1．2 核酸分子的结构及其空间构象 核酸 脱氧核糖核酸 核糖核酸 （DNA） （RNA） 主要存在于： 在细胞核内产生， 细胞核内的染色质中 遗传信息的携带者 蛋白质合成中起主要作用 主要存在于： 细胞核内的染色质中 线粒体 叶绿体 在细胞核内产生， 然后进入细胞质

核酸的基本单位：核苷酸（nucleotide） 1.2.1 核酸的基本化学组成 组成元素： C、H、O、N、P等。 不同于蛋白质的组成特点： 1、核酸一般不含元素 S 2、核酸中P元素含量较多，并用恒定，约9%～10%。 （可作为经典的核酸测定方法，通过测定P含量，来确定核酸量。） 核酸的基本单位：核苷酸（nucleotide） 磷酸 水解 水解 核苷酸 核酸 戊糖（pentose） 水解 核苷 碱基（base） nucleotide nucleoside

1.2.2 核酸的基本结构单元——核苷酸 每一个核苷酸的组成：一个戊糖分子、一个磷酸分子和一个含氮的有机碱。 戊糖分子第一位C与有机碱结合，成为糖苷 磷酸 脱氧核苷酸 脱氧核糖（deoxyribose） 脱氧核糖核苷 核糖核苷 核糖 （ribose） 核苷酸 嘌呤碱（purine）：鸟嘌呤（guanine）、腺嘌呤（adenine） 碱基 嘧啶碱（pyrimidine）：胞嘧啶（cytosine）、尿嘧啶（uracil ) 、胸腺嘧啶（thymine） （只存于DNA） （只存于RNA）

构成核酸的戊糖 链状结构 核糖 2-脱氧核糖 环状结构 核糖 2-脱氧核糖

构成的核酸的杂环碱 嘌呤： 嘧啶： 腺嘌呤(Adenine，A) 鸟嘌呤(Guanine，G) 6—氨基嘌呤 2—氨基6—氧嘌呤 胸腺嘧啶 6—氨基嘌呤 2—氨基6—氧嘌呤 嘧啶： 胸腺嘧啶 (Thymine，T) 尿嘧啶 (Uracil，U) 胞嘧啶 (Cytonine，A)

核糖核酸和脱氧核糖核酸的区别 核糖核酸（RNA）含有的戊糖是核糖，含有的杂环碱有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶 脱氧核糖核酸（DNA）含有的戊糖是2-脱氧核糖，含有的杂环碱有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶

戊糖与杂环碱形成的苷叫核苷，RNA的四种核苷是： 鸟嘌呤核苷 腺嘌呤核苷 尿嘧啶核苷 胞嘧啶核苷

DNA的四种核苷 腺嘌呤脱氧核苷 鸟嘌呤脱氧核苷 胞嘧啶脱氧核苷 胞腺嘧啶脱氧核苷

核苷中糖的5´（核酸中糖的碳原子的位次以1´ ，2´ ，3´ …表示）羟基，与磷酸形成的酯，叫做核苷酸。如： 腺嘌呤脱氧核苷酸 尿嘧啶核苷酸 核苷酸在碱溶液中水解，即失去磷酸生成核苷。

1.2.3 核酸 核酸是由许多核苷酸单元所构成的高分子化合物。核苷酸单元通过磷酸酯键，在戊糖的3´位上联结起来。如：RNA结构示意图

核酸的结构 一级结构：核酸链中，含不同碱基的各种核苷酸按一定的排列次序互相联结，形成了核酸的一级结构。 高级结构：核酸链在空间还有一定的排布方式，并且还要进一步盘绕成一定的形态，从而形成核酸的更高级结构。

DNA的双螺旋结构 DNA的二级结构：两条反向平行的DNA链，沿着一个轴向右盘旋成双螺旋体。 在双螺旋体中，一条脱氧核糖体核酸链上的碱基与另一条链上的碱基之间，通过氢键相互联结。 嘌呤碱和嘧啶碱两两成对： 腺嘌呤（A）—— 胸腺嘧啶（T） 鸟嘌呤（G）—— 胞嘧啶（C） 双螺旋体一般不单独存在，而是与蛋白质以更复杂的形式结合，形成具有各种生理活性的核蛋白。

腺嘌呤—胸腺嘧啶键 A —T 鸟嘌呤—胞嘧啶键 G —C

DNA的双螺旋结构示意图 1953年，Watson和Crick根据DNA晶体X衍射图谱 和Chatgaff 应用紫外分光光度法结合层析等技术， 对不同来源DNA进行了碱基定量分析， 提出了DNA双螺旋结构模型。

核酸的功能 核酸具有极其重要的生理功能，是遗传生物遗传的物质基础。 DNA：主要存在于细胞核中，是遗传信息的携带者，DNA的结构决定生物合成蛋白质的特定结构，并保证把这种特性遗传给下一代。 RNA：主要存在于细胞质中，它们是以DNA为模板形成的，并且直接参加蛋白质的生物合成过程 存在于DNA分子上的遗传信息由DNA传递给RNA，再传递给蛋白质，通过DNA的复制，遗传信息一代代传下去。

核酸的性质 1、一般性质：两性电解质，相当于多元酸，有较强酸性。 解离状态随溶液pH改变， 等电点：当酸性解离与碱性解离相等， 所带正电荷与负电荷相等，静电荷为0。 核酸等电点较低，如酵母RNA的pI为2.0-2.5。 可调整溶液pH至等电点，将RNA从溶液中沉淀出来。 根据核酸的解离性质，用中性或偏碱性的缓冲溶液 使核酸解离成阴离子， 置于电场中便向阳极移动，这就是电泳。 凝胶电泳是研究核酸常用方法。 常用的缓冲液：琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶。 分离效率高的原因：凝胶电泳具有分子筛和电泳双重效果。

2、核酸的紫外吸收性质 核酸中的嘌呤碱和嘧啶碱具有大π键， 使碱基、核苷、核苷酸和核酸 在240-290的紫外波段有强烈吸收峰。 DNA钠盐紫外吸收在260nm 附近有最大吸收值，（如图示） 吸光率A260是核酸重要性质。 RNA钠盐吸收曲线与DNA无明显区别。 不同核苷酸有不同的吸收特性， 可用紫外分光光度仪加以定量定性测定。

3. 核酸的变性和复性 变性（denaturation): 核酸双螺旋区的氢键断裂， 变成单链的无规则线团， 使核酸某些光学性质和流体力学性质发生改变， 有时部分或全部生物活性丧失， 并不涉及共价键的断裂。 DNA稀盐溶液 加热至80-100℃， 双螺旋结构解体，形成无规则线团， 理化性质变化，如粘度降低，浮力密度升高， 同时二级结构变化，部分或完全失活。 增色效应(hyperchromic effect): DNA变性使双螺旋解体，碱基堆积消失， 原来内部的碱基暴露，从而使变性后的DNA在260nm紫外吸光率比变性前明显升高。

引起核酸变性的条件：加热、极端pH、有机溶剂、酰胺、尿素等。 热变性 酸碱变性 尿素是 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定DNA序列 常用变性剂。 甲醛 常用于 琼脂糖凝胶电泳测定RNA的分子大小。 DNA变性温度（DNA熔点或熔解温度） Tm： 紫外吸收增加到总增加值一半时的温度。 DNA Tm： 70-85 ℃，常在 0.15 M NaCl, 0.015M 柠檬酸三钠溶液中进行测定。 （sodium chloride-sodium citrate, SSC)

注意：RNA也会发生变性，但Tm较低，且变性曲线也不如DNA陡。 DNA Tm大小与下列因素有关： DNA均一性。 越高，熔解过程在越小的温度范围内发生。 G-C含量。 越高， Tm越高，并与G-C含量成正比关系。 （因为G-C比A-T更稳定。） 由Tm 值测定G-C含量： （G-C）%= （Tm-69.3) ×2.44 介质中的离子强度。越低，Tm越低，溶解温度范围较宽。 越高， Tm越高。 问题： DNA常保存在 1M NaCl中，为什么DNA制品应保存在较高浓度的缓冲液或溶液中？ DNA来源： 1.草分支杆菌 2. 沙门氏杆菌 3. 大肠杆菌 4. 鲑鱼精子 5. 小牛胸腺 6. 肺炎球菌 7. 噬菌体T6 8. 多聚d(A-T) 注意：RNA也会发生变性，但Tm较低，且变性曲线也不如DNA陡。

变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链重新缔合（reassociation)，成为双螺旋结构。 DNA复性（renaturaton): 变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链重新缔合（reassociation)，成为双螺旋结构。 DNA复性：理化性质恢复，生物活性部分恢复。 复性过程符合二级反应动力学： 第一步缓慢，依靠随机碰撞找到一段碱基配对部分，并首先形成双螺旋。 第二步迅速，未配对其他部分按碱基配对相结合，象接锁链似的迅速形成双螺旋。

反应进与许多因素有关：将热变性DNA骤然冷却，不可能复性。 用同位素标记双链DNA片段进行分子杂交，为获得单链杂交探针，要将装有热变性DNA溶液的试管直接插入冰浴，使溶液在冰浴中骤然冷却至0℃.从而使单链DNA分子失去碰撞的机会，不能复性，从而保持单链变性的状态。这一过程称为“淬火”（quench)。 热变性DNA在缓慢冷却时，可以复性，这种复性称为退火（annealing).

DNA 片段越大，复性越慢。 DNA浓度越大，复性越快。 减色效应 （hypochromic effect): DNA 复性后，其溶液A260值减少。 （最多可至变性前的A260值）。 可用减色效应大小来跟踪DNA复性过程的程度。

常用不同介质组成密度梯度进行超离心分离核酸。 RNA分离常用蔗糖梯度， DNA分离常用氯化铯梯度。 4. 核酸的沉降特性 溶液中的核酸分子在引力场中可以下沉， 不同构象的核酸（线形、开环、超螺旋结构）、 蛋白质及其他杂质在超离心机的强大力场中， 沉降的速度有很大差异。 因此： 可用超离心法纯化核酸， 将不构象的核酸分离， 测定核酸的沉降常数与分子量。 常用不同介质组成密度梯度进行超离心分离核酸。 RNA分离常用蔗糖梯度， DNA分离常用氯化铯梯度。 （氯化铯在水中有较大溶解度，可制成8M的溶液。 实验室纯化质粒DNA常用方法： 应用镍化乙锭-氯化铯梯度平衡超离心，将不同构象的DNA、RNA及蛋白质分开。

垂直转头，65000r/min：6h 角转头，45000r/min：36h 紫外光下观察，用注射针头从离心管侧面刺入，收集不同物质。如：超螺旋DNA， 透析除氯化铯， 再用苯酚抽提1-2次， 用乙醇将DNA沉淀出来。 得到 很高纯度的DNA 可供DNA重组、测定序列及绘制限制酶图谱。 如需要更纯的DNA，可再进行一次梯度超离心分离。

1.3 测定生物大分子结构的物理方法 1.3.1 生物大分子的形态结构测定

电镜 ：透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM） 直接测量大分子的形态和大小。

分辨率：可以分辨的两个点之间的最小距离。 Θ是物镜对象的张角，也称孔径角。 提高分辨率的方法： 最有效的是缩短光源波长。 德布罗意波： E0 = hν P=h/λ P=mv λ =h/P= h/mv 对于电镜： V为加速电压

样品必须制成电子能穿透的，厚度为100～2000 Å的薄膜。 成像方式与光学生物显微镜相似，只是以电子透镜代替玻璃透镜。 放大后的电子像在荧光屏上显示出来。 TEM的分辨本领能达 3 Å左右。在特殊情况下能更高些。 (1)超高压电镜 (HVEM)　是一种TEM，不过常用的 TEM加速电压为 100 kV。 只能穿透几千埃厚的样品。 电子的穿透能力随 2 ＝ v2/c2 ( 电子速度与光速之比 )而增。 由于相对论性效应，2在 500 kV以上增加得就很慢了。 目前有200 kV、300 kV和1000 kV的商品电镜。 法国和日本有3000 kV的特制电镜。 HVEM除加速筒以外与一般 TEM相似，只是尺寸放大了。 1000 kV的电镜有两层楼高。 放大尺寸后，样品周围空间增大，便于安置各种处理样品的附件， 如拉伸、加热、冷却、化学反应等副件，并能把它们与倾斜样品台结合起来； 还可以做动态观察，用电视记录样品处理过程中的变化。 高能量的电子能造成样品中的辐射损伤， 这对研究材料辐射损伤的微观机理带来极大的方便。

(2) 高分辨电镜(HREM)　提高加速电压，使电子波长更短，能提高分辨本领。 由于技术上的难度高，所以至70年代初超高压电镜主要针对提高穿透率。 70年代末至80年代初技术上的提高带来了200 kV、300 kV的高分辨商品电镜 及个别500 kV、600 kV和1000 kV的HREM。 分辨本领能达2 Å左右。不久将能达到1.5 Å 。 由于生物学分子极易被辐照损伤， 所以目前HREM主要用于观察无机材料中的原子排列。

扫描电镜 特点： 1.按时间序列取出信号，便于样品随时间变化以及信号容易记录。 2. 可从电子线路方面进行图像处理。 3. 若照射产生X射线、光、俄歇等信号， 还可进行表面显微化学分析和表面显微物性研究。

电子波经过薄晶样品后，携带了样品沿电子束方向的投影信息， 衍射到达物镜后焦后，即可得到一电子衍射象， 改变样品可得到一系列样品衍射象，从而可得到晶体结构。 目前，用于研究三维重建的生物材料 主要是膜蛋白结晶体等易于形成膜结晶的生物大分子。

1.3.2 扫描隧道显微镜 Scanning Tunneling Microscope STM 1982年 IBM 瑞士苏黎士实验室的葛·宾尼和海·罗雷尔 世界上第一台STM 人类第一次能够 实时观察单个原子在物质表面的排列状态 与表面电子行为有关的物化性质。 在表面科学、材料科学、生命科学等领域研究中重大 的意义和广泛的应用。 国际科学界公认80年代世界十大科技成就之一。 1986年宾尼和罗雷尔被授予诺贝尔物理学奖。

人的眼睛不能直接观察到比10-4m更小的物体或物质的结构细节，

扫描电子显微镜（SEM）的分辨率为10-9m， 电子显微镜的发明开创了物质微观结构研究的新纪元， 扫描电子显微镜（SEM）的分辨率为10-9m， 高分辨透射电子显微镜（HTEM） 和扫描透射电子显微镜STEM） 可以达到原子级的分辨率——0．1nm 主要用于薄层样品的体相和界面研究，且要求特殊的样品制备技术和真空条件

场离子显微镜（FIM）是一种能直接观察表面原子的研究装置，但只能探测半径小于 100 nm的针尖上的原子结构和二维几何性质，且样品制备复杂，可用来作为样品的材料也十分有限. X射线衍射和低能电子衍射等原子级分辨仪器，不能给出样品实空间的信息，且只限于对晶体或周期结构的样品进行研究．

与其他表面分析技术相比，STM具有如下独特的优点： 1.具有原子级高分辨率，STM 在平行于样品表面方向上的分辨率分别可达 0．I nm 和 0．01 nm，即可以分辨出单个原子． 中国科学院化学所的科技人员利用纳米加工技术在石墨表面通过搬迁碳原子而绘制出的世界上最小的中国地图

2. 可实时得到实空间中样品表面的三维图像，可用于具有周期性或不具备周期性的表面结构的研究，这种可实时观察的性能可用于表面扩散等动态过程的研究． 3. 可以观察单个原子层的局部表面结构，而不是对体相或整个表面的平均性质，因而可直接观察到表面缺陷。表面重构、表面吸附体的形态和位置，以及由吸附体引起的表面重构等．

硅111面77原子重构象 为了得到表面清洁的硅片单质材料，要对硅片进行高温加热和退火处理，在加热和退火处理的过程中硅表面的原子进行重新组合，结构发生较大变化，这就是所谓的重构。

4. 可在真空、大气、常温等不同环境下工作，样品甚至可浸在水和其他溶液中 不需要特别的制样技术并且探测过程对样品无损伤．这些特点特别适用于研究生物样品和在不同实验条件下对样品表面的评价，例如对于多相催化机理、超一身地创、电化学反应过程中电极表面变化的监测等。 液体中观察原子图象 上图所示的是在电解液中得到的硫酸根离子吸附在铜单晶(111)表面的STM图象。图中硫酸根离子吸附状态的一级和二级结构清晰可见。

5. 配合扫描隧道谱（STS）可以得到有关表面电子结构的信息，例如表面不同层次的态密度。表面电子阱、电荷密度波、表面势垒的变化和能隙结构等． 6. 利用STM针尖，可实现对原子和分子的移动和操纵，这为纳米科技的全面发展奠定了基础．

1990年，IBM公司的科学家在金属镍表面用35个惰性气体氙原子组成“IBM”三个英文字母。

隧道电流 扫描隧道显微镜(Scanning Tunneling Microscope)的工作原理是基于量子力学中的隧道效应。 对于经典物理学来说，当一个粒子的动能E低于前方势垒的高度V0时，它不可能越过此势垒，即透射系数等于零，粒子将完全被弹回。而按照量子力学的计算，在一般情况下，其透射系数不等于零，也就是说，粒子可以穿过比它能量更高的势垒(如图1)这个现象称为隧道效应。

隧道效应是由于粒子的波动性而引起的，只有在一定的条件下，隧道效应才会显著。经计算，透射系数T为： T与势垒宽度a，能量差(V0-E)以及粒子的质量m有着很敏感的关系。随着势垒厚(宽)度a的增加，T将指数衰减， 因此在一般的宏观实验中，很难观察到粒子隧穿势垒的现象。

隧道电流I是电子波函数重叠的量度，与针尖和样品之间距离S以及平均功函数Φ有关： 扫描隧道显微镜的基本原理是将原子线度的极细探针和被研究物质的表面作为两个电极，当样品与针尖的距离非常接近 (通常小于1nm) 时，在外加电场的作用下，电子会穿过两个电极之间的势垒流向另一电极。 隧道电流I是电子波函数重叠的量度，与针尖和样品之间距离S以及平均功函数Φ有关： 式中Vb是加在针尖和样品之间的偏置电压，平均功函数 Φ1和Φ2分别为针尖和样品的功函数，A为常数，在真空条件下约等于1。

隧道探针一般采用直径小于1mm的细金属丝，如钨丝、铂-铱丝等，被观测样品应具有一定的导电性才可以产生隧道电流。

扫描隧道显微镜的工作原理 隧道电流强度对针尖和样品之间的距离有着指数依赖关系，当距离减小0.1nm，隧道电流即增加约一个数量级。因此，根据隧道电流的变化，我们可以得到样品表面微小的高低起伏变化的信息，如果同时对x-y方向进行扫描，就可以直接得到三维的样品表面形貌图，这就是扫描隧道显微镜的工作原理。 扫描隧道显微镜主要有两种工作模式：恒电流模式和恒高度模式。

x-y方向进行扫描，在z方向加上电子反馈系统，初始隧道电流为一恒定值，当样品表面凸起时，针尖就向后退；反之，样品表面凹进时，反馈系统就使针尖向前移动，以控制隧道电流的恒定。将针尖在样品表面扫描时的运动轨迹在记录纸或荧光屏上显示出来，就得到了样品表面的态密度的分布或原子排列的图象。此模式可用来观察表面形貌起伏较大的样品，而且可以通过加在z方向上驱动的电压值推算表面起伏高度的数值。

在扫描过程中保持针尖的高度不变，通过记录隧道电流的变化来得到样品的表面形貌信息。这种模式通常用来测量表面形貌起伏不大的样品。

在扫描隧道显微镜基础上发展起来的各种新型显微镜 在扫描隧道显微镜出现以后，又陆续发展了一系列新型的扫描探针显微镜，例如，原子力显微镜（AFM）、激光力显微镜（LFM）、磁力显微镜（MFM）、弹道电子发射显微镜（BEEM）、扫描离子电导显微镜（SICM）、扫描热显微镜和扫描隧道电位仪（STP）等等。 这些新型的显微镜，都利用了反馈回路控制探针在距离样品表面1nm处或远离样品表面扫描（或样品相对于探针扫描）的工作方式，用来获得扫描隧道显微镜不能获得的有关表面的各种信息，对STM的功能有所补充和扩展。

原子力显微镜是将一个对微弱力及敏感的微悬臂一端固定，另一端有一微小的针尖，针尖与样品的表面轻轻接触，由于针尖尖端原子与样品表面原子间存在及微弱的排斥力（10-8—10-6 N），通过扫描时控制这种力的恒定，带有针尖的微悬臂将对应于针尖与样品表面原子间作用力的等位面而在垂直于样品的表面方向起伏运动。利用光学检测法和隧道电流检测法，可以测得微悬臂对应于扫描各点的位置变化，从而可以获得样品的表面形貌的信息。 利用原子力显微镜得到的红血细胞形貌图

作业： 常用的蛋白质分离纯化方法有哪几种？各自的原理是什么？ 什么是核酸？怎样分类？各类中包括哪些类型？ DNA双螺旋结构模型的主要特点是什么？ 维持DNA分子双螺旋结构的力是什么？ 为什么DNA制品应保存在较高浓度的缓冲液或溶液中？