便携式基因芯片的研究及开发应用 报告人：吴电云 导师：季静教授

基因芯片概述 课程安排 课程目标

基因芯片的原理 基因芯片是生物芯片的一种,又称DNA芯片、DNA微阵列或寡核苷酸微阵。

基因芯片制作步骤 芯片的制作。 杂交或反应。 测定或扫描。 数据处理。 其中芯片的制备及反应信号的检测是基因芯片的技术核心

基因芯片的制备方法 原位合成法：采用光蚀刻技术与固相化学相结合，以化学合成的方法直接在载体表面逐个合成寡核苷酸。通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序, 把腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)四种不同碱基的核苷酸按不同次序化学偶联在相应的位点, 原位合成序列不同的寡核苷酸探针。

基因芯片制备方法 合成后点样：直接合成的寡核苷酸片段或者PCR产物利用点样仪点在载体上，固定后形成芯片 点样法制备基因芯片首先按常规方法制备cDNA(或寡核苷酸)探针库, 然后通过特殊的微喷头,分别把不同的探针溶液按照预先排定的顺序逐点点在片基表面, 并通过物理和化学作用使探针固定于基片表面. 探针片段除了可使用寡聚核苷酸探针, 也可使用较长的基因片段以及核酸类似物探针。

原位合成法 优点：这种方法制作出的基因芯片具有集成度高、可直接从数据库获得要合成序列的信息，不用自己去克隆和测序。 缺点：该方法合成的只是寡聚DNA片段，分子量较小，一般在20～25bp，所获得的遗传信息的总集成量受到限制；而且每个芯片要用大量的光刻掩膜、杂交和检测条件要求亦较高，成本较高。由这种方法得到的基因芯片称为genechip。

点样合成法 优点：可以充分利用原有的合成寡核苷酸或cDNA 探针库, 探针的长度可以任意选择, 灵活性大, 可根据需要自行制备。通过RT-PCR获得所要的基因片段，通过点样法将基因点在芯片上，成本低，操作相对简单，可在实验室进行试验。 缺点：需要自己制备探针，选择载体 而点样技术主要应用在部分没有商业化芯片的物种的基因芯片的制备

基因芯片的分类（制备方法） 十几至几十个碱基的寡核苷酸固定到载体上制成的芯片叫做寡核苷酸芯片 几百个碱基的cDNA片段固定到载体上形成的成为cDNA微阵列。

基因芯片的分类（探针大小） 寡核苷酸微阵列(oligonucleotide mieroarray) cDNA微阵列(cDNA microarray)

cDNA微阵 载体 载体多选择玻片或尼龙膜。 尼龙膜表面多孔、具有渗透性、所需试剂体积大．背景荧光高，优点是可以重复使用。 目前应用较为广泛的是玻璃基片，其表面无渗透作用，加样量低，在芯片制备过程中易除去非特异性杂交产物．可以平行分析样品。 如何将寡核苷酸或cDNA稳定地固定在玻片表面是合成后点样法制备基因芯片过程中的一个关键问题。

基因芯片的发展 1953年，Francis Crick和James D.Waston首次提出基因结构中的碱基配对构型，这为基因芯片的产生奠定了理论基础。 1991年Fodor等人正式提出DNA芯片的概念，并由美国的Affymatrix公司制备了世界上第一块基因芯片。原位合成法 1995年，Stanford（斯坦福）大学的Schena等人制备了第一张玻璃载体的cDNA芯片-固定有拟南芥45个基因的cDNA 微阵列（其中14个为完全序列，31个为EST），并对拟南芥根、茎等组织基因特异性表达进行了检测 。这标志着基因芯片技术开始进入生物学研究领域。 其后基因芯片技术被广泛应用于疾病诊断与治疗、药物筛选和开发、农作物育等方面

基因芯片的发展 20 世纪90 年代末, 中国政府和科学家开始启动生物芯片的研究与开发. 我国最早的一张DNA 微阵列膜, 是在中国科学院的人类基因组项目的支持下,利用了国家人类基因组南方研究中心所积累的大量人类cDNA 克隆模板点制而成。成功地运用于首例肝癌及癌旁组织的比较转录组研究, 其成果于2001 年发表于PNAS[12]. “九五”末期,国家高技术研究发展(863)计划又连续拨出专款, 支持北京、上海和南京若干个课题组开始实施包括基因芯片的“生物芯片”研制工作, 成立上海的“华冠”公司专门从事诊断用生物芯片的研发. 国内若干民营企业也开始投入对生物芯片的研发. 比较突出的包括广州“益生堂”、上海“博星”和浙江湖州的“江南生物”等企业.

基因芯片的发展 在基因芯片制备方面除了Affymetrix,Agilent 和Nimblegen 等几个公司外, 大多公司普遍采用点样技术制作DNA 芯片。 美国的Cartesian Technologies,TeleChem, Biodot, PerkinElmer, GE Healthcare 等公司,英国的Genetix 公司, 中国的博奥生物公司等都有商业成型的点样机。

研究意义 植物生长发育是一个十分复杂的过程, 涉及到众多基因的表达和调控。其中生物和非生物逆境是影响植物生长发育的重要限制性因素。干旱、水淹、高盐、病害和养分缺乏等逆境胁迫影响面积广，危害程度大，造成每年世界粮食作物的大量减产，对世界粮食生产构成了严重威胁 研究发现，植物在遭受逆境胁迫时，并不是被动的防御，而是采取主动积极的措施来应对逆境胁迫。植物对逆境胁迫的抗性大多是由多基因控制的,往往需要一系列相关基因的共同表达形成一个胁迫相应的分子网络，才能表现出高抗逆性。 以往的研究往往局限于某一种或某一类基因的行为和功能，不能监测该基因或该类基因与其他基因的互作,从而限制了对作物抗逆分子机制的研究。

研究意义 基因芯片上可以固定成千上万的DNA探针, 使众多基因同时检测成为可能。 基因芯片不仅可以检测在不同条件下一个基因组大量基因的转录水平差异,而且可以对比不同基因组中对应基因的转录水平差异,从根本上突破了以前研究中一次只能关注一个或几个基因的瓶颈 利用基因芯片对比每一个测得的基因和已知基因, 还可在植物中寻找新的基因，能最终揭示植物逆境胁迫抗性这一复杂的生物学机制。

基因芯片应用 Chris Zinselmeier等[19]采用MD (molecular dynamic)微阵列和Affymatrix基因芯片研究了非生物胁迫条件对雌性玉米再生组织的基因表达的影响。MD微阵列含有4个代谢途径中的384个重要基因，Affymatrix基因芯片中含有27个代谢途径中的300多个未知基因。研究表明：在胁迫条件下玉米的淀粉合成途径受到影响，淀粉合成量下降，并找到与此相关的基因；与正常生长条件下相比，在非生物胁迫条件下玉米各组织中某些基因均出现表达差异，并且在部分组织中这些基因对逆境胁迫更敏感；此外还发现了一组对新的干旱应答基因。由此可见基因芯片在寻找和鉴定胁迫条件下想关基因及代谢途径中具有良好的应用前景。

基因芯片应用 Jun Zheng等[20]结合抑制消减杂交(SSH)与cDNA微阵列技术分析PEG及干旱胁迫条件下玉米幼苗中基因的差异表达，PEG处理的玉米幼苗，其根组织中67个表达序列标签（EST）、叶子中113个表达序列标签（EST）表达显著上调；163个表达序列标签（EST）在干旱处理条件下表达明显上调；部分基因在PEG及干旱胁迫条件下的表达均出现明显上调；此外还发现了一些新的转录本，可能对水逆境下的信号传导有重要意义。

基因芯片应用 Rongjun Chen等[21]利用Affymetrix玉米基因组微阵列对氮缺乏条件下MO17和Hz4的基因表达情况进行了分析，结果发现：在MO17中的各个生物途径中共有884个基因对氮缺乏条件有应答反应，其中384个基因表达上调，503个基因表达下调；Hz4中1108个基因在低氮处理下表达出现差异，696个基因上调表达，412个基因下调表达；在MO17（910）和Hz4（889）中共有1799个基因高水平表达，恰恰解释了之前报道中MO17对氮缺乏环境比Hz4敏感的现象。此外研究者还发现了大量的对氮缺乏的应答基因，如编码早期光诱导蛋白、磷酸烯醇丙酮酸羧基酶、倍半萜环化酶等的基因。该研究不仅对玉米氮缺乏条件下的分子机制进行了解释，还对提高玉米氮利用的效率奠定了良好的基础。

课程安排 第一周：查阅文献找出植物中的抗干旱、耐盐碱、抗病相关基因。 第2周至第6周：谈论基因芯片相关技术 第7-8周：探讨便携式基因芯片的制作方法

课程目标 每人写一篇基因芯片综述。