外源基因的表达 主讲：李志红.

Presentation on theme: "外源基因的表达 主讲：李志红."— Presentation transcript:

1 外源基因的表达 主讲：李志红

2 外源基因在宿主细胞中表达 导入宿主细胞 外源基因 重组载体 表达载体 在宿主细胞中 表达出蛋白质 提取蛋白 宿主细胞： 原核细胞或真核细胞。

3

4 常见表达系统的类型 大肠杆菌表达系统 芽孢杆菌表达系统 原核生物基因表达系统 链霉菌表达系统 酵母表达系统 丝状真菌表达系统 昆虫表达系统
哺乳动物细胞表达系统 植物生物反应器 真核生物基因表达系统

5 大肠杆菌表达系统 优势： 一种成熟的基因克隆表达的受体细胞 繁殖迅速，培养代谢易于控制 易于进行遗传操作和高效表达

6 一、大肠杆菌表达载体的结构 除了含有与克隆载体相同的元件之外，还必须含有表达载体所需要的其它元件: 原核或噬菌体启动子 SD序列 MCS
终止子

7 -35 Box 和 -10 Box 1. 启动子 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。
1. 启动子 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。 大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）。 -35 Box 和 -10 Box TTGACA TATAAT 转录起始位点 17bp 5’ 核糖体结合位点

8 Shine-Dalgarno（SD） sequence
2. 核糖体结合位点（ RBS） Shine-Dalgarno（SD） sequence 翻译起始阶段，与核糖体16sRNA的3’端相互作用，正确定位起始密码子 SD 　　　 5’—AGGAGGU——AUG—— UCCUCCA 16S rRNA3’ SD序列距离AUG的距离影响翻译

9 3. 转录终止子 在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子，mRNA转录终止信号。

10 常用表达载体 pJLA50X系列; pcDNAII; etc pET系列 (T7 promoter, Novagen公司)
pQE系列 (T5 promoter, Qiagen公司) pMAL系列 (周质表达, BioLabs公司) pGEX系列 (GST融合表达, Pharmacia公司) pBAD系列 (Arabinose诱导型) pTYB系列 (CBD融合, 可以自我切割, BioLabs)

11

12

13

14 工程化宿主菌的选择 某些特殊的启动子需要特殊的宿主菌 工程菌高密度发酵要解决的问题： 常用：BL21(DE3) 营养 供氧
pET系列载体 T7 RNA pol 工程菌高密度发酵要解决的问题： 营养 供氧 IPTG诱导：培养、诱导时间

15 IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷, isopropylthiogalactoside)
极强的诱导剂 安慰诱导物：如果某种物质能够促使细菌产生酶而本身又不被分解，这种物质被称为安慰诱导物，如IPTG。

16 Z Y A O P 乳糖操纵子(lac operon) 调控区 结构基因 DNA 操纵序列 启动序列 CAP结合位点 Z： β-半乳糖苷酶
16

17 lac 操纵子与阻遏蛋白的负性调节

18 BL21(DE3) DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)是最常用的表达菌株，构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导调控方式和lac一样都是IPTG诱导。

19 为何？ 二、原核表达系统的注意事项 1. 外源基因不能带有内含子 2. 一般用cDNA，不能直接用真核基因组DNA
1. 外源基因不能带有内含子 为何？ 2. 一般用cDNA，不能直接用真核基因组DNA 3. 必须利用原核细胞的强启动子和 SD序列等调控元件控制外源基因的表达 4. 利用宿主细胞的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达对宿主菌的毒害

20 1. 细胞质中表达 三、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位 是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。
包涵体（inclusion body） 是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。 包含体（inclusion bodies）是无定形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密，低速离心就可以沉淀。包含体难溶于水中，在变性剂溶液（如盐酸胍、脲）中才能溶解。在这些溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏。因此当除去变性剂时，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质的复性。 包含体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。这些基因表达产物没有生物活性。为此，欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。 信号肽位于分泌蛋白的N端。一般由15～30个氨基酸组成。新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的N-末端的氨基酸序列（有时不一定在N端） inclusion body 包涵体形成的原因主要是蛋白高水平表达的结果。

21 ① 优点 使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞 ②缺点 回收的蛋白生物活性差。

22 包涵体的分离和溶解 包涵体的分离 包涵体的溶解 包涵体蛋白的复性 致密的颗粒 ，低速离心收获 强的变性剂
6 mol/ L 盐酸胍或6～8 mol/L 尿素 包涵体蛋白的复性 去除过量的变性剂和巯基还原剂,并把还原的蛋白转到氧化的环境中促使二硫键的形成 。

23 2. 周质中表达 周质（periplasm） 革兰氏阴性菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。 优点：
容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。

24 3. 胞外表达 使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。
　由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果不太理想。 外膜 内膜 细胞质 周间质 染色体 质粒

25 四、几种类型的原核表达载体 1.非融合型表达载体 表达的外源蛋白质不与其它蛋白质融合在一起。 S-D序列 ATG-外源基因-TAG 优点：
产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。 缺点： 容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。

26 2. 融合蛋白表达载体系统 表达出的外源蛋白与质粒载体上的另一蛋白（常为标签蛋白）连接在一起。 (1) 优点 便于分离和纯化。

27 (2) 组成结构 ①启动子：tac ②操纵基因：lacP ③调节基因：lacI ④S-D序列 ⑤ori：pBR322 ori ⑥融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶） lacI tac lacP lac O S-D/ATG GST 插入位点 TGA

28 表达产物的纯化 凝胶层析 离子交换层析 亲和层析

29 亲和层析 亲和层析:利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术

30

31 亲和层析的基本原理 将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。

32 (3) 产物提纯 GST融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱 分离纯化。

33 (4) 产物分离 用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。

34 (5)其他融合蛋白系统 His-tag（组氨酸标签）： 在外源多肽的N端或C端接上6 个组氨酸（6×His）。 His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA （或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。

35 ProBond™ 镍离子螯合树脂

36 亲和层析的特点 优点： 1.纯化过程简单、迅速 2.分离效率高 3.实验条件温和
缺点： 亲和吸附剂通用性较差。针对某一分离对象就需要制备专一的吸附剂和建立相应的实验条件

37 各种用于抗体识别的标记 His-tag (6-8 Histidine) T7-tag (MASMTGGQQMG)
HSV-tag (QPELAPEDPED) S-tag (KETAAKFERQHMDS) VSV-G-tag (TTDIEMNRLGK) HA-tag (YPYDVPDYA) Flag-tag (DYKDDDDK) Myc-tag (EQKLISEEDL)

38 原核表达中的问题 缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA 缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化
融合蛋白形成包涵体（inclusion body），复性后才有活性 很难表达大量的可溶性蛋白

39 五、实例—— 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
1. 胰岛素的结构及其生物合成 2. 人胰岛素的生产方法 3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建

40 1. 胰岛素的结构及其生物合成 信号肽 B 肽 C 肽 A 肽 信号肽酶 B 肽（30） C 肽（31） A 肽（21）
1. 胰岛素的结构及其生物合成 N C 信号肽 B 肽 C 肽 A 肽 信号肽酶 S C N B 肽（30） C 肽（31） A 肽（21） R K 高尔基体内的特异性肽酶 胰岛素原 胰岛素最初是以一条单链分子的前体形式合成的，即胰岛素原（Proinsulin）。它可认为是由ABC三条肽链连接而成。具体是C肽的一端通过两个碱性氨基酸残基62、63与胰岛素A链的N末端相连，另一端通过另外两个碱性氨基酸残基31、32与胰岛素B链的C末端相连。在细胞高尔基体中，胰岛素原被贮存在储存颗粒内，并在肽酶的催化下，切去C肽而形成活性胰岛素。 胰岛素

41 2. 人胰岛素的生产方法 （1）直接提取法制备人胰岛素
2. 人胰岛素的生产方法 迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法： （1）直接提取法制备人胰岛素 　　早期人的胰岛素是从人的胰脏中直接分离纯化的，由于原料供应的限制，其产量远远不能满足日益增多的糖尿病人的临床需求。

42 （2）化学合成法制人胰岛素 根据人胰岛素A链和B链的序列，由单个氨基酸从头合成。这条化学全合成的路线从技术上来说是能够做到的，但其生产成本奇高，从而也限制了产品的广泛应用。

43 （3）化学转型法制人胰岛素 猪的胰岛素可从原料丰富的猪胰脏中提取获得，而且猪胰岛素与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸的差异，猪的为Ala，人的为Thr，因此将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为一种选择。

44 （4）基因工程法制备人胰岛素 1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年，Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。 优点：上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。

45 3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 （1）A链和B链分别表达法
3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 （1）A链和B链分别表达法 化学合成: A、B链的编码序列

46 表达产物的后处理路线：

47 生产技术的评价： 由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有10% - 20%，因此采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。 为了进一步降低生产成本，美国Ely LiLi公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线。

48 3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 人胰岛素原表达法

49 表达产物的后处理路线： 胰岛素原是胰岛素的前身,需要经过酶切去除C 肽,方成为有功能的胰岛素。

50 生产技术的评价： 　　二硫键的正确配对率相应提高，折叠率高达80%以上。虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更为简捷，而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅50美元。 　　目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。

51 原核表达系统不能对表达的真核蛋白进行正确的折叠和翻译后加工!!!
第二节 外源基因在真核细胞中的表达 为什么建立真核表达系统？ 原核表达系统不能对表达的真核蛋白进行正确的折叠和翻译后加工!!!

52 一、真核生物表达的优越性和必要性 1、真核生物具有转录后加工系统，可识别并删除基因中的内含子，剪切加工为成熟mRNA
2、具备完善的翻译后加工系统，可进行糖基化、乙酰化等修饰，使蛋白形成正确的天然构型，因而真核生物表达系统产生的蛋白更接近天然状态，有利于其功能、生物活性的研究。

53 3、某些真核细胞可将基因表达产物分泌到细胞培养液中，简化了纯化工艺，降低了生产成本。
4、另外，真核生物表达的调控方式非常复杂，有助于我们深入了解基因调控机制。

54 二、真核生物表达系统 （一） 酵母表达系统 （二）植物细胞表达系统 （三）昆虫细胞表达系统 （四） 哺乳动物细胞表达系统

55 外源基因 真核或病毒启动子 MCS PolyA信号 终止子 酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。

56 外源基因在真核细胞中 的表达方式 依表达时间长短 表达方式
瞬时表达（Transient expression）：外源基因不整合到宿主染色体中, 在细胞中的表达时间较短(2-3天),转染的方法相对简单,耗时较少,适用快速分析. 稳定表达（Stable expression）：外源基因整合到宿主染色体,需要筛选,可获得稳定表达的细胞株,可复制,并可以稳定传代,耗时长,不宜成功. 表达方式 分泌表达、非分泌表达 融合表达、非融合表达

57 三、真核表达载体 真核表达载体的功能元件 原核DNA序列 启动子 增强子 剪接信号 终止信号和加poly(A）信号 筛选标记
新霉素抗性基因 neor 胸苷激酶基因tk

58 真核表达载体的种类 质粒型载体 病毒型载体 pcDNA系列 Invitrogen公司产品 pCMV-HA Clontech公司产品
逆转录病毒载体 腺病毒载体 昆虫杆状病毒载体

59 pcDNA3.1：由Invitrogen公司提供的目前应用最多的真核质粒表达载体之一：
有高效表达的CMV（巨细胞病毒，Cytomegalovirus）启动子：是启动真核基因表达的最有力的启动子； 有牛生长激素（bovine growth hormone，BGH）多腺苷酸化信号；

60 pFastBac：昆虫杆状病毒表达系统的载体，由Invitrogen公司开发：

61 表位标签 tag 方便蛋白的鉴定和纯化 GST
FLAG（DYKDDDDK），由8个氨基酸残基组成的多肽，具有亲水性，可置于蛋白的氨基或羧基末端，专门设计用于融合蛋白质的免疫吸附纯化 HA (influenza hemagglutinin epitope-YPYDVPDYA)，流感血凝素抗原决定簇 His

62 四、宿主细胞 哺乳动物细胞 癌细胞 易于传代培养 生长速度快而均一 转入外源基因后稳定性好 酵母 昆虫细胞

63 常用的哺乳动物细胞种类 鼠源性：NIH3T3 （小鼠胚胎成纤维细胞系 ）, CHO（中国仓鼠卵巢细胞）
人源性：293（人肾上皮细胞系），HeLa（源自一位美国妇女 Henrietta Lacks 的子宫颈癌细胞的细胞系） ATCC（American Type Culture Collection ）-1925年建立﹐是世界上最大的﹑保存微生物种类和数量最多的机构﹐保存病毒﹑衣原体﹑细菌﹑放线菌﹑酵母菌﹑真菌﹑藻类﹑原生动物等约 29000株 中国典型物种保藏中心（武大）

64 五、重组子导入宿主细胞的方法 磷酸钙介导的转染 阳离子脂质体介导的转染 DEAE-葡聚糖介导的转染 电穿孔转染 病毒转染 Gene Gun
Lipofectamine invitrogen 公司产品 DEAE-葡聚糖介导的转染 电穿孔转染 病毒转染 Gene Gun

65 磷酸钙沉淀法 将外源DNA与CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，逐滴加入到不断搅拌的HEPES-磷酸钙溶液中，形成DNA－磷酸钙共沉淀复合物。 然后用吸管将沉淀复合物加到培养的哺乳动物单层细胞表面，细胞可通过内吞作用将复合物吸收到细胞内。 转化率在10%左右。

66 脂质体介导的转染 脂质体（liposome）是由人工构建的磷脂双分子层组成的小球，DNA包裹在脂质体中，通过融合或吞噬作用被细胞吸收。

67 基因导入方法: 电穿孔法 (Gene transfer by electroporation)

68

69 外源基因在昆虫细胞中的表达 载体 质粒载体 杆状病毒表达载体 常用的昆虫细胞株 Sf9, Sf21, S2, Ea4

70 昆虫杆状病毒（Bac-to-Bac）表达系统
主要包括： 1）pFastBac受体质粒。目的基因可克隆到该质粒表达盒中，表达盒受到杆状病毒启动子的调控。 2）大肠杆菌DH10Bac。内含杆状病毒穿梭载体（Bacmid）和辅助质粒，在辅助质粒的帮助下，可以将pFastBac受体质粒中的重组表达盒转座到Bacmid中。 3）昆虫细胞。

71 Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System

72

73 七、基因表达的检测 1.转录水平检测：RT-PCR，Real-time PCR，northern blot，基因芯片等。
2.翻译水平检测：western blotting, ELASA，免疫组化，原位杂交，免疫沉淀，免疫荧光抗体等。 3.直接检测，如报告基因、融合荧光蛋白等。

74 RT-PCR， Real-time PCR RT-PCR：通过电泳，EB(或EB替代品)显色，成像，再通过灰度分析软件进行分析，得出结果，一般用于相对定量分析。 Real-time PCR：通过实时检测PCR体系中的荧光基团，从而达到实时报告扩增结果，进行定量或相对定量分析。

75 RT-PCR，Real-time PCR原理示意图
首先提取总RNA或mRNA，反转录成cDNA，即互补DNA序列，再通过RT-PCR，real-time PCR 方法对cDNA进行定量分析。

76 电泳及图像采集与分析 RNA表达量的数据分析 RNA电泳 数据分析 数据分析

77

78 Western Blotting

79 主要基因工程表达体系比较 表达体系 产 物 产生部位 培养方式 提 纯 产物活性 潜在危性
表达体系 产 物 产生部位 培养方式 提 纯 产物活性 潜在危性 大肠杆菌 多肽蛋白质 菌体内 容易 一般 对原核好 不大 融合蛋白质 部分高产 对真核差 酵 母 多肽蛋白质 菌体内 容易 菌体内 真核的接近 不大 糖基化蛋白 外分泌 可高产 稍复杂 天然产物 哺乳动物 完 整 外分泌 较难，成本高 简单 可达天然 需注意 糖基化蛋白 可高产 产物 致癌

80 基因工程技术的应用 生产蛋白质和多肽类活性物质 制备基因工程疫苗 改造物种特性 疾病的基因诊断和基因治疗

81 重组DNA医药产品 产 品 功 能 组织胞浆素原激活剂 抗凝 血液因子VIII 促进凝血 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成
产 品 功 能 组织胞浆素原激活剂 抗凝 血液因子VIII 促进凝血 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成 促红细胞生成素 生长因子(bFGF, EGF) 刺激细胞生长与分化 生长素 治疗侏儒症 胰岛素 治疗糖尿病 干扰素( 1b, 2a,  2b, ) 抗病毒感染及某些肿瘤 白细胞介素 激活、剌激各类白细胞 超氧化物歧化酶 抗组织损伤 单克隆抗体 利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗 乙肝疫苗(CHO, 酵母) 预防乙肝 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 预防霍乱 81

82

83 思考题 名词解释 问答题 包涵体 融合型表达 瞬时表达，稳定表达 表达载体与克隆载体的区别？ 如何利用大肠杆菌表达系统生产重组人胰岛素？
真核表达系统的优势？