第二章 遗传信息的表达 易发平 基础医学院生物化学与分子生物学教研室

第一节 相关知识 第二节 DNA复制 第三节 遗传信息的表达 第四节 外源基因的表达 二、什么是基因 三、基因组（genome）和基因组结构 第一节 相关知识 一、核酸的结构 二、什么是基因 三、基因组（genome）和基因组结构 第二节 DNA复制 一、DNA复制的基本特点 二、原核生物染色体DNA的复制 三、其它环状DNA分子的复制 四、真核生物染色体DNA复制的特点 第三节 遗传信息的表达 一、转录 二、翻译 第四节 外源基因的表达 一、外源基因在原核系统中的表达 二、外源基因在真核系统中的表达外源 三、外源基因表达的几种方式

第一节 相关知识 一、核酸的结构 核酸（nucleic acid）是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子。天然存在的核酸有两大类，一类为脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA），另一类为核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）。DNA存在于细胞核和线粒体内，RNA存在于细胞质和细胞核内。DNA和RNA是遗传的物质基础。（prion(朊病毒)也是遗传物质？）

核酸的基本组成单位是核苷酸（nucleotide），核苷酸则由碱基、戊糖和磷酸三种成分连接而成。构成核苷酸的碱基（base）主要有五种，腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T），及尿嘧啶（U）。 二、什么是基因？ 基因（gene）是DNA分子中的某一特定的核苷酸序列，经过复制可以传递给后代，经过转录和翻译可以产生维持正常生命活动的生物大分子（RNA和蛋白质）。基因具有可遗传性、可表达性、可移动性（转座单元、跳跃基因）、不连续性（内含子intron、断裂基因）和重叠性（重叠基因）的特征。

非编码序列 5′ 3′ 调控序列 内含子 编码序列 非编码序列

lacI P lacO lacZ lacY lacA 1、原核基因的结构特征 原核基因组常以操纵子（operon）的形式作为表达和调控的基本单元，它包括功能上彼此相关的结构基因和调控部位，受调节基因产物的调节，转录产物为单个多顺反子。 阻遏蛋白基因 结构基因 启动子 操纵基因 lacI P lacO lacZ lacY lacA 大肠杆菌乳糖操纵子结构

（1）原核RNA 聚合酶（RNA polymerase） 亚基 基因 数目 组成 功能   ’  ropA 2 核心酶 结合启动子，连接和’ ropB 1 核心酶 结合碱基，合成RNA ropC 1 核心酶 结合启动子-10区（TATA box） ropD 1 全酶 结合启动子-35区，其始转录 （2）原核启动子（promoter） ①启动子是基因5′端上游的一段启动基因转录的核苷酸序列，是RNA pol 和其他转录因子结合的部位。

②原核基因的启动子定位在转录起始位点（initiation site，IS）上游5-10bp处，由-35区和-10区组成，从启动子到终止子（terminator）为一个转录单位。 ③ -10区的碱基序列较保守，由T和A组成，大肠杆菌的-10区为TATAAT，故称TATA box或 pribnow box。 ④ -35区的碱基序列以TTG最为保守，大肠杆菌的-35区为TTGACA，  因子识别并结合-35区，RNA聚合酶的特异性由 因子决定，而启动子的强弱则由-35区和因子的特异性和亲和力决定。 从IS到-10区之间的5-10bp间隔称5 ′-leader序列。

⑤大肠杆菌基因启动子图示 启动子 5-leader 5′ +1 -35 -10 IS 上游 下游

3、真核基因的结构特证 大多数真核基因的编码序列被不能编码的额外序列所分隔，以不连续的方式排列在DNA上，因此这类基因也叫断裂基因（split gene）。隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列称内含子（intron），在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列叫外显子（exon）。

因此，从DNA转录来的初级转录物是mRNA的前体，称核不均一RNA（ nuclear heterogenous RNA，hnRNA），在进行翻译前必需通过转录后加工除去内含子，形成成熟mRNA，这一过程叫拼接（splicing）。 由于真核基因不组成操纵子，不形成顺反子，真核基因表达受到多级调控系统的调节。

DNA hnRNA e i splicing mRNA 蛋白质

鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰 鸡卵清蛋白基因 hnRNA 首、尾修饰 hnRNA剪接 成熟的mRNA

（1）三种真核RNA 聚合酶（RNA polymerase） 定位 转录产物 对-Amaniting的敏感性 RNA pol I RNA pol II RNA pol III 核仁 rRNA（18S，28S，5.8S） — 核质 hnRNA（mRNA）， snRNA + 核质 tRNA，5SrRNA，某些snRNA 有种属特异性 与原核生物的RNA pol不同，真核RNA pol不能单独与启动子结合，必需要有转录因子的参与。 （2）真核基因的Ⅱ型启动子（promoter） ①真核基因的TATAｂｏｘ为ＴＡＴＡＡ／ＴＡＴ／Ａ， 并且距离ＩＳ较远。

②没有-３５区。 ③在ＩＳ上游还有ＣＡＡＴ　ｂｏｘ、ＧＣ　ｂｏｘ和Ｏｃｔａｍｅｒ（八聚体）等结构，并与ＴＡＴＡ盒一起组成Ⅱ型基因的启动子。必须明确，并不是所有的Ⅱ型基因都具备这４种调控元件，有的基因就没有ＴＡＴＡ盒（如ＳＶ４０的早期基因）。 Ｏ Ｃ ＧＣ Ｔ ＩＳ 由于Ⅱ型启动子无-35区，也没有 因子，因此，RNA pol Ⅱ与启动子的结 合至少与4种转录因子（TF Ⅱ A~D）有关。

三、基因组（genome）和基因组结构 基因组（genome）：细胞或生物体中，一套完整单倍体的遗传物质的总和。如人类基因组包含22条染色体和X、Y两条性染色体上的全部遗传物质（核基因组）以及胞浆线粒体上的遗传物质（线粒体基因组）。 基因组结构：主要指不同的基因功能区域在核酸分子中的分布和排列情况，基因组的功能是贮存和表达遗传信息。

病毒、原核生物以及真核生物所贮存的遗传信息量有着巨大的差别。病毒基因组结构简单，所含结构基因很少；原核生物基因组所含基因数量较多，且有较为完善的表达调控体系；真核生物基因组所含基因数量巨大，表达调节系统也更为精细。

第二节 DNA复制 基因组中的遗传信息决定着物种的遗传和变异。各种生物均通过其自身基因组核酸的完整复制将亲代的遗传信息忠实地传给子代，保证了物种的连续性。遗传信息的复制实际上就是基因组全部核酸序列的复制。基因组核酸的复制在不同生物中主要有四种形式，即DNA复制、DNA通过RNA中间体进行复制、RNA复制、RNA通过DNA中间体进行复制。大多数生物通过DNA复制完成基因组的复制，少数DNA病毒是通过RNA中间体复制其基因组DNA，许多RNA病毒是通过RNA复制完成其基因组的复制，逆转录病毒则是通过DNA中间体复制其基因组RNA。真核生物的端粒可通过逆转录完成复制过程。

复制(replication) 是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。 复制 亲代DNA 子代DNA

一、DNA复制的基本特点 （一）复制的起始点和方向 基因组中能单独进行复制的单位称为复制子，复制子中控制复制起始的位点称为复制起始点。在开始时，复制起始点处呈一叉形（Y型），称为复制叉。复制进行时，复制叉向前移动。复制的方向可有三种不同形式：一是从两个起始点开始，各以相反的单一方向复制出一条新链，形成两个复制叉；二是从一个起始点开始，以同一方向复制出两条链，形成一个复制叉；三是从一个起始点开始，同时沿两个相反的方向各复制出两条链，形成两个复制叉。

母链DNA 复制过程中形成的复制叉 子代DNA + A G T C T C A G A G T C T C A G A G T C T C

a.2起始点，2叉 c.1个起始点，2叉 复制叉 复制叉 b.1个起始点，1个复制叉 DNA链复制方向的三种形式 旧链 起始点2 复制叉 起始点1 c.1个起始点，2叉 起始点2 复制叉 复制叉 b.1个起始点，1个复制叉 复制叉 复制叉 起始点 起始点 复制叉 DNA链复制方向的三种形式

（二）复制方式 1、半保留复制 DNA复制时，DNA双链中的互补碱基之间的氢键断裂，解为两条链，各以一条单链为模板，按碱基互补原则合成新的互补链，新合成的两个DNA分子和亲代DNA分子是完全一样的。在子代DNA分子中一条单链来自亲代，另一条单链是新合成的。这种复制方式称为半保留复制（semi-conservative replication）。

2、半不连续复制 DNA双螺旋的两条链是反向平行的，一条是5′ 3′方向，另一条是3′ 5′方向，两条链都能作为模板合成新的互补链。但是，生物体内所有DNA聚合酶的催化方向都是5′ 3′，在复制过程中，DNA聚合酶以3′ 5′方向为模板，随着复制叉的移动方向，连续合成新的互补链（称为前导链，leading strand）。但是DNA聚合酶不能随着复制叉的移动方向合成另一条模板链的互补链。另一条互补链是如何合成的呢？

1968年日本学者冈崎等发现了DNA连接酶并提出了不连续复制模型，即以5′ 3′方向模板链为模板合成的互补链也是5′ 3′方向延伸，但与复制叉的前进方向相反，只能倒着合成许多片段，这些片段称为冈崎片段（Okazaki fragment）；DNA连接酶再将冈崎片段连接成完整的DNA链，称为随从链（lagging strand）。由于前导链的合成是连续进行的，而随从链的合成是不连续进行的，所以DNA的复制是半不连续复制。随从链的合成比前导链迟一些，所以二者是不对称进行的。

复制叉行进方向 3′ 5′ 5′ 前导链 随从链 3′

（三）复制的基本过程 DNA复制大致分为三个阶段，即复制的起始、DNA链的延长和复制的终止。基本上包括：①DNA双链解开；②RNA引物的合成；③DNA链的延长；④切除引物、填补缺口、连接相邻DNA片段；⑤切除和修复错配碱基。 二、原核生物染色体DNA的复制 三、其它环状DNA分子的复制 四、真核生物染色体DNA复制的特点

3-OH 5-P 5'  5 3 5 3 5' 滚环复制

D环复制(D-loop replication) 是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。 dNTP DNA-pol γ

第三节 遗传信息的表达 各种生物基因中，绝大部分基因贮存的遗传信息都是蛋白质的一级结构信息，部分基因贮存的是tRNA、rRNA等RNA的一级结构信息。除少数RNA病毒可将遗传信息直接从RNA输出以外，大部分生物（包括逆转录病毒）的遗传信息都是从DNA分子中输出的。遗传信息的表达，就是贮存于DNA中的信息转变成具体的RNA分子或蛋白质分子。通过这些生物大分子的功能活动使生物体表现出各种各样的生理功能及千差万别的生物性状。

DNA可以作为模板直接指导RNA分子的生物合成，这一过程称为转录。DNA不能作为直接模板将其携带的信息转移到蛋白质分子中，需要先通过转录过程将遗传信息传递到RNA分子中，再通过翻译过程将RNA分子上的核苷酸序列信息转变为蛋白质分子中的氨基酸序列。对于编码蛋白质的基因来说，其遗传信息的表达包括转录和翻译两个阶段。

转录模板 DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因(structural gene)。 DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(template strand)，也称作有意义链或Watson链。相对的另一股单链是编码链(coding strand)，也称为反义链或Crick链。

5′···GCAGTACATGTC ···3′ 编码链 3′··· c g t g a t g t a c a g ···5′ 模板链 转录 mRNA 5′···GCAGUACAUGUC ···3′ 翻译 N······Ala · Val · His · Val ······C 蛋白质

结构基因 转录方向 5 3 3 5 编码链 模板链 模板链 编码链 转录方向

不对称转录(asymmetric transcription) 在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录 ； 模板链并非永远在同一条单链上。

一、转录 转录（transcription）是以DNA为模板，以4种NTP为原料，依碱基配对规律，在DNA指导的RNA聚合酶催化下合成RNA的过程。通过RNA的合成，DNA分子中的遗传信息被转录到RNA分子中。 以DNA为模板复制DNA和转录RNA都是酶促的核苷酸聚合过程，二者既有相似之处，又有不同点。相似之处在于：①都以DNA为模板；②都以核苷酸为原料,合成方向5 3，核苷酸之间以磷酸二脂键相连；③服从碱基配对原则；④都需依赖DNA聚合酶，产物是很长的多核苷酸链。

二者的不同点有：①复制的原料是4种dNTP，而转录的原料是4种NTP，即ATP、GTP、CTP、UTP；②复制过程中碱基配对关系是A-T、G-C，而转录过程中碱基配对关系是A-U、G-C；③在复制过程中催化聚合反应的酶是DNA聚合酶，而在转录过程中催化聚合反应的酶是RNA聚合酶；④在复制时，DNA分子的两条多核苷酸链都能作为模板，产物是与模板等长的整体分子，带有基因组的全套遗传信息；而转录一种RNA分子时只利用DNA分子中的一条链为模板，而且只是从一个基因或一个操纵子转录，转录单位的模板上的位置和数量随细胞的生活状态而改变，因此，不同时间里产物的数量、性质和大小都不相同。

1、原核生物RNA的生物合成 (1)RNA聚合酶 原核生物细胞中只有1种RNA聚合酶，兼 有合成mRNA、tRNA和rRNA的功能。反应时需要有Mg或Mn的存在，该酶缺乏3′ 5′外切酶活性，所以它没有校对功能。 （2）转录模板 以模板链（无意链）为模板，合成mRNA，与复制一样5′ 3′方向延伸。 （3）转录过程 分为起始、延长和终止三个阶段。

（4）转录产物的加工 转录产物是mRNA分子，一般不需加工。tRNA前体的加工主要包括剪切作用：切除前导序列、拖尾序列及间隔序列；添加和修复3′端CCA序列，由tRNA核苷酸转移酶催化完成；某些碱基的化学修饰，在特异酶的催化下经化学合成成熟tRNA分子中的稀有碱基。rRNA前体的加工：在核酸外切、内切酶的共同作用下，将各种前体的多余核苷酸切除，即可得到成熟的RNAs 。

16S tRNA(4S) 23S 5S 17S tRNA 25S 5S 甲基化 CH3— 裂 解 中间产物 核酸酶 核酸酶 成熟RNAs 16S rRNA tRNA 23S rRNA 5S rRNA 原核生物rRNA前体的加工

2、真核生物RNA的生物合成 转录机制尚不完全清楚，其基本过程可能与原核生物类似，但更复杂。 （1）RNA聚合酶 有三型，分别称为RNA聚合酶Ⅰ（A）、Ⅱ（B）、Ⅲ（C），识别不同的启动子而转录不同的基因。 RNA聚合酶Ⅰ在核仁，主要转录5.8S、18S、28S rRNA基因； RNA聚合酶Ⅱ在核浆，主要转录编码蛋白质的基因，即主要转录产生mRNA； RNA聚合酶Ⅲ在核浆，主要转录tRNA和5S rRNA基因。

（2）转录单位 一个转录单位只有一个结构基因。 （3）转录过程 也分为起始、延长和终止三个阶段 （4）转录产物的加工 包括mRNA前体的加工： 5′端加帽(m7GpppGp —) 、 3′端加poly(A)尾、剪接以及编辑等；tRNA前体的加工，包括剪接去除内含子、剪切5′端先导序列、添加或修复3′端CCA以及碱基的化学修饰等；rRNA前体的加工主要是剪接和化学修饰。

二、翻译 贮存于结构基因中的遗传信息从DNA转录到mRNA，后者在蛋白质的生物合成过程中作为直接模板，在核糖体、tRNA、以及多种蛋白质因子共同参与下，把mRNA中的核苷酸序列转换成蛋白质中的氨基酸顺序，因为mRNA的核苷酸序列与蛋白质的氨基酸序列是两种不同的分子语言，所以常把mRNA中的遗传信息转换成为蛋白质氨基酸序列的过程称为翻译（translation）。

mRNA是遗传信息的携带者 遗传学将编码一个多肽的遗传单位称为顺反子(cistron)。 原核细胞中数个结构基因常串联为一个转录单位，转录生成的mRNA可编码几种功能相关的蛋白质，为多顺反子(polycistron) 。 真核mRNA只编码一种蛋白质，为单顺反子(single cistron) 。

原核生物的多顺反子 蛋白质 真核生物的单顺反子 蛋白质 非编码序列 核蛋白体结合位点 起始密码子 终止密码子 编码序列 3 5 PPP mG - 5 3 蛋白质 非编码序列 核蛋白体结合位点 起始密码子 终止密码子 编码序列

1、遗传密码 1961年，Jacob和Monod首先提出了mRNA的概念。在真核细胞中，由于蛋白质是在胞浆中而不是在核内合成，因此显然要求有一个中间物将DNA上的遗传信息传递至胞浆中。后来的研究证实，这种中间物即信使RNA。mRNA的核苷酸序列与DNA序列相应，决定着合成蛋白质的氨基酸序列。它如何指导氨基酸以正确的顺序连接起来呢?不同的mRNA碱基组成和排列顺序都不同，但都只有A，G，C，U 4种碱基。如果一个碱基就可以决定一个氨基酸，则只有四种变化方式，如果两个碱基决定一个氨基酸，则只有16种变化方式，都

不能满足20种氨基酸的需要。1961年Crick和Brenner的实验得出了三个核苷酸编码一个氨基酸的结论，并将这种三位一体的核苷酸编码称做遗传密码(genetic code)或三联体密码，这样就可以有64种不同的密码，但此情况下必须假定有一些氨基酸使用两个以上的密码。这一假定很快就被证明是对的。遗传密码具有下列特征： (1) 起始密码子和终止密码子：AUG除代表甲硫氨酸外，在mRNA 5′端出现的第一个AUG还兼作肽链合成的起始密码；UAG、UAA和UGA是肽链合成的终止密码子；

(2)方向性：起始密码子总是位于编码区5′未端，终止子位于3′未端，每个密码子的三个核苷酸也是5′ 3′方向阅读，不能倒读； (3)连续性：密码子之间不重叠使用核苷酸，也无核苷酸间隔； (4)简并性：一种氨基酸可有多个密码子； (5)通用性：所有生物从最低等的病毒直至人类，蛋白质合成都使用同一套密码子表，仅有极少的例外，如特殊细胞器线粒体，叶绿体所用的密码稍有不同。 (6)摆动性：密码子与反密码子配对辩认时，有时不完全遵照碱基互补规律，尤其是密码子的第三位碱基对反密码子的第一位碱基，即使不严格互补也能辨认配对，这种现象称为摆动。

摆动配对 5’ mRNA 5’ U

“863”项目：从正常人脾细胞中用RT-PCR方法得到的人源乙肝病毒表面抗体（抗-HBs）全基因序列 ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA 45 GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC 90 CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA 135 GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG 180 CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG 225 TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG 270 AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA 315 GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA 360 GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC 405 AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC 450 AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC 495 AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC CCC TTC 540 TTC CTC TAC AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG 595 GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC 630 CAC TAC ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA 669 “863”项目：从正常人脾细胞中用RT-PCR方法得到的人源乙肝病毒表面抗体（抗-HBs）全基因序列

2、核糖体 是rRNA与蛋白质组成的复合物，是蛋白质合成的场所。 3、tRNA 既能识别mRNA分子上的遗传密码，又能与相应的氨基酸结合，按mRNA序列的指示，将氨基酸逐个携带进入核糖体，以合成多肽链。 蛋白质生物合成体系由氨基酸、mRNA、tRNA、核糖体、某些酶与蛋白质因子、ATP、GTP及Mg2+等共同组成。mRNA是蛋白质合成的模板，tRNA在翻译过程中起接合器作用，核糖体是蛋白质生物合成的场所和装配机。参与蛋白质合成的氨基酸在特异的氨基酰tRNA合成酶催化下，与其相应的tRNA结合成氨基酰-tRNA，经核糖体循环合成多肽链。

4、肽链的翻译后加工 多数蛋白质肽链合成后，需要经过一定的加工或修饰，才能成为具有一定构象和功能的蛋白质。加工包括：肽链折叠、二硫键生成、亚基聚合、肽段水解切除以及某些氨基酸残基铡链基团的化学修饰等。

第四节 外源基因的表达 载体与工具酶

MCS

II型限制性内切酶 外源片段 T4DNA连接酶

抗性筛选

α-互补

一、外源基因在原核系统中的表达（翻译） 1、S-D序列 在紧靠起始密码子（AUG）的上游有一段约6-8个核苷酸的序列5′-AGGAGGU-3′，是核糖体与mRNA 的结合部位，叫Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。 2、常用的原核表达载体 （1）含lac启动子的表达载体 特点：A.含有编码lacZ的序列，外源基因正确插入后可与 -半乳糖苷酶形成融合蛋白。B.含lac启动子的表达载体可被IPTG（硫代半乳糖苷）诱导。

(2)含有trp启动子的表达载体 (3)含有tac启动子的表达载体 (4)含有PL启动子的表达载体 特点：A.其外源蛋白表达量比含Lac启动子的载体系统高。B.该载体可被IAA（3-  -吲哚丙烯酸）诱导表达。 (3)含有tac启动子的表达载体 特点：A. tac启动子是lac和trp启动子构建的杂合启动子，比lacUV5启动子强10倍，是非常强的启动子。B.有来自噬菌体的转录终止子T1和T2，以防过度转录。C.可以被ITPG诱导。 (4)含有PL启动子的表达载体 特点：A.是一个温度调节启动子，在29-310C时PL启动子处于阻遏状态，当温度升高到420C时PL启动子的阻遏被解出，基因开始大量表达。B.当该载体转染受体菌N99 cI+时，由于受体菌能合成cI蛋白，使载体在370C时能大量复制。

4000bp

o p Hpa I t1

3、真核基因在原核系统中表达的困难 (1)原核RNA pol 不能识别真核基因的启动子。（去除P） (2)从真核基因转录的mRNA缺乏S-D序列，不能结合到核糖体上，故不能直接翻译。（加S-D序列） (3)原核细胞缺乏真核细胞的转录后加工系统，不能切除真核基因中普遍存在的内含子，不能形成成熟的mRNA，因此，不能表达真核蛋白。（用cDNA） (4)表达的真核蛋白不稳定，易被细菌蛋白酶降解。（融合表达或分泌表达）

二、 外源基因在真核系统中的表达 （一）酵母表达系统 1.载体的特点（1）选择性标记（2）启动子（3）转录、翻译、终止信号（4）加尾信号（5）复制起始位点ori。 2.载体类型 1）质粒载体 可广泛用于表达外源蛋白，但在进行大于10L的大量培养时，质粒表达系统往往不够稳定。 分类:附加体型载体（yeast episomal plasmid, YEp）、复制型载体（ yeast replicating plasmid,YRp ）和酵母着丝粒质粒（ yeast centromere plasmid,YCp ）

2）整合型载体 这类载体不含酵母自主复制序列，故不能独自在细胞中复制，必须整合到酵母染色体中后才能使外源基因得以表达。

TEL leu2+ MCS ARS CEN 3）酵母人工染色体 酵母人工染色体（ yeast artificial chromosome, YAC）是利用DNA重组技术组装的人工染色体，是目前容纳外源基因容量最大的载体（大于100kb），且高度稳定。它包括自主复制序列(ARS, autonomously replicating sequence)、着丝粒(CEN)、端粒(TEL)结构和选择标记等基本结构。现在又加上启动子和MCS,使YAC操作更加方便。 TEL leu2+ MCS ARS CEN YAC 图示

（二）杆状病毒（baculovirus）载体系统 1、常用的杆状病毒表达系统是AcMNPV，其基因组大约13kb，为环状dsDNA，通过构建一个转移载体可以将外源基因转移到病毒基因组中，实现外源基因在昆虫细胞中的表达。 2、转移载体是一个大肠杆菌质粒，含有一段AcMNPV 的DNA序列(包括多角体基因的启动子及其上游区、单克隆位点、多角体基因的终止子、加尾信号及下游DNA)。 5’DNA P 单克隆位点 终止子 3’DNA 载体DNA 载体DNA 转移载体

AcMNPV DNA 5′ 转移载体 蛋白基因 外源基因 多角体 3′ 重组杆状病毒表达系统图示

（三）哺乳动物细胞的表达系统 人腺病毒载体

三、 外源基因表达的几种方式 （一）外源蛋白的非融合表达 三、 外源基因表达的几种方式 （一）外源蛋白的非融合表达 1）非融合表达是指所表达的外源蛋白的N端不含任何其他的异源性氨基酸，因此要求起始位点(ATG)必须位于要表达的外源基因片段的5’端。将目的基因插入合适的启动子和S-D序列的下游，就可以在原核表达系统中表达出非融合蛋白。（S-D序列与ATG之间的距离只要改变2-3个碱基也会极大地影响表达效率。） 2） 常用的非融合表达措施是分泌表达，即在N段接一段信号肽序列（信号肽中含有许多疏水氨基酸和带正电荷的氨基酸，使整个信号肽的总电荷为正。），信号肽可以帮助蛋白质穿过质膜，促进分泌。蛋白质穿过质膜后信号肽被信号肽酶切除。

3）非融合表达的缺点是外源蛋白容易被细菌的蛋白酶分解，解决的办法是①用Ion-株（次黄嘌呤核苷营养缺陷菌）做受体菌，蛋白酶合成受阻，外源蛋白得到保护。②pin基因克隆 ， T4噬菌体的pin基因产物是细菌蛋白酶的抑制剂，将pin基因克隆到表达质粒中并转化大肠杆菌，细菌蛋白酶被抑制，外源蛋白的到保护。③分泌表达 （二）外源蛋白的融合表达 外源蛋白（特别是小分子量蛋白）在异源宿主细胞中的表达量通常非常低，也很容易被宿主蛋白酶水解，解决的方法之一就是将目的蛋白与宿主的蛋白共价连接起来，形成融合蛋白，这种表达方式叫融合表达。

RE 目的基因 lacZ RE RE ompF RE酶切 连接 目的基因 lacZ Ampr ompF Ampr

Hind III GTTCGA AGCTTG TCGAAC CAAGCT AGCTTG GTTCGA

小 结（中心法则） RNA 复制 转录 复 制 逆转录 ? RNA DNA DNA ? 翻译 构象 改 变 Prion