手性分析条件的优化 及 手性色谱制备流程 赵 海 燕 大赛璐药物手性技术（上海）有限公司 Tel:139-1612-1460 手性分析条件的优化 及 手性色谱制备流程 赵 海 燕 Tel:139-1612-1460 E-mail:zhao_hy@daicelchiraltech.cn Http://www.daicelchiraltech.cn 大赛璐药物手性技术（上海）有限公司

内 容 1 Daicel多糖系手性色谱柱产品及应用特点 2 多糖系手性色谱柱的分析条件优化方法 2-1 正相条件 2-2 反相条件 内　　容 1 Daicel多糖系手性色谱柱产品及应用特点 2 多糖系手性色谱柱的分析条件优化方法 2-1 正相条件 2-2 反相条件 3 手性色谱制备流程

Daicel手性色谱柱一览表 正相 直链淀粉衍生物 CHIRALPAK® AD / AD-H CHIRALPAK® AS / AS-H 纤维素衍生物 CHIRALCEL® OD / OD-H CHIRALCEL® OJ / OJ -H CHIRALCEL® OA, OB, OC CHIRALCEL® OF, OG, OK CHIRALCEL® CA-1 反相 CHIRALPAK® AD -RH CHIRALPAK® AS -RH CHIRALCEL® OD-RH CHIRALCEL® OJ -RH 共价键合型－新产品 CHIRALPAK® IA CHIRALPAK® IB CHIRALPAK® IC 其它 CROWNPAK® CR (＋), (－) CHIRALPAK® OT(＋), OP (＋) CHIRALPAK® WH, MA (＋) CHIRALPAK ® QD-AX CHIRALPAK ® QN-AX

手性固定相结构 (CSPs) OD OJ AS AD OB OC OF OG OA OK 7 / 47 こちらが、多糖誘導体系順相用カラムのバリエーションとなっております。品目はセルロース系とアミロース系、そしてカルバメート系置換基とエステル系置換基など、合計10品目ございます。そのなかでもこの赤枠で囲みました,ＯＤ，ＯＪ，ＡＤ，ＡＳ系列を、私どもでは“主要4種として位置付けております。その理由と、弊社製カラムの高い不斉識別能力について、これからご説明させていただきます。 7 / 47

手性固定相结构 (CSPs) 硅胶 <包埋类型> 纤维素或直链淀粉包于硅胶上. <优点> ・通用性强 ・耐用 多糖 <包埋类型> 纤维素或直链淀粉包于硅胶上. <优点> ・通用性强 ・耐用 多糖 硅胶 こちらが、多糖誘導体系分割カラムの充填材,ＣＳＰの構造です。セルロース、またはアミロースの３つの水酸基を置換しました誘導体ポリマーによってシリカゲルをコーティングした構造となっております。コーティング型と呼ばれますこのＣＳＰの利点は,高い不斉識別能力と,耐圧性にあります。 2 / 47

分离机理 R2 R N R1 O H H O O 纤维素 O N 或 H R Y O N R H R1 R2 直链淀粉 偶极子-偶极子 相互作用 氢键 O 纤维素 π O N - π 相互作用 或 直链淀粉 H R 氢键 Y O N R H R1 R2 4 / 47

柱　型　号 固定相，官能团 拆分化合物类型 Chiralcel OA 纤维素三乙酯 脂肪酸族小分子化合物 Chiralcel OB 纤维素三苯甲酸酯 脂肪酸族和芳香族小分子化合物 Chiralcel OC 纤维素三苯氨基甲酸酯 环戊烯酮类 Chiralcel OD 纤维素（3,5-二甲苯基氨基甲酸酯） 生物碱，胺，莨菪碱，β-受体拮抗剂 Chiralcel OE 纤维素二苄醚 芳香化合物 Chiralcel OF 纤维素三（对氯苯基氨基甲酸酯） β-内酰胺，生物碱，二氢吡啶 Chiralcel OG 纤维素三（对甲苯基氨基甲酸酯） β-内酰胺，生物碱 Chiralcel OJ 纤维素三（对甲苯基甲酸酯） 甲基芳基酯，甲氧基芳基酯 Chiralcel OK 纤维素三肉桂酸酯 Chiralcel AD 淀粉三（3,5-二甲苯基氨基甲酸酯） Chiralcel AS 淀粉三（S）-1-苯乙基氨基甲酸酯 生物碱，胺，莨菪碱 Chiralpak OT(+) 聚三苯甲基乙丁烯酸酯 酯、酰胺、含磷化合物、芳香化合物 Chiralpak OP(+) 聚吡啶二苯甲基乙丁烯酸酯 酯、酰胺、含磷化合物

第二代手性色谱柱 －－H系列 CHIRALPAK® AD-H CHIRALCEL® OD-H CHIRALPAK® AS-H CHIRALCEL® OJ-H <特性> 1) 5 微米硅胶用于获得高的理论塔板数 2) 适用于痕量分析 3) 采用15cm长的手性柱可节省分析时间 9 / 47

Daicel手性色谱柱一览表 正相 直链淀粉衍生物 CHIRALPAK® AD / AD-H CHIRALPAK® AS / AS-H 纤维素衍生物 CHIRALCEL® OD / OD-H CHIRALCEL® OJ / OJ -H CHIRALCEL® OA, OB, OC CHIRALCEL® OF, OG, OK CHIRALCEL® CA-1 反相 CHIRALPAK® AD -RH CHIRALPAK® AS -RH CHIRALCEL® OD-RH CHIRALCEL® OJ -RH 共价键合型－新产品 CHIRALPAK® IA CHIRALPAK® IB CHIRALPAK® IC 其它 CROWNPAK® CR (＋), (－) CHIRALPAK® OT(＋), OP (＋) CHIRALPAK® WH, MA (＋) CHIRALPAK ® QD-AX CHIRALPAK ® QN-AX

CROWNPAK CR(+) 冠醚性手性色谱柱 * Chiral Crown Ether coated on silica * For amino acids (primary amino group near the chiral center) * Dipeptides

CROWNPAK CR的适宜条件 不推荐使用其它有机溶剂。 流动相 [HClO4 aq.] / [Methanol] = 100 / 0 - 85 / 15(v/v) 流动相中甲醇含量超过 15 vol% 不能用于这种手性柱!! 不推荐使用其它有机溶剂。 该柱不会被 K+离子破坏, 但它的存在会扰乱手性柱的识别能力。因此应该避免使用含有 K+ 离子的流动相。 压力力 max. 15 MPa 温度 0 – 50 °C 降低温度可有效地提高对手性化合物的选择性,尤其是对亲水样品。 pH 1 – 7 低pH可获得较好的分离度,但会缩短柱的寿命。 因此在满足分离条件下应该尽量选择高的pH，以提高柱的寿命。 The CROWNPAK CR contains a chiral crown ether as a chiral selector. Its chiral recognition can be achieved when a complex is formed between the crown ether and an ammonium ion derived from a sample. So this column can resolve not only 氨基酸 but also many compounds bearing a primary amino group near the chiral center, and it should be operated with an aqueous acidic mobile phase to form the ammonium ion. =READ= but make column life shorten. 36 / 47

CROWNPAK CR(+) 的拆分实例 用 CROWNPAK CR(+)分离氨基酸 Amino acids KD’ a Rs pH Flow rate (ml/min.) Temp. Alanine 0.38 1.86 3.17 1.5 0.4 25 Cysteine 0.44 1.67 3.31 Valine 1.09 1.51 3.47 Tyrosine 2.88 1.28 2.47 2.0 0.8 Norvaline 0.69 1.69 2.74 Asparagine 0.53 3.15 Leucine 1.44 3.73 Glutamine 0.25 2.13 3.11 Norleucine 1.76 1.66 3.38 Asparadic acid 0.61 2.01 4.07 Isoleucine 1.58 4.29 Gultamic acid 0.33 2.81 5.32 tert-leucine 2.06 1.10 0.70 1.0 Ornithine 0.65 1.49 2.82 Phenylalanine 3.88 1.27 2.80 Lysine 1.18 1.26 2.20 DOPA 2.02 1.32 2.62 Arginine 2.21 5.18 Methionine 1.05 2.00 5.87 Citruline 0.43 2.18 3.97 Ethionine 2.43 1.93 6.03 Proline 0.73 1.00 --- Phenylglycine 1.06 2.35 7.14 40 Histidine 0.90 1.82 528 Serine 0.48 1.75 3.04 Tryptophan 18.45 1.19 2.22 2. 1.2 Threonine 0.39 2.58 4.20

用 CROWNPAK CR(+)分离氨和氨基醇 Rs HClO4/pH 流量 (ml/min.) 温度 2.57 1.10 --- 1.0 0.4 1 1.84 1.15 0.60 8.44 1.31 3.27 1.5 0.8 25 0.67 1.58 1.26 1.67 1.42 1.99 1.54 1.30 1.36 4.19 1.23 2.55 2.0 0.6 10 9.07 1.18 2.14 0.54 1.83 3.20 37 / 47

CHIRALPAK® IA, IB，IC CHIRALPAK ® QD-AX CHIRALPAK ® QN-AX 第三代手性色谱柱 CHIRALPAK® IA, IB，IC CHIRALPAK ® QD-AX CHIRALPAK ® QN-AX

三种多糖键合型固定相 CHIRALPAK® IA CHIRALPAK® IB CHIRALPAK® IC Based on OR R RO n C H 3 N O OR R RO n C H H 3 N O C H 3 Based on amylose tris-(3,5-dimethylphenylcarbamate) Based on cellulose tris-(3,5-dimethylphenylcarbamate) CHIRALPAK® IC O OR R RO n C l N H Based on cellulose tris-(3,5-dichlorophenylcarbamate)

涂布型固定相 化学键合型固定相 多糖衍生物涂布在硅胶表面 多糖衍生物键合在硅胶表面 缺点: 流动相限制 优点: 通用于所有的溶剂

化学键合型手性固定相的优点 流动相选择具有很广的普适性，适用于任何互溶的有机溶剂体系 可选用任何溶剂来溶解样品，调节其溶解度 在广范的流动相体系中具有很高的手性分离能力 对某些手性化合物具有独特的手性识别能力 柱寿命长，可以再生 柱效高

键合柱的修复再生 修复再生后 （可使用各种强极性溶剂） 样品 新色谱柱 柱性能受损 （ 如受强吸附杂质的影响） 20/21

丰富的流动相组合体系 (Chiralpak IA) Methaqualone 丰富的流动相组合体系 (Chiralpak IA)　 2 4 6 8 10 12 14 50 100 150 200 250 2 4 6 8 10 12 50 100 150 200 250 300 2 4 6 8 10 12 14 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 10 20 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 正己烷/异丙醇 =80/20 k1’=1.45, =1.65 正己烷/乙酸乙酯 =80/20 k1’=1.87, =1.70 正己烷/丙酮 =85/15 k1’=1.42, =1.33 甲基叔丁基醚/乙醇 =95/5 k1’=0.73, =2.81 2 4 6 8 10 12 14 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 10 20 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 10 20 0.0 0.1 0.2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 0.1 0.2 0.3 正己烷/三氯甲烷 =50/50 k1’=0.64, =1.79 正己烷/二氯甲烷 =75/25 k1’=2.90, =2.36 正己烷/四氢呋喃 =85/15 k1’=3.14, =1.63 甲苯/正己烷/乙醇 =70/25/5 k1’=0.54, =1.96

CHIRALPAK® IC p-anisoin n-hexane / EtOH n-hexane / CH2Cl2 min 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 min 2 4 6 8 10 12 14 16 n-hexane / EtOH (75:25 v/v) k’1= 2.65 α = 1.07 Rs = 1.47 n-hexane / CH2Cl2 (20:80 v/v) k’1= 2.39 α = 1.19 Rs = 2.75 min 5 10 15 20 25 2 4 6 8 10 12 p-anisoin n-hexane / 2-PrOH (70:30 v/v) k’1= 4.54 α = 1.13 Rs = 2.60 n-hexane / ethyl acetate 60:40 v/v k’1= 0.89 α = 1.00 min min 2 4 6 8 10 12 14 min 2 4 6 8 10 12 n-hexane / THF (80:20 v/v) k’1= 2.02 α = 1.18 Rs = 2.75 MtBE / MeOH (98:2 v/v) k’1= 1.11 α = 2.16 Rs = 10.67

多种色谱分离模式---CHIRALPAK® IC THF 100% 1.0ml/min min 2 4 6 8 10 12 14 16 Praziquantel n-hexane / EtOH / TFA (85:15/0.1 v/v/v) CBZ-DL-Serine min 2 4 6 8 10 12 14 Tetramisole ACN / DEA (100:0.1 v/v) 1.0ml/min Polar mode ACN / H2O (50:50 v/v) 0.5ml/min min 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 1,1'-Bi(2-Naphthol) RP mode

CHIRALPAK® IA IB IC手性分离互补性 min 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 CHIRALPAK® IA k’1= 1.18 α = 1.04 min 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 CHIRALPAK® IB Prilocaine k’1= 1.21 α = 1.18 Rs = 1.21 Mobile phase: n-hexane / 2-PrOH / DEA (90:10:0.1 v/v/v) min 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 CHIRALPAK® IC k’1= 3.93 α = 1.25 Rs = 4.58

CHIRALPAK® IA IB IC手性分离互补性 min 2 4 6 8 10 k’1= 0.73 α = 1.00 1-benzocyclobutenecarbonitrile CHIRALPAK® IB min 2 4 6 8 10 k’1= 1.11 α = 1.36 Rs = 4.15 Mobile phase: n-hexane / 2-PrOH (90:10 v/v) CHIRALPAK® IC min 2 4 6 8 10 k’1= 2.32 α = 1.02

CHIRALPAK® IA IB IC手性分离互补性 n-hexane / EtOH (75:25 v/v) min 2 4 6 8 10 12 14 16 CHIRALPAK® IA k’1= 1.87 α = 2.07 Rs = 15.44 n-hexane / EtOH (85:15 v/v) CHIRALPAK® IB k’1= 1.81 α = 1.13 Rs = 2.34 Furoin 2 4 6 8 10 12 14 16 min n-hexane / EtOH (80:20 v/v) CHIRALPAK® IC min 2 4 6 8 10 12 14 16 k’1= 2.47 α = 1.04

维也纳大学 W.Lindner教授研究开发的离子交换型手性色谱柱 不对称炭原子临近的胺正离子和酸性官能基（X - )所形成的不对称环境是 手性化合物分离的基本作用力 手性识别剂 Quinine衍生物　　　 ＣＨＩＲＡＬＰＡＫⓇ　QN-AX：(8S, 9R)　　　 Quinidine衍生物　　ＣＨＩＲＡＬＰＡＫⓇ　QD-AX：(8R, 9S)　

N-保护氨基酸的分析实例 N-Ac-Ala N-Boc-Leu N-Ac-Ser 7.7 9.5 CHIRALPAKⓇ QD-AX MeOH/HAc=100/1(v/v) N-Ac-Ala N-Boc-Leu 4.7 5.6 CHIRALPAKⓇ QN-AX MeOH/HAc=100/1(v/v) N-Ac-Ser 7.6 9.5 CHIRALPAKⓇ QD-AX MeOH/AHAc=97/3(v/v)

内 容 1 Daicel多糖系手性色谱柱产品及应用特点 2 多糖系手性色谱柱的分析条件优化方法 2-1 正相条件 2-2 反相条件 内　　容 1 Daicel多糖系手性色谱柱产品及应用特点 2 多糖系手性色谱柱的分析条件优化方法 2-1 正相条件 2-2 反相条件 3 手性色谱制备流程

Daicel手性色谱柱一览表 正相 直链淀粉衍生物 CHIRALPAK® AD / AD-H CHIRALPAK® AS / AS-H 纤维素衍生物 CHIRALCEL® OD / OD-H CHIRALCEL® OJ / OJ -H CHIRALCEL® OA, OB, OC CHIRALCEL® OF, OG, OK CHIRALCEL® CA-1 反相 CHIRALPAK® AD -RH CHIRALPAK® AS -RH CHIRALCEL® OD-RH CHIRALCEL® OJ -RH 共价键合型－新产品 CHIRALPAK® IA CHIRALPAK® IB CHIRALPAK® IC 其它 CROWNPAK® CR (＋), (－) CHIRALPAK® OT(＋), OP (＋) CHIRALPAK® WH, MA (＋) CHIRALPAK ® QD-AX CHIRALPAK ® QN-AX

4种主要的正相柱和反相柱 OD OD-H OD-RH OJ OJ-H OJ-RH AD AD-H AD-RH AS AS-H AS-RH 普通 H 系列 CHIRALCEL® 系列 OD OD-H OD-RH OJ OJ-H OJ-RH CHIRALPAK® 系列 AD AD-H AD-RH AS AS-H AS-RH 柱长 25cm N.A. (I.D. : 0.46cm) 15cm R= n R= R= Here is the line up of main 4 columns. These “-H” means high-performance type and their particle sizes are 5micrometer, the others are 10micrometer. H types are improved version of general type. The size of general columns are 0.46cmI.D. x 25cmL, and the particle size is 10 micrometers. H types are both 0.46cmI.D. x 25cmL and 0.46cmI.D. x 15cmL, particle size is 5 micrometers. Sizes of columns for reversed phase are 0.46cmI.D. x 15cmL, particle size is 5 micrometers too. The features of H type columns are , 1st, high theoretical plate number. You can get sharp peaks and it is suitable for trace analysis. And because of the sharpness of H type columns, even if the length of columns are 15cmL theoretical plate number can be enough . 2nd, using 15cmL column, you can save your analytical time. I’ll show the data and chromatogram from now on. n R= 15/21

大赛璐（Daicel）手性柱应用的实际结果 化合物数量 ; 482 (2000-2002) 不能分离 10% (47) 部分分离 10% (47) 基线分离 80% (388) 下面，让我来具体介绍一下大赛璐的手性色谱柱。 In our Lab. we provide a column selection service and separation service. This is the result from 2000 to 2001. The number of samples is 288. With DAICEL’s chiral column, 90% of samples are completely or partially resolved. Only 10% of racemates could not be separated. Those are such as huge compounds or very simple carbon chain which doesn’t have enough interaction point. More than 90% of racemates can be resolved on DAICEL’s chiral columns! More than 90% of racemates can be resolved on DAICEL’s chiral columns!!! 采用Daicel手性柱 90 % 以上的手性化合物可以分离 5 / 47

H 系列手性柱的典型分析条件 CHIRALCEL® OD-H, OJ-H CHIRALPAK® AD-H, AS-H (柱尺寸 : 0.46cmI.D.×25cmL or 15cmL ) 流动相 用于中性样品 : 正已烷/异丙醇 = 90/10(v/v) 用于酸性样品 : 正已烷/异丙醇/TFA* = 90/10/0.1(v/v/v) 用于碱性样品 : 正已烷/异丙醇/DEA* = 90/10/0.1(v/v/v) 操作温度 0 - 40 oC 柱压 max. 10MPa (102kgf/cm2) 流量 1.0 mL/min 流动相组成 正已烷/异丙醇 = 100/0 - 0/l00 (v/v) 正已烷/乙醇 = 100/0 - 0/100 (v/v) * TFA: 三氟乙酸 DEA: 二乙胺 これら主要４種Ｈシリーズの使用条件がこちらです。使用可能溶媒はヘキサン/2-プロパノールまたはエタノール、これらはゼロから１００％までのあらゆる混合割合の元で使用可能となっております。塩基性試料測定の際はジエチルアミンを、酸性試料測定の際にはトリフロロ酢酸または酢酸の添加をお勧め致します。また、使用温度範囲は０―４０℃、圧力は10MPa以下でご使用いただけます。 以上が、弊社製多糖誘導体系カラムの基本的な解説でした。続きましては、これらを用いて、光学異性体試料の分割条件を探索する一般的な手順についてご説明させていただきます。 17 / 47

分析条件优化流程图 (1) 配制流动相 1. 流动相中添加物的必要性 酸性 碱性 中性 样品 Hex/IPA/TFA =90/10/0.1 Hex/IPA/DEA =90/10/0.1 配制流动相

添加物在分离中的作用 酸性样品 碱性样品 流动相 Hex/IPA=90/10 Hex/IPA/HAc=90/10/0.1 Minutes 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 mV 5 10 15 20 25 30 35 40 5 10 15 20 25 30 35 mV 1 2 3 4 6 7 8 9 11 12 13 14 Minutes 6.66 7.52 酸性样品 （没出峰 ) 流量：1.0mi/min.温度：40℃、检测波长：ＵＶ（254ｎｍ） 流动相　Hex/IPA=90/10 Hex/IPA/HAc=90/10/0.1 碱性样品 -0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 mV 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Minutes 10.94 0.40 mV Minutes 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 10.74 13.96 （无法分离 ) 流量：1.0mi/min. 温度：25℃、检测波长：ＵＶ（254ｎｍ） 流动相　Hex/IPA=90/10 Hex/IPA/DEA=90/10/0.1

添加物的种类和用量 样品酸碱性 添加物种类 添加量 中性 不需要 碱性 二乙胺 (DEA) (n-丁胺*1) (乙醇胺*2) ≦0.5％ 通常0.1％ 酸性 三氟乙酸 (TFA) 醋酸 *1 主要用于1级胺 *2 主要用于1级氨基醇

分析条件优化流程图 (2) 长 短 选择合适的手性柱 2. 配制好流动相 分析 保留时间? 增加 异丙醇 增加 正已烷 适宜的分析时间 (10-30 min.) 选择合适的手性柱

分析条件优化流程图 （3） 3. 选择合适的手性柱 分离？ 基线分离 没有分离 部分分离 尝试别的手性柱 OK! 继续优化分析条件

先择效果最好的手性柱, 然后继续优化分析条件 筛选结果 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1 2 3 4 6 7 8 9 11 12 13 14 Minutes 4.68 4.82 OB mV 6.71 6.87 OD 65 -5 6.66 7.52 AD OJ 70 80 4.70 90 AS 100 OC 4.36 OG OF 色谱条件 流动相： Hex./IPA/ HAc = 90/10/0.1 流量 ：1.0ml/min. 温度 ：40℃ 检测波长 ：UV254nm 样品 ： 先择效果最好的手性柱, 然后继续优化分析条件

分析条件优化流程图 （4-A） 4.分析条件继续优化 部分分离 C.调整温度 B.更换醇类 A.降低异丙醇浓度

在多数情况下，降低醇的浓度可延长保持时间，改善分离度 醇浓度的影响 5 10 15 20 25 30 35 mV 1 2 3 4 6 7 8 9 11 12 13 14 Minutes 6.66 7.52 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 mV 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Minutes 35.77 43.71 Hex./IPA/ HAc =90/10/0.1 Hex./IPA/ HAc=100/1/0.1 Column：AD, Temp.：40℃, Flow rate：1.0ml/min. Sample：Flurbiprofen 在多数情况下，降低醇的浓度可延长保持时间，改善分离度

分析条件优化流程图 （4-B） 4.分析条件继续优化 部分分离 C.更换醇类 B.调整温度 A.降低异丙醇浓度

温度的影响 降低柱温可增大α值，但会使峰形变宽 Temp.： 5℃ 25℃ 40℃ 升高柱温会减少α值，但会使峰形尖锋 α:1.59 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Minutes 8.72 12.13 α:1.59 mV 20 25 30 35 6.66 7.52 α:1.23 7.66 9.12 α:1.32 Temp.： 5℃ 25℃ 40℃ Column：CHIRALPAK AD Mobile phase： Hex./IPA/ AcOH =90/10/0.1, Flow rate：1.0ml/min. 降低柱温可增大α值，但会使峰形变宽 升高柱温会减少α值，但会使峰形尖锋

分析条件优化流程图 （4-C） 4.分析条件继续优化 部分分离 C.更换醇类 B.调整温度 A.降低异丙醇浓度

IPA和EtOH有时会使峰形和α值发生明显变化 醇种类的影响 5 10 15 20 25 30 35 mV 1 2 3 4 6 7 8 9 11 12 13 14 Minutes 6.66 7.52 a =1.23 5 10 15 20 25 30 1 2 3 4 6 7 8 9 11 12 13 14 7.58 9.64 a =1.45 mV Minutes Hex./IPA/HAc=90/10/0.1 Hex./EtOH/HAc=95/5/0.1 Column：CHIRALPAK AD Temp.：40℃, Flow rate：1.0ml/min. Sample：Flurbiprofen IPA和EtOH有时会使峰形和α值发生明显变化

正相柱分析条件优化的总结 根据样品性质判断是否需要往流动相中加添加物 调整正己烷/醇的比例，从而选择适当的保留时间 其它优化方法 流动相的醇浓度 降低醇的浓度能改善分离度，但会延长分析时间 色谱柱温度 降低柱温能增加α值，但会使峰形变宽 流动相中醇的种类 改换醇的种类(IPA⇔EtOH)，有时会使选择性发生一些变化

内 容 1 Daicel多糖系手性色谱柱产品及应用特点 2 多糖系手性色谱柱的分析条件优化方法 2-1 正相条件 2-2 反相条件 内　　容 1 Daicel多糖系手性色谱柱产品及应用特点 2 多糖系手性色谱柱的分析条件优化方法 2-1 正相条件 2-2 反相条件 3 手性色谱制备流程

RH系列（反相用）的规格 流动相 耐压 (MPa) 温度范围 (℃) pH范围 OD-RH 水溶液/有机溶剂*1 =90/10~0/100 5～40 2～7 OJ-RH AS-RH 5～40*2 2～9*2,3 AD-RH *1 有机溶液：醇（甲醇，乙醇，异丙醇）或乙腈 *2 pH＞7使用时，温度在5～25℃ *3 pH超过8时，使用硼酸缓冲液

根据样品性质选择流动相 ODRH/OJRH 碱性化合物 酸性化合物 中性化合物 CHIRALCEL OD-R 250×4.6mm ID CHIRALCEL OD-RH 150×4.6mm ID 水溶液 100mMKPF6 (或NaPF6) 用H3PO4调节pH2.0 不能使用强碱性流动相(> pH 7)，因为这样会损坏填料中的硅胶成分。 50-100mM 磷酸缓冲液 pH2.0 水 H3PO4水溶液 有机溶剂添加剂 乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇 探索初始流动相 水溶液：60% 有机溶剂添加剂：40%

根据样品性质选择流动相 ASRH/ADRH 碱性化合物 酸性化合物 中性化合物 CHIRALPAK AD-RH 150×4.6mm ID CHIRALPAK AS-RH 150 x 4.6 mm ID 水溶液 20mM 硼酸缓冲液 (H3BO3/Na2B4O7) pH 9.0 50mM 磷酸缓冲液 pH2.0 水 (KH2PO4/K2HPO4) pH 8.0 H3PO4水溶液 pH大于7.0时，温度必须在5°C 到25°C之间。 有机溶剂添加剂 乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇 探索初始流动相 水溶液：60% 有机溶剂添加剂：40%

反相流动相的pH值对分离度的影响(AS-RH) 中性化合物 Benzoin 酸性化合物 N-CBZ-Norvaline 碱性化合物 Ofloxacin ethyl ester 水溶液/CH3CN=60/40 流速：1.0ml/min. 水溶液/CH3CN=60/40 流速：1.0ml/min. 水溶液/CH3CN=80/20 流速：0.5ml/min. 水溶液 15 7.16 8.77 2 4 6 8 10 12 mV 1 3 5 7 9 Minutes 2.25 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 mV 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Minutes 27.79 mV 10 水 5 2 4 6 8 10 12 14 Minutes 5 10 15 mV 2 4 6 8 12 14 Minutes 7.11 8.70 20 4.17 4.69 20 40 60 80 mV 5 10 15 25 30 35 45 50 55 Minutes 4.00 4.48 4.77 15 磷酸水溶液 (pH2) mV 10 5 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 Minutes 5 10 15 mV 2 4 6 8 12 14 Minutes 6.97 8.53 10 20 30 40 50 60 70 mV 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Minutes 1.85 8.0 30.74 36.78 6.0 硼酸缓冲液 (pH9) 4.0 2.0 0.0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Minutes

有机溶剂种类对分离的影响 水/乙腈 =50/50 水/乙醇 =35/65 水/甲醇 =25/75 2-Methyl-1-tetralone 2-Phenyl-2-butanol 水/乙腈 =50/50 水/乙醇 =35/65 水/甲醇 =25/75 手性柱：CHIRALPAK AD-RH 、流速：0.5ml/min、温度：25℃

反相柱分析条件优化的总结 根据样品性质选择流动相 探索适当的保留时间和流动相组成 其它优化条件 水溶液和有机溶液比例 色谱柱温度 ※中性，酸性样品对4种反相柱的流动相是一致的。 但是，碱性样品对OD-RH、OJ-RH的流动相和AD-RH、AS-RH的流动相是不同的。 探索适当的保留时间和流动相组成 其它优化条件 水溶液和有机溶液比例 多数情况下降低有机溶液的浓度能改善分离，但会延长分析时间。　　 色谱柱温度 降低柱温能增加α值，但会使峰形变宽。 有机溶剂的种类 有机溶剂的种类不同，其洗脱强度也不同。有时其分离效果也发生一些变化

内 容 1 Daicel多糖系手性色谱柱产品及应用特点 2 多糖系手性色谱柱的分析条件优化方法 2-1 正相条件 2-2 反相条件 内　　容 1 Daicel多糖系手性色谱柱产品及应用特点 2 多糖系手性色谱柱的分析条件优化方法 2-1 正相条件 2-2 反相条件 3 手性色谱制备流程

手性单一对映体的一般制备方法 手性分离分析是支撑手性技术发展的重要部分 市场比率 2002年手性技术领域的内容分布 55.0 % 手性拆分法 生物催化法 35.0 % 不对称合成法 10.0 % 生物催化法 不对称合成法 手性拆分法 手性分离分析是支撑手性技术发展的重要部分

半制备柱生产线 － 柱 － CHIRALPAK® AD-H CHIRALPAK® IA CHIRALPAK® AS-H CHIRALPAK® IB CHIRALCEL® OD-H CHIRALPAK® IC CHIRALCEL® OJ-H － 尺寸 － 1 cmI.D. × 25 cmL 2 cmI.D. × 25 cmL 39 / 47

－优势－ 色谱获得手性化合物 1) 容易获得手性化合物，不需要特殊的方法 (生化法, 手性合成等)。 2) 易于建立分离条件， 90%以上的手性化合物可以得到分离/　　　　　　 制备 3) 制备速度快：从色谱柱筛选到样品制备平均２～３日（mg ～g）。 4) 易于得到高纯度的手性化合物，光学纯度 ee 可> 99%，收率 可>90%。 40 / 47

－制备程序－ 大赛璐（中国）在手性样品的制备方面有得天独厚的优势 ① ② ③ 快速度，高质量，低成本 确定制备柱 [ 筛选固定相] 确定制备条件 [溶解度，负荷实验] 确定制备程序 自动化连续制备 筛选速度快，应用范围广 ·拥有20种以上的手性色谱柱 ·可使90%以上的手性化合物得到分离 制备效率高 ·制备条件建立，优化 [ 大赛璐具有近20年的丰富经验 ] 提高制备效率 自动/连续式制备 快速度，高质量，低成本 ① ② ③ 大赛璐（中国）在手性样品的制备方面有得天独厚的优势 ２０多种固定相 ２０多年的制备经验

①确定制备柱（筛选固定相） 约6小时可获得16条件的色谱图 ⇒1色谱图平均约20分钟 自动化筛选设备 ・岛津 LC20 5套 ・一套可同时筛选12根柱子 ・条件设定⇒自动筛选　 手性色谱柱筛选设备的特征 约6小时可获得16条件的色谱图 ⇒1色谱图平均约20分钟

②确定制备条件 ·选择制备柱的尺寸 ·决定进样量 ·设定取样时间和进 样间隔 1）溶解度实验，稳定性实验 2）负载实验（Loading Study） ·选择制备柱的尺寸 ·决定进样量 ·设定取样时间和进 样间隔 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 Time (min.)

③确定自动制备程序 自动化制备设备 ・日本YMC-Kprep 3套 ・连续制备：自动进样，自动取样 以φ2cm 、25cm半制备柱为例 ・连续制备：自动进样，自动取样　 以φ2cm　、25cm半制备柱为例 制备能力：消旋体1～２g/day（8Hr）

5个工作日 光学纯品各得到5000mg

大赛璐手性制备业务规划 2009年 ・制备HPLC：8台 ・制备SFC：6台 ・制备SMB：1台 【实验室规模】 2008年 【工业化规模】 2008年 ・制备HPLC：5台 ・制备SFC：4台 ・制备SMB：1台 【实验室规模】 2007年 ・制备HPLC：3台 ・制备SFC：2台

大赛璐手性化合物制备 – 客户信息保密 安心，快速，高质量，低成本 客户信息保密 客户不必公开化合物结构式！ ·与客户密切沟通 ·签订保密合同 ·确立制备条件 ·签订服务合同 ·样品制备 ·样品寄送 ·客户确认样品 ·完结合同内容 客户不必公开化合物结构式！ （只需提供化合物的酸，碱性等基本信息） 签订保密合同，加强保密管理 （从硬件和软件两方面管理） 客户信息保密 安心，快速，高质量，低成本

总 结 Daicel 手性柱有很广泛的应用。 Daicel 手性柱可成功分离90%以上的手性化合物。 4种主要的手性柱有优异的手性辨别能力。 总　　结 Daicel 手性柱有很广泛的应用。 Daicel 手性柱可成功分离90%以上的手性化合物。 4种主要的手性柱有优异的手性辨别能力。 　　主要的4种手性柱 普通 OD, OJ, AD, AS H 系列 OD-H, OJ-H, AD-H, AS-H 反相 OD-RH, OJ-RH, AD-RH, AS-RH (4) 通过使用添加剂，调整流动相中醇的比例或种类，或者温度，可得到最佳分析方法。 (5) 使用Daicel手性半制备柱，与大赛璐“强强联合”，您可轻易地获得高纯度的手性化合物。 最後に、まとめてもう一度要点を申し上げます。 その１。(読む） その２．しかし、分割はカラム選択だけでは達成されません。分析条件の適切な選択があって初めて、良好な分割がなされるのです。 すなわち、HPLCによる光学異性体分割という解は、カラムの選択と測定条件の両方が必須であり重要、すなわちこれらの積によって達成されるものであります。つきましては、本日ご紹介させていただきました内容が、皆様のご業務上における、より良いカラム選択とより迅速な分析条件選定のお役に、少しでも立てましたらまことに光栄でございます。 最後に、“D”と“L”を分ける、ダイセル化学工業の光学異性体分割カラムを、皆様どうぞよろしくお願い致します。 47 / 47

谢谢！