提高产量 优质 抗病虫害 抗寒、旱、涝、盐碱 抗除草剂

控制成熟 抗除草剂

抗凝血酶

克隆猪，器官移植 克隆猴，研究疾病的模型

远不仅如此 胚胎干细胞遇到伦理其它问题时 从受精卵开始就是生命 iPS出现了

这个就没有问题了吗？

改造环境 拯救濒危动物 恐龙最好也能复活了！！

基因工程 （genetic engineering ） 将外源性遗传物质 通过载体 转入宿主细胞内， 经筛选，使其获得新的性状的过程。

基本原理（过程） 分：目的基因的获取 切：载体和目的基因的酶切 接：目的基因和载体的连接，重组子 转：重组子转入宿主细胞 筛：含有目的基因的重组子的宿主细胞的筛选 表达：目的基因在宿主细胞内的表达

主 要 内 容 基因工程的发展史简介 基因工程的基本原理 基因工程的应用

基因工程发展简史 年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验 1822-1884

基因工程发展简史 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 1877-1955

基因工程发展简史 1970年，从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶 Hamilton O. Smith 美國 霍普金斯大學醫學院 1931年-- Daniel Nathans 美國 霍普金斯大學醫學院 1928年--1999年 Werner Arber 瑞士 Biozentrum大學 1929年-- Smith HO, Wilcox KW. A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. I. Purification and general properties. J Mol Biol. 1970;51(2):379-91 1978年诺贝尔奖

第一个重组体的构建 1972年，美国斯坦福大学P.Berg等在PNAS上发表了题为∶“Biochemical methode for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40:circular SV40 DNA molecules cotaining lamda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2904-2909, 1972”，标志着基因工程技术的诞生。

第一个重组体构建

SV40病毒是猿猴病毒，是一种直径为450Å的球形病毒，分子量为28×106道尔顿。SV40的DNA是环状双链结构，全长5243个碱基对。SV40DNA上有一个限制性内切酶EcoRⅠ的切点。

SV40病毒

◆当获得二聚体SV40DNA后，Berg等就证明了环状DNA被内切酶切成线性DNA后能够重新环化，并且能够同另外的分子重组。 ◆于是他们进行第二步的实验就是从λdvgal DNA中制备含有E.coli的半乳糖操纵子DNA，用上述同样的方法进行重组连接，并获得成功。

第一个有功能重组体的构建 ◆虽然Berg的工作具有划时代的意义，但是他们并没有证明体外重组的DNA分子具有生物学功能。 ◆1973年，S.N.Cohen等在美国PNAS上发表了题为“Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmid In Vitro” （S. N. Cohen, A. C. Y. Chang, H. W. Borer, and R. B. Helling, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:3240-3244, 1973） 的论文，宣布体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行表达,从而完善了Berg开创的基因重组技术。

Boyer and Cohen

基因工程发展简史 1976年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司 Boyer Swanson

基因工程发展简史 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂 insulin From Genetech

基因工程发展简史 1997年 英国罗林研究所 成功的克隆了多莉

基因工程的流程 1、确定研究的目标 2、选择、构建合适的载体 3、分离目的基因 4、目的基因和载体的重组 5、重组子转入宿主细胞 6、重组子的筛选 7、目的基因表达

1. 确定研究的目标 功能研究 克隆研究 是否要稳定表达 真核表达 原核表达 纯的蛋白质 不需纯化蛋白 大片段DNA克隆 150kb以上 酵母、昆虫、动物细胞 原核表达 纯的蛋白质 不需纯化蛋白 功能研究 大片段DNA克隆 150kb以上 原核 真核 克隆研究 是否要稳定表达

2. 选择、构建合适的载体 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 研究目的决定 载体选择后，对基因克隆方法具有一定的指导作用。

2. 选择、构建合适的载体 （1）载体的分类 根据宿主的对象 原核 真核 根据载体的性质 质粒 病毒 根据功能 克隆 表达

2. 选择、构建合适的载体 （2）质粒（plasmid） 独立于染色体外的能够进行自我复制的共价、闭环、双链的DNA分子 严紧型质粒 复制时需DNA聚合酶III 1-5个copies 松弛型质粒 复制时需DNA聚合酶I 10-200个copies以上

质粒的基本条件 分子量要小 复制起始点 多个克隆位点 筛选标志 容量要大 15K左右

质粒的基本条件 分子量要小 复制起始点 多个克隆位点 筛选标志 容量要大 15K左右 真核复制起始点 若真核载体？

原核表达载体---Pharmacia Tac Promoter GST-融合蛋白 GST标签

原核表达载体---Promega T7启动子控制 体外转录 SP6 T3

原核表达载体---Merck T7启动子控制 TrxA标签 His标签 His tag His tag enterokinase site Thrombin site

原核表达载体—选择注意事项 启动子 T7，LacZ, Tac等 标签（Tag）的选择 GST TrxA His Tag SD序列问题

2. 噬菌体(phage) λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）

2. 噬菌体(phage) λ噬菌体DNA改造系统 EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）

2. 噬菌体(phage) M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列

Phage display technology

真 核 载 体 原核载体的条件 仍需其它条件 真核细胞复制起始点 polyA位点 真核的抗性

真 核 载 体---invitrogen

真 核 载 体---clontech

真 核 载 体---选择注意事项 启动子 SV40，CMV，等 Koza序列 -3，+4法则,GCCACCATGG 有无真核筛选标志 Neo(G418)、Hyr(潮霉素) EGFP、RFP、YFP

载 体 构 建 启动子强度 CAG启动子 C：巨细胞病毒增强子， A：鸡-actin启动子， 鸡actin外显子1， G：兔globin内含子2， 兔globin外显子3

载 体 构 建 组织表达特异性 特异性启动子 Luciferase pGL3-EnII-Pcore pGL3-CMV pGL3-AAT pGL3-ForAAT pGL3-RevAAT pGL3-Control SV40 promoter SV40 enhancer

载 体 构 建 表达可控性 加入药物后、或停药后表达 四环素控制系统 VP16 transaction domain of herpes simplex virus Tet off :去除四环素后表达 Tet on :加入四环素后表达

载 体 构 建 表达可控性 加入药物后表达 RU486系统

载 体 构 建 表达可控性 加入药物后表达 RU486系统（1994） 加入后表达 元件组成： Gal4DBD：酵母转录因子Gal4的DNA结合区 VP16AD：单纯疱疹病毒蛋白VP16激活区 PRLBD-891： PR-891突变体改良后的C末端配体结合区 VP16AD,目前用NF-B的p65激活区代替 用来减少免疫原性

载 体 构 建 表达可控性 加入药物后不表达

载 体 构 建 一条mRNA分子双基因表达 IRES Internal Ribosome Entrance Site

载 体 构 建 Clontech pIRES2

3. 粘性质粒(cosmid) 可插入45kb

(yeast artificial chromosome, YAC) 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 200kb左右

(bacterial artificial chromosome, BAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) F1质粒改建而来 可容纳50kb以上的DNA

动物病毒DNA改造的载体 腺病毒

动物病毒DNA改造的载体 腺病毒 顺时表达，不整合，可以感染非分裂细胞

慢病毒(HIV)----逆转录病毒(MMLV) 动物病毒DNA改造的载体 慢病毒(HIV)----逆转录病毒(MMLV) 慢病毒：可稳定整合，宿主范围广，可感染分裂细胞 逆转录病毒：可稳定整合，宿主范围有限，感染分裂细胞

植物载体

植 物 载 体 具有五个主要功能区域：①. T-DNA：LB与RB间T-DNA序列整合到植物基因组； ②. 质粒转移区(PT)； ③. 冠瘿碱(opine)代谢区； ④. 复制原点； ⑤. 毒性区。

3、目的基因获取 获取目的基因的方法 （1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成

1、从文库中筛选 需用探针

（2）利用PCR技术扩增 最常用的方法 还可做其它修饰，如加入attB位点 若序列已经明确 利用模板、PCR扩增 引物5‘端进行修饰，加入酶切位点，与载体对应 还可做其它修饰，如加入attB位点 酶2切 酶1切

3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 蛋白质的氨基酸序列 推测 mRNA的核苷酸序列 推测 结构基因的核苷酸序列 化学合成 目的基因

3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 合成长度有限，120bpu单链，需多次，需拼接 可以合成需多次突变产生可以在密码子偏好性差的细胞中表达的基因

4、目的基因与载体的连接 连接的方法 生成磷酸二酯键的酶 DNA连接酶 重组酶 拓扑异构酶

4、目的基因与载体的连接 连接的方法 （1）采用连接酶的方法 （2）利用重组酶的方法 （3）利用拓扑异构酶的方法

4、目的基因与载体的连接 （1）采用连接酶的方法 DNA连接酶 T4DNA连接酶 Ecoli DNA连接酶 辅基NAD

4、目的基因与载体的连接 （2）利用重组酶的方法(噬菌体整合机制) attB 25bp， attP 240bp

4、目的基因与载体的连接 （2）利用重组酶的方法(噬菌体整合机制)

4、目的基因与载体的连接 （3）利用拓扑异构酶的方法

4、目的基因与载体的连接 （3）利用拓扑异构酶的方法 T载体 PCR产物末端加A

5、重组子导入宿主细胞 转 —— 目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程 受体细胞 稳定 表达

5、重组子导入宿主细胞 将目的基因导入 ——感受态细胞 微生物细胞 将目的基因导入 方法 动物细胞 农杆菌转化法 将目的基因导入 基因枪法 脂质体转染 磷酸钙共沉淀 电击 显微注射法 纳米颗粒 将目的基因导入 动物细胞 方法 农杆菌转化法 将目的基因导入 植物细胞 基因枪法 花粉管通道法

5、重组子导入宿主细胞 宿主细菌的选择 导入微生物细胞 ——感受态细胞 转染方法：常用CaCl2 RbCl2(效率高) A. 克隆载体，DH5，topo10,XL-1等 B. 表达载体，BL21（DE3）等，与载体相对启动子的RNA聚合酶的细菌 宿主细菌一般是重组酶缺陷，限制性内切酶缺陷 大多来自K12的改造 转染方法：常用CaCl2 RbCl2(效率高)

5、重组子导入宿主细胞 导入动物细胞 脂质体转染 lipofectamine2000、Fugene6 磷酸钙共沉淀 电击 基因枪 显微注射法 纳米颗粒：阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)

5、重组子导入宿主细胞 导入植物细胞

6、重组子的筛选 ——检查是否成功 ①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 方法—— 检测— DNA分子杂交，PCR，酶切、测序 检测— ②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— 分子杂交 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法—— 抗原抗体杂交 鉴定—— 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等

测 序 PCR的方法，较易出现假阳性 测序是必须进行的，是序列正确与否的金标准

α互补 利用α互补原理筛选重组体pUC18

7、（1）目的基因表达 原核基因表达 可溶性表达问题 表达修饰问题 密码子偏性问题 糖基化修饰，二硫键形成 包涵体形成，需变性复性 采用必变氧化还原状态的细菌 糖基化修饰，二硫键形成 采用具有稀有密码子的细菌 原核基因表达 可溶性表达问题 表达修饰问题 密码子偏性问题 Merck公司的载体 1、与一个高度可溶的多肽联合一起表达，比如：谷胱甘肽S转移酶（glutathione S transferase, GST）、硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）和N利用质A（N utilization substance A, NusA）。 2、转入一个酶催化二硫键的形成，如：硫氧还蛋白，DsbA，DsbC。 3、插入一个定位到周质空间的信号序列。 宿主菌： Rosetta AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA

7、（1）目的基因表达 真核基因表达 纯化难度大 产量低 成本高 表达的蛋白有活性 蛋白质修饰

7、（2）目的基因表达纯化 利用GST与谷胱甘肽之间的相互作用 利用Ni离子与His相互作用 利用抗原、抗体相互作用（亲合层析）

7、（2）目的基因表达纯化 利用GST与谷胱甘肽 之间的相互作用

7、（2）目的基因表达纯化 利用GST与谷胱甘肽之间的相互作用 利用Ni离子与His相互作用

三、基因工程的应用

重组DNA医药产品 产 品 功 能 组织胞浆素原激活剂 抗凝 血液因子VIII 促进凝血 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成 产 品 功 能 组织胞浆素原激活剂 抗凝 血液因子VIII 促进凝血 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成 促红细胞生成素(EPO) 剌激红细胞生成 生长因子(bFGF, EGF) 刺激细胞生长与分化 生长素 治疗侏儒症 胰岛素 治疗糖尿病 干扰素( 1b, 2a,  2b, ) 抗病毒感染及某些肿瘤 白细胞介素 激活、剌激各类白细胞 超氧化物歧化酶 抗组织损伤 单克隆抗体 利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗 乙肝疫苗(CHO, 酵母) 预防乙肝 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 预防霍乱 目 录

植 物 工 程 抗虫

植 物 工 程 转基因花卉

基因治疗

通过病毒载体导入ES细胞建立转基因小鼠的技术路线

基因敲除基本原理

Thank you