续时间3～5小时。这一药物动力学特征更符合生理胰岛素和血糖变化谱，临床实践已经证实，使用速效胰岛素后，餐后血糖平稳，夜间血糖水平高于使用常规人胰岛素组。 长效胰岛素类似物甘精胰岛素(insulin glargine)通过胰岛素分子内氨基酸的置换(A21位门冬氨酸被甘氨酸替代)，且在人胰岛素B链末端增加2个精氨酸，从而改变了等电点(pH 5.4～6.7)。甘精胰岛素在酸性溶液(pH4.0)中呈溶解状态，能保持结构稳定，注射前勿需混悬。注射到皮下组织(中性环境)后，可形成微沉淀物。这种沉淀物的形成使胰岛素的分解、吸收及作用时间延长，可发挥长效作用。但存在的问题是：不能很好地预测沉淀及沉淀物再溶解过程，这些皮下的结晶同样会引起胰岛素吸收不均匀而带来的个体吸收变异。另外，由于其制剂为酸性，易导致注射部位疼痛。循证医学研究证实，与NPH相比，使用甘精胰岛素后吸收变异度有很大改善，但某些患者仍可表现为变异度偏大。 长效胰岛素类似物地特胰岛素(insulin detemir，Levemir)运用的是另一原理：由于药物的分子量越大，在皮下的扩散速度和穿过毛细血管壁的速度越慢，因此可以通过加大胰岛素分子的方法制备长效可溶性胰岛素类似物。目前的制备技术有2种：一种是使胰岛素分子与大分子蛋白结合，另一种是增加胰岛素分子间的交联。当然也可以将2种方法联合应用。地特胰岛素所使用的是前者，其去除了人胰岛素B30位的氨基酸，并在B29位的赖氨酸上增加了一个肉豆蔻酸侧链。在有锌离子存在的药液中，胰岛素分子仍以六聚体形式存在，而C14-脂肪酸链的修饰会使六聚体在皮下组织的扩散和吸收减慢。在单体状态下，含有C14-的脂肪酸链又会与白蛋白结合，进一步减慢吸收入血循环的速度。在血浆中，98%～ 99%的地特胰岛素与白蛋白结合，因此，向靶组织的扩散也较未结合白蛋白的胰岛素要慢。本品已于2004年在欧洲上市。 猪胰岛素 牛胰岛素 赖脯人胰岛素（礼来公司、速效Ins,lispro） 门冬胰岛素 （诺和诺德公司、速效Ins ,aspart） 甘精胰岛素 (安万特公司、长效Ins,glargine) 地特胰岛素 (诺和诺德公司、长效Ins）

2、Ins的性质

动物胰脏来源 3、目前临床使用的胰岛素来源 半合成胰岛素 重组DNA技术生产胰岛素 ----经动物胰脏提取或适当提纯的猪、牛胰岛素 酸醇提取、锌沉淀法精制 ※传统胰岛素---猪、牛胰脏提取，只经一步重结晶 ※单峰胰岛素----凝胶过滤纯化 ※单组分胰岛素---凝胶过滤、离子交换纯化 半合成胰岛素 ----以猪胰岛素为原料，酶修饰后得到人胰岛素 重组DNA技术生产胰岛素 ----重组DNA技术生产人胰岛素、速效胰岛素、长效胰岛素

动物来源的胰岛素（28种） 半合成来源的胰岛素（5种） 基因重组来源的胰岛素（27种）

胰岛素国内主要生产厂家 通化东宝 1998年12月研制出中国第一支基因重组胰岛素“甘舒霖” 深圳科兴 徐州万邦 甘舒霖® R-- 常规重组人胰岛素注射液 甘舒霖® N-- 低精蛋白重组人胰岛素注射液 甘舒霖® 30R-- 30/70混合重组人胰岛素注射液 （ 30%常规重组人胰岛素和70%低精蛋白重组人胰岛素） 深圳科兴 苏泌啉-- 常规重组人胰岛素注射液 苏泌啉恩-- 低精蛋白重组人胰岛素注射液 徐州万邦 万邦林-- 常规重组人胰岛素注射液 万苏林—猪胰岛素制剂 其他（持有药品注册证） ---南京新天生物化学制药有限公司、华西医科大学制药厂、上海第一生化制药厂、武汉生化制药厂等

4、胰岛素研究发展史—发现胰岛素 1788年 Thomas Canley (英) —— 证实胰腺损伤可导致糖尿病 1869年 Langerhans (德) —— 发现胰腺内具有分泌功能的细胞团 1889-1893年 Von mering 和 Minkowski (德) —— 证实胰腺细胞团产生降血糖物质 1893年 Edouard Laguesse (法) —— 将胰腺细胞团命名为胰岛 1909年 Jean de Meyer (比利时) —— 将胰岛分泌的降糖物质命名为胰岛素

4、胰岛素的研究发展史—得到胰岛素 1951年——锌胰岛素 1961年——中性可溶性胰岛素 1964年——预混胰岛素 1972年——单峰胰岛素 1973年——单组分胰岛素 （纯度达到99%）

4、胰岛素的研究发展史——改造胰岛素 胰岛素的蛋白质空间结构对维持其生物活性有很重要的意义，人工合成的胰岛素制剂受此影响在皮下注射后需有一定的解离时间才能发挥效力，故治疗时需提前20-30分钟注射胰岛素。 糖尿病人需要更接近生理状态、使用方便的胰岛素制剂。 利用基因重组技术，修饰胰岛素的氨基酸组合： 20世纪末 —— 人胰岛素类似物研制成功

4、基因合成的人胰岛素类似物 基因重组的速效人胰岛素类似物，直接以单体胰岛素的形式入血，能够在注射后被迅速吸收，注射10分钟后即可起效。 与长效胰岛素联合应用，模拟基础、餐时胰岛素治疗，血糖更易控制，低血糖发生率低。 A 1 B 1 21 30 28 27 27 28 lispro 优泌乐 赖脯胰岛素 A 1 B 1 21 30 天门冬氨酸 赖氨酸 glulisine 谷氨酸 谷赖胰岛素 速效胰岛素

基因重组的速效人胰 岛素类似物的预混制 剂，具有餐时注射起 效快，灵活方便的特 性。 诺和锐30特充 诺和锐 门冬胰岛素 A 1 B 1 21 30 天门冬氨酸 脯氨酸 aspart 速效胰岛素

超长效人胰岛素类似物, 比常规长效胰岛素作用时 间更长, 主要用于24小时 长期控制基础血糖。 来得时 甘精胰岛素 超长效人胰岛素类似物, 比常规长效胰岛素作用时 间更长, 主要用于24小时 长期控制基础血糖。 可以与速效类似物联合使 用,能很好的模拟正常人 的生理性胰岛素分泌,使 糖尿病患者的血糖水平得 到24小时理想控制。 A 1 B 1 21 30 精氨酸 甘氨酸 glargin 32 天门冬氨酸 地特胰岛素 诺和平 A 1 B 1 21 30 肉豆蔻酸 赖氨酸 detemir 中、长效胰岛素

4、胰岛素注射方式的改进 几十年来,胰岛素注射器已 经有了很大的改进。许多品 牌厂商制造胰岛素专用注射 器,针头经过特殊处理,因而 注射时不感到疼痛,而且针 眼很小。注射器针筒上直接 标有胰岛素单位(IU)，注射 几个单位胰岛素只要按标记 抽取,不需换算。 一次性注射器

一种利用高压将胰岛素“喷” 入皮下的装置，无需针头， 加之其经久耐用，常给惧怕 针头的儿童使用。但此装置 价格较贵，拆洗安装过程较 繁琐，喷射时局部压力较大， 尚未广泛推广使用。目前高 压注射器多用于人群计划免 疫和多人集中注射的情况。 高压无针注射仪

胰岛素笔是一种形如钢笔的专用注射装置,将胰岛素液储存于笔中,使用前调好剂量旋钮,患者自己注射方便易行。 胰岛素笔配有专用笔盒,可随身携带,更方便于旅行出差时使用。 笔上配有触感式剂量调整旋纽 ，也能适用于眼睛不方便的患者。 胰岛素笔

  胰岛素泵是目前最方便、最现 代化的注射方式，可以自动 定时定量地注射胰岛素，能 较好模拟生理性胰岛素分泌， 可以准确控制胰岛素的输入 剂量，并能经导管连续不断 按需要将胰岛素输入患者皮 下。随着技术的发展，胰岛 素泵越发小巧，功能亦不断 完善，目前的胰岛素泵仅重 约100克,如一台寻呼机大小， 携带方便。    胰岛素泵

4、非注射用胰岛素 正在研究中的其它非注射胰岛素给药途径包括:     口腔喷雾     鼻腔给药     直肠栓剂给药 均还在研究阶段     滴眼剂     透皮或口腔粘膜给药

4、临床用胰岛素分类 （1）普通胰岛素：从动物胰脏中提取 （2）人胰岛素 （3）人胰岛素类似物

5、胰岛素的制备工艺 （1）酸醇法提取、锌沉淀法精制提取动物胰岛素 （2）重组DNA技术制造人胰岛素 （3）酶促半合成人胰岛素 （4）化学合成

Insulin crystas

（1）酸醇法提取、锌沉淀法精制提取动物胰岛素 工艺路线：

工艺过程控制要点 提取：溶剂为86%～88%乙醇和5%草酸 pH值：2.5～3.0 碱化、酸化处理：氨水调pH值为8.0～8.4 减压浓缩： 去脂、盐析：分离脂层可回收胰岛素 精制： 除酸性蛋白→pH值4.2～4.3，用丙酮除去酸性杂质 锌沉淀法→pH值6.2～6.4，得锌沉淀物 结晶

离体后，蛋白水解酶类能分解胰岛素使之失活。因此， 要立即深冻，先在-30℃以下急冻后转入-20℃保存备用。 如用液氮或干冰速冻，效果更好。 在胰脏中，胰尾部分胰岛素含量较高，如单独使用可提 高收率10 %。

（2）重组DNA技术制造人胰岛素 以人工合成的人胰岛素A链和B链基因分别表达A链和B 链，然后再组合起来。——AB链合成法 通过胰岛素原的cDNA合成，表达产物是胰岛素原，经工 具酶切开，除去C-肽得人胰岛素。——胰岛素原表达法

基因表达 用于基因表达的宿主细胞分为两大类，第一类为原核细胞，目前常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；第二类为真核细胞，常用的有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 原核细胞 （1）大肠杆菌 〔2〕枯草芽孢杆菌 （3）链霉菌 真核细胞 （1）酵母 （2）丝状真菌 （3）哺乳动物细胞

AB链合成人胰岛素 Ins A链 Ins B链 转化大肠杆菌 发酵 纯化 A链 B链 活性胰岛素 二硫键

生产技术评价 由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低 , 通常只有10% - 20%. 采用这条工艺路线生产正确配对率较低 , 采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。 为了进一步降低生产成本 , 美国Ely LiLi公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线

胰岛素原表达法合成人胰岛素 PCR 反转录 提取质粒 限制性内切酶酶切 连接 转化大肠杆菌 酶切 胰岛素原 活性胰岛素 质粒 Ins mRNA 反转录 Ins cDNA 转化大肠杆菌 PCR 连接 胰岛素原 活性胰岛素 二硫键 酶切 提取质粒 限制性内切酶酶切

proinsulin

表达产物后处理路线 B链中第22位上的Arg和第29位上的Lys , 由于良好折叠的原因 , 对胰蛋白酶不敏感

生产技术的评价 在人胰岛素原表达工艺中 , 由于C肽的存在 , 胰岛素原能形成良好的空间构象 , 三对二硫键的正确配对率也相应提高 , 折叠率高达80%以上。 虽然这条工艺路线不比AB链分别表达法更为简捷 , 而且还要使用两种高纯度的酶制剂 , 但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷 , 使得每克最终产品的成本仅50美元。 目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。

分泌型重组人胰岛素表达法 上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌beta -半乳糖苷酶基因拼接的方法 , 所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强 , 但不能分泌 , 只要以包涵体的形式存在于胞质中。 一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原编码序列与beta-內酰胺酶基因拼接 , beta-內酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。 获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性 , 为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。

分泌型重组人胰岛素表达法 上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌beta -半乳糖苷酶基因拼接的方法 , 所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强 , 但不能分泌 , 只要以包涵体的形式存在于胞质中。 一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原编码序列与beta-內酰胺酶基因拼接 , beta-內酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。 获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性 , 为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。

（3）酶促半合成人胰岛素 经胰蛋白酶的转酰胺作用，将猪胰岛素转化为人胰岛素B30。再用离子交换层析纯化，可得到高纯度人胰岛素。

人与动物胰岛素在生物学活性及药效学上的差别 6、人胰岛素品种 人与动物胰岛素在生物学活性及药效学上的差别 总的来说，人胰岛素与猪等动物胰岛素，药效作用上甚为相近 药效学上的差别： 人正规胰岛素皮下注射后吸收较快，起效时间较早 人超缓胰岛素较之牛的相应制剂作用较短，需每日注射2次 人与动物胰岛素在免疫原性上的差别 人胰岛素的抗原性较牛胰岛素为弱 较猪胰岛素抗原性也轻 用人胰岛素后，血中针对胰岛素抗体的滴度较之使用动物胰岛 素后为低 低血糖问题 应用人胰岛素后低血糖的发生较多，可能与强化治疗的应用较 普遍有关

胰岛素类似物 速效胰岛素皮下注射后作用不够快，不能与餐后高血糖同 步 迟缓胰岛素在吸收过程中出现峰值，不能模拟生理性的基 础分泌 人及动物胰岛素制剂的临床应用不能完全符合生理性需要 为解决上述问题，将胰岛素分子加以改造，以得出"超速" 及"超缓"的胰岛素类似物

（1）传统中长效胰岛素制剂 低精蛋白锌胰岛素：胰岛素、鱼精蛋白和锌的结晶。 例：礼来公司， Humulin N(rDNA、大肠杆菌) 诺和诺德， Novolin N (rDNA、酿酒酵母) 胰岛素锌混悬液：精蛋白锌胰岛素与常规胰岛素的混悬液 例：礼来公司，Humulin 30/70 (30%常规胰岛素，70%精蛋白锌胰岛素) Humulin 50/50 诺和诺德， Novolin 30/70 Novolin 50/50 缺陷： 作用时间少于24小时 作用峰值明显，夜间低血糖危险性高 吸收不稳定 结霜现象，由于温度过冷或过热导致胰岛素在玻璃瓶壁沉淀，丧失活性

长效胰岛素的发展 鱼精蛋白与胰岛素结合型缓效胰岛素研制成功 Hagcdorn 1936 鱼精蛋白(Protamine)为雄鱼生殖腺所含的一组碱性蛋白质 pH中性的胰岛素加入鱼精蛋白后，其溶解度降低，形成胰 岛素－鱼精蛋白复合沉淀物 注射至皮下组织后，蛋白酶将鱼精蛋白分解下来，胰岛素 逐渐释出

鱼精蛋白锌胰岛素 Protamine Zine Insulin (PZI) 属长效制剂 鱼精蛋白与胰岛素的比例为1.2 mg/100 iu，鱼精蛋白有过剩 需有过量锌使制剂稳定：锌0.2 mg/100 iu 如PZI与RI混合应用，有一部分RI被鱼精蛋白吸附而变为缓 效 PZI约可吸附其本身半量的RI 例如PZI 20 U + RI 20 u (1:1混合) 约相当于PZI 30 u + RI 10 u (3:1混合)

（2）速效胰岛素 特点： 起效快，皮下注射后15分钟起效。 达峰快，注射后15分钟起效，30～60分钟达到药效高峰。 药效维持时间短，大约在3小时左右（2～4小时）。 药代动力学特点与进餐后人体内源性胰岛素分泌十分相似，能够很好地控制当餐后血糖升高而且不容易发生低血糖。 起效时间 达峰时间 峰持续时间 作用消除时间 常规皮下Ins: 30-90min 1.5-2.5h 2-4h 6-8h 生理Ins： 0-20min 30-45min 2-3h 3-4h

速效胰岛素类似物 胰岛素多聚体及单体 药用制剂中的胰岛素处于六聚体状态，主要由于浓度 过高所致 六聚体外形似一个压扁了的球，直径约5 nm，高度 约3.5 nm，由3个相同的二聚体组成 胰岛素注射至皮下后扩散至组织间隙液中，逐渐稀释， 离解为二聚体及单体，然后透过毛细血管被吸收入血 血循环中的胰岛素处于单体状态，可直接发挥生物学 效应

制备速效胰岛素类似物的策略 形成二聚体有关的主要部位为B链中氨基酸 B8、B9、B12、B16、B21、B23-29 阻碍二聚体形成的策略 在聚合的界面引起一个电荷上的排斥状态 如B28脯氨酸(Pro)换为门冬氨酸(Asp) B28 Asp胰岛素(Novo-Nordisk) 模仿IGF-1的结构 B28 Pro B29 Lys换为B28 Lys B29 Pro Lispro insulin (Eli Lilly)

INSULIN LISPRO Humalog ® A-chain S S S S B28 LYS B29 PRO B-chain [Lys (b 28), Pro (B 29)]-Human Insulin Analog (recombinant DNA origin)

已上市药物： Lispro（赖脯胰岛素）； 研制机理 B26-30对于胰岛素结合于胰岛素受体的功能无关，但是对胰岛素形成二聚体有关的结构特点 。因此对此区段进行修饰将产生一些自聚合能力下降但是与胰岛素受体结合能力不变的新型速效胰岛素类似物 。 已上市药物： Lispro（赖脯胰岛素）； Aspart（门冬胰岛素）； Apidra（赖谷胰岛素）

Lispro （赖脯胰岛素 ，Humalog ® ）是第一个用于临床的速效胰岛素类似物,由美国礼来公司研制生产，将人胰岛素的B28与B29位的氨基酸对换。。 Aspart（门冬胰岛素，Novolog ® ）由丹麦诺和诺德公司研制生产，结构与人胰岛素的区别在于用天冬氨酸取代了B链28位上的脯氨酸。 APIDRA （赖谷胰岛素，Apidra ® ）安万特公司研制，以赖氨酸和谷氨酸分别取代了人胰岛素B3位的天冬氨酸和B29位的赖氨酸。

重组人胰岛素 1.Humulin （优泌林） 1982年10月在美国上市，全球第一 个商业化基因重组人胰岛素。 2.Novolin Eli Lilly and Company 1982年10月在美国上市，全球第一 个商业化基因重组人胰岛素。 2.Novolin （诺和灵） Novo Nordisk

（3）长效胰岛素-人胰岛素类似物 理想的长效胰岛素类似物应具备的特性 作用时间： 皮下注射4小时以后起效 药效维持时间长于24小时 每日注射1次即可 不出现血清浓度高峰 同一患者注射后血浓度的个体内变异系数小 代谢作用明显强于促进细胞有丝分裂作用 降血糖效应等于或大于人胰岛素 不具面议原性 化学性质稳定 可与速效胰岛素或速效胰岛素类似物混合使用，不影响彼此 药效

①甘精胰岛素（ glargine ）： 商品名Lantus® ------甘氨酸替代胰岛素A链21位门冬氨酸、并在B链末端增加两个精氨酸。 ●使胰岛素结合更多带正电的氨基酸残基，改变等电点，使等电点由5.4上升至中性。这样，胰岛素类似物在酸性条件下可溶，在生理的近中性条件下结晶。 ②地特胰岛素（Insulin Detemir）：商品名Levemir ® ------胰岛素B链29位赖氨酸侧链通过酰基化连接一个N-16-烷基酸的14碳游离脂肪酸 ●该游离脂肪酸能与白蛋白结合，延缓与胰岛素受体结合，从而延长其半衰期。

甘精胰岛素强化治疗DM低血糖发生率与NPH比较 甘精胰岛素：Insulin glargine 重组DNA，人工合成 21A - Gly - 30 Ba - L - Arg 30B-L Arg - 人胰岛素 作用时间较NPH长： 等电位改变：生理pH中溶解性下降，六聚体稳定性上升 28周过程甘精胰岛素：(264) 睡前 NPH ：(270) 睡前 或 睡前+早餐前

Insulin Detemir （Levemir ® ） 诺和诺德公司研制 安万特公司研制 glargine （Lantus®） 安万特公司研制

（4）胰岛素肺部吸入制剂--------Exubera ●辉瑞、万安特以及Nektar 共同研发 ●于2006.1.27被FDA批准 ●一种作用快的胰岛素干粉吸入剂 ●适用于餐前给药，其胰岛素吸收具有速效化的特征