第六章 常用分子生物学技术

Molecular Hybridization Technique 第一节 分子杂交技术 Molecular Hybridization Technique

分子杂交 在分子杂交技术是利用单链核酸碱基互补配对、抗原与抗体、受体与配体、蛋白与其他分子的相互作用进行目的核酸、蛋白质检测，广泛应用于基因重组、生物印迹示踪，生物芯片等领域。

复性 RNA DNA

印迹技术概念 利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。

探针技术： 用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。

分子杂交技术的分类 一. Southern 印迹 二. Northern 印迹 三. Western 印迹 四. 原位杂交 五. 生物芯片

一、Southern印迹 Southern印迹杂交:DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNA或RNA。 其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。

Southern 凝胶转移杂交技术步骤 1.待测DNA样品的制备、酶切 2.待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 （b） （c） （d） （e） 基因组DNA DNA限制片段 硝酸纤维素滤膜 同探针同源杂交的基因DNA片段 X光底片 Southern 凝胶转移杂交技术步骤 1.待测DNA样品的制备、酶切 2.待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 3.凝胶中DNA的变性：碱变性 4.Southern转膜(印迹) 5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 6.杂交结果的检测

Southern杂交 （一）待测核酸样品的制备 1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶，分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，大小 相同的分子处于同一条带 （三）凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液 （四）Southern印迹 指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程

Southern杂交 （五）Southern杂交 1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点，预杂交液为不含DNA探针的杂交液 2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交，双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交 3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA （六）杂交结果检测 1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针 2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针 主要应用 Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。

二、Northern印迹 Northern印迹杂交:RNA片段经电泳后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。Northern印迹杂交常用于检测组织或细胞的基因表达水平。 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性;不能用碱变性，防止水解。用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛变性。　　 3、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理，Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 4、靶核酸为RNA 5、探针可用DNA或RNA片段　

Northern印迹 主要应用 检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平。 比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。

三、Western印迹 Western印迹，也称Western免疫印迹（WesternBlot或WesternBlotting），是指将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移至到固相载体上，然后用抗体通过免疫学反应检测目的蛋白，分析基因的表达程度。 原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

Western 印迹 主要步骤： 蛋白质样品的制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 蛋白质的电转移： 靶蛋白的免疫学检测 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应 该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。如：检测样品中的特异蛋白质的存在；细胞中特异蛋白质的定量分析；蛋白质分子的相互作用研究。

三种印迹技术的比较

② ③ ① 分子杂交实验

放射自显影照片

四、原位杂交技术的原理及分类 概念： 原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。 原理：利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即 探针)与组织、细胞或染色体上待测 DNA或 RNA互补配对，结合成专一 的核酸杂交分子，经一定的检测手段 将待测核酸在组织、细胞或染色体上 的位置显示出来。

原位杂交技术的一般过程 以经过标记的已知核酸分子为探针 以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子 在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交 再对其探测

标记 靶核酸分子 探针 杂交 检测

原位杂交

五、生物芯片 Biological Chip

概 念 生物芯片是指包被在硅片、尼龙膜等固相支 持物上的高密度的组织、细胞、蛋白质、核 酸、糖类以及其它生物组分的微点阵。 概 念 生物芯片是指包被在硅片、尼龙膜等固相支 持物上的高密度的组织、细胞、蛋白质、核 酸、糖类以及其它生物组分的微点阵。 芯片与标记的样品进行杂交，通过检测杂交 信号即可实现对生物样品的分析。 分类：基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片 元件型微阵列、通道型微阵列、生物传感芯片

分 类 基因芯片：reverse northern - dot blots 基因芯片：检测基因突变 基因表达谱芯片：检测基因表达水平 分 类 基因芯片：reverse northern - dot blots 基因芯片：检测基因突变 基因表达谱芯片：检测基因表达水平 蛋白质芯片：蛋白质在载体上的有序排列，依 据蛋白质分子、蛋白质与核酸相互作用的原理 进行杂交、检测和分析。 组织芯片：从不同的组织内进行活体解剖后取 出圆柱状的组织，然后包埋在受体区组内

（一）基因芯片 基因芯片(gene chip) 是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。

基因芯片工作流程示意图

DNA芯片技术

（二）蛋白质芯片 蛋白质芯片(protein chip) 是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。 蛋白质芯片作用原理 蛋白质分子间的亲和反应

第二节 目的基因制备技术 一 、PCR 二 、cDNA文库 三 、化学合成

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction),即PCR技术，是美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K. B 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction),即PCR技术，是美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。

The Principle of PCR Technology

（一）PCR技术的工作原理 Template DNA Primer 1 Primer 2 Cycle 1 Cycle 2 5 5 5

25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 Cycle 3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。

PCR技术原理示意图

PCR的基本反应步骤 变性 95˚C 退火 Tm-5˚C 延伸 72˚C

PCR体系基本组成成分 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+

（二）目的基因的克隆 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段； 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段； 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。

二、cDNA文库 cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。

从cDNA文库获取目的基因 mRNA 逆转录酶 反转录酶 cDNA 复制 碱水解 双链cDNA 载体 DNA聚合酶Ⅰ 重组DNA分子 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制

三、化学合成法获取目的基因 按照氨基酸的排列顺序，推知核酸的 核苷酸顺序，从而加以人工合成。

化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。

第三节 基因敲除技术 基因敲除技术的概念 基因敲除载体构建 基因敲除载体导入ES细胞 筛选与鉴定 基因敲除动物的产生

第三节 基因敲除技术

基因敲除简介 中文名称：基因敲除或基因剔除 英文名称：gene knock-out; gene knockout 将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的技术。去除原核生物细胞、真核生物的生殖细胞、体细胞或干细胞基因组中的基因等。广义的基因敲除包括某个或某些基因的完全敲除、部分敲除、基因调控序列的敲除以及成段基因组序列的敲除。

定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。 基因敲除简介 定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。 1234567 8 90 基因敲除 1234567 90

基因敲除方法及其原理 通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和RNAi，它们同样可以达到基因敲除的目的。

基因敲除技术 同源重组法 插入突变法 RNAi法

利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤 （以小鼠为例） 利用基因同源重组进行基因敲除 利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤 （以小鼠为例） 7

把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因的载体上，成为重组载体。

现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。 b．ES 细胞的获得： 现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。 ｃ.同源重组： 将重组载体通过一定的方式导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达

目前常用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。 ｄ．选择筛选已击中的细胞： 目前常用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。 ｅ．表型研究： 通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。

由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。 f．得到纯合体： 由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。

基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。 该方法通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的，克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。 直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。

基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法 。 技术原理： 此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。 基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法 。

根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同。 2)植物细胞中农杆菌介导的T-DNA转化和转座子比较常用； 插入载体的选择： 根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同。 1)逆转率病毒可用于动植物细胞的插入； 2)植物细胞中农杆菌介导的T-DNA转化和转座子比较常用； 3）噬菌体可用于细菌基因敲除。

用基因捕获法进行基因剔除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰。 基因捕获法的优点 面对人类基因组计划产生出巨大的功能未知的遗传信息，传统的基因敲除方法显得有些力不从心。因此，基因捕获法应运而生，利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。 基因捕获法的缺点 只能剔除在Es 细胞中表达的基因。 用基因捕获法进行基因剔除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰。

基因敲除技术的应用 ①．建立生物模型 在基因功能，代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的是小鼠。

②.提供廉价的异种移植器官 众所周知，器官来源稀少往往是人体器官移植的一大制约因素，而大量廉价的异种生物如猪等的器官却不能用于人体。这是因为异源生物的基因会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源分子，如果能将产生这些异源分子的基因敲除，那么动物的器官将能用于人体的疾病治疗，这将为患者带来具大的福音。

基因敲除技术还可用于治疗遗传病，包括去除多余基因或修饰改造原有异常基因以达到治疗目的。 ③疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗 通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响。这无论是对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。 对于日益威胁人体健康的肿瘤而言，它的产生多是抑癌基因突变的结果，因此，可应用基因敲除技术制备人类癌症的鼠模型。同时，应用RNAi技术可以特异地杀伤带有异常基因的肿瘤细胞。 基因敲除技术还可用于治疗遗传病，包括去除多余基因或修饰改造原有异常基因以达到治疗目的。

⑤改造生物、培育新的生物品种 ④免疫学中的应用 同异源器官移植相似，异源的抗体用于人体时或多或少会有一定的免疫排斥，使得人用抗体类药物的生产和应用受阻。而如果将动物免疫分子基因敲除，换以人的相应基因，那么将产生人的抗体，从而解决人源抗体的生产问题。 ⑤改造生物、培育新的生物品种 细菌的基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。它为定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技术支持。

第三节 基因敲除技术 基因敲除技术的应用 ④免疫学中的应用 异源的抗体用于人体时会有一定的免疫排斥，使得人用抗体类药物的生产和应用受阻。而如果将动物免疫分子基因敲除，换以人的相应基因，那么将产生人的抗体，从而解决人源抗体的生产问题。

2002 年，RNA 干扰被Science 杂志评为本年度十大科学成就之首。 63

第四节　RNA干扰技术 小分子双链RNA干扰技术作为一项高效、高特异性地关闭特定基因表达的新技术, 将为基因功能的研究提供一种快速、简便的全新方法,同时也为功能基因组研究与人类疾病的基因治疗带来革命性的变革。 64

2006年的诺贝尔生理学奖获得者 Andrew Z. Fire Craig C. Mello 65

1.RNA干扰（RNA interference, RNAi）： 是指在进化过程中高度保守的，由双链RNA（dsRNA）诱发的，同源mRNA高效特异性降解的现象。 66

第四节　RNAi—研究史 67

第四节　RNAi—研究史 转基因 矮牵牛花 的“基因沉默”现象 68

第四节　RNAi—研究史 69

第四节　RNAi—研究史 秀丽隐杆线虫 70

第四节　RNAi—研究史 71

二 RNAi----作用机制 RNAi作用机制模式图 dsRNA：双链RNA Dicer：一种核酶 siRNA：小干扰RNA RISC：RNA诱导沉默 复合体 cleavage：断裂 72

第四节　RNAi 外源基因整合入宿主细胞产生dsRNA 73

是细胞为保护自身基因免遭诸如病毒入侵等损害，而采取的一种使入侵的外源基因失活、却不影响细胞内基因正常表达的保护性调控机制。 第四节　RNAi RNAi的作用 是细胞为保护自身基因免遭诸如病毒入侵等损害，而采取的一种使入侵的外源基因失活、却不影响细胞内基因正常表达的保护性调控机制。 74

三、RNAi的作用特点 1. RNAi具有高度特异性 2. RNAi具有高效性 3. RNAi受多基因控制 4. RNAi需siRNA介导

四、siRNA的设计与制备 （一）siRNA的设计原则 （二）siRNA制备 1.化学合成 2. 体外转录 3.RNase消化长片段dsRNA制备 siRNA 4.siRNA表达载体 5. siRNA的表达框

五 RNA干扰技术的生物学意义及其 在药物学中的应用 1. 病毒防护 2.抗肿瘤作用 77

siRNA作为一种新型药物还存在的问题： 2、药物转运的载体问题尚未解决； 3、作用特异性不高。 78