基 因 工 程 四川大学 李永红

基因工程 1 基因工程的基本概念 2 基因工程的基本原理 3 基因工程所需的基本条件 4 基因工程的操作过程 5 目的基因的克隆与基因文库的构建 6 大肠杆菌基因工程 7 酵母基因工程 8 哺乳动物基因工程 9 高等植物基因工程

3 基因工程的基本条件 A 用于核酸操作的工具酶 B 用于基因克隆的载体 C 用于基因转移的受体菌或细胞

A 用于核酸操作的工具酶 Enzymes

限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA修饰酶 核酸外切酶 单链DNA内切酶

第一节 限制性核酸内切酶 一、限制性核酸内切酶 （Restriction endonuclease） 第一节 限制性核酸内切酶 一、限制性核酸内切酶 （Restriction endonuclease） 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。

1. 来源 3. 功能 细菌的限制和修饰系统（R/M体系） 原核生物。 2. 性质 内切酶。 即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 自我保护作用。 细菌的限制和修饰系统（R/M体系）

（1）限制（Restriction） 限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。

（2）修饰（Modification） 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。 ① Dam甲基化酶 GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 ② Dcm甲基化酶 CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基

二、限制性内切酶的类型 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。 I 型限制性内切酶 II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶

1. I型限制性内切酶 首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。 如 EcoB和 EcoK。 （1）识别位点序列 未甲基化修饰的特异序列。 EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC

（2）切割位点 在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随机切开一条单链。 Recognize site cut 1-1.5kb （3）作用机理 需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。

2. II类限制性内切酶 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。 分离的第一个酶是Hind Ⅱ （1）识别位点序列 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。 与DNA的来源无关。

（2）切割位点 识别位点处。 切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如： EcoR I 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ Pst I 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’ 产生粘性末端 EcoR V 5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’ 产生平齐末端

（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 含有几个核苷酸单链的末端。 分两种类型： ① 5’端凸出（如EcoR I切点） 5’- GAATTC -3’ 3’- CTTAAG -5’ 5’- G AATTC -3’ 3’- CTTAA G -5’

② 3’端凸出（如Pst I切点） 5’- CTGCAG -3’ 3’- GACGTC -5’ 5’- CTGCA G -3’ 3’-

（4）粘性末端的意义 ①连接便利 i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。 ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。

② 5’末端标记 凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。 凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 ③ 补平成平齐末端 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。

（5）同裂酶（Isoschizomers) 识别位点的序列相同的限制性内切酶。 ① 完全同裂酶： 识别位点和切点完全相同。 如Hind Ⅲ 和Hsu I。 Hind Ⅲ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’ Hsu I 5’-AAGCTT-3’

② 不完全同裂酶： 识别位点相同，但切点不同。 Xma I 5’-CCCGGG -3’ 如Xma I 和 Sma I。 3’-GGGCCC-5’ Sma I 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’

（6）同尾酶(Isocaudamers） 识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’ Bgl Ⅱ 5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ Bcl I 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’ Xho Ⅱ 5’-UGATCY-3’ 3’-YCTAGU-5’ U代表嘌呤；Y代表嘧啶。

？ Sau 3A 5’-GATC----3’ 3’----CTAG-5’ 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。 ？ 5’-G 3’-CCTAG GATCT-3’ A-5’ BamH I Bgl Ⅱ 5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’ Bgl Ⅱ BamH I Sau 3A

（7）限制酶的酶活性 限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。 所以一般使用专一的反应缓冲液。 ① 星号（*）活性 如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。

限制性核酸内切酶 II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切 0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4 2.5倍体积的冰冷乙醇 冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥

使用的时候要特别注意！ EcoR I和BamH I等都有*活性。 EcoR I： GAATTC 在低盐、高pH（>8）时可识别和切割 GAATTA、AAATTC、GAGTTC等 7

（8）Ⅱs型限制性内切酶 移动切割（shifted cleavage): 在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。 Hga I 5’ GACGCNNNNN 3’ CTGCGNNNNNNNNNN

3. III类限制性内切酶 在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。 EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 在基因工程操作中用途不大。

核酸限制性内切酶的类型及主要特性 特性 I类内切酶 II类内切酶 III类内切酶 限制和修饰活性 单一多功能的酶 内切酶和甲基化酶分开 共同亚基的双功能酶 内切酶的蛋白结构 3种不同的亚基 单一成分 2种不同的亚基 限制作用所需要的辅助因子 ATP、 Mg2+和SAM Mg2+ 寄主特异性位点识别序列 EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC 回文序列 （IIs型除外） EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG

切割位点 在距离识别位点至少1000 bp处随机切开一条单链。 位于寄主特异性位点或其附近 距寄主特异性位点3‘端24—26bp处 酶催转换 不能 能 DNA易位作用 甲基化作用的位点 寄主特异性位点 识别未甲基化的序列进行切割 序列特异的切割 不是 是 基因工程中的用途 无用 十分有用

三、限制性内切酶的命名 1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下： 用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。 大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。

2. 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。 3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoR I，EcoR V。 4. 限制酶前面要带上R（Restriction)， 修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。

四、影响限制性内切酶活性的因素 1. DNA的纯度 DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。 一般采取 ②加大酶的用量 ③延长保温时间 ④ 扩大反应体积（ >20l）

2. DNA的甲基化程度 大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒： dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。 基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。

3. 温度 不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。 酶 最适温度oC Apa I Bcl I Mae II Taq I 30 50 65 Apy I BstE II Mae III 60 55 Ban I Mae I Sma I 45 25

4. 缓冲液(Buffer) 是影响限制酶活性的重要因素。 商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。 （1）缓冲液的化学组成 MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度； Tris-HCl： 维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；

五、限制性内切酶对DNA的消化 1. 内切酶与识别序列的结合模式 1986年J.A. McClarin等通过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。 GAATTC CTTAAG

2. 完全消化 内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。 1 2 3 4 1 2 3 4

3. 局部消化 只有有限数量的酶切位点被切开。 1 2 3 4 ? 1 4 通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。

4. 限制酶酶切反应的终止 大多数酶可用65 oC温育5分钟失活。 或用乙醇沉淀DNA。 5. 几种常用限制酶识别位点

6. 限制性内切酶识别序列的交叉列表 AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG **** **** MaeII HpaⅡc MspIc **** Alu I **** A****T Nla Ⅲ A****T ApoI HindⅢ Afl III AgeI BsrFI A****T A****T SspI A****T

AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG A****T Nsp7524 C****G NcoI StyI Dsa I XmaI AvaI C****G NdeI C****G Pml I BsaAI PvuII NspBII SmaI C****G C****G G****C EcoRI ApoI NgoMI BsrFI

AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG G****C BseHI G****C Ecl136II EcoRV NaeI G****C G****C AatII SacI BanII HgiAI Bsp1286 SphI Nsp7524 T****A BspHI BspMII T****A T****A SnaBI BsaAI T****A T****A

CGCG CTAG GATC GCGC GGCC **** MboIc Sau3AIc **** BfaI HinpI **** BstUI DpnI HaeIII **** HhaI A****T A****T MluI Afl III SpeI Bgl II BstYI A****T A****T Eco47III StuI A****T

CGCG CTAG GATC GCGC GGCC A****T HaeII C****G DsaI AvrII StyI EagI EaeI GdiII C****G C****G NspBII C****G SacII PvuI C****G BsiEI G****C BssHII NheI BamHI BstYI KasI BanI Bsp120I

CGCG CTAG GATC GCGC GGCC G****C NarI BsaHI G****C G****C G****C T****A BbeI HaeII ApaI BanII Bsp1286 T****A XbaI Bcl I EaeI T****A NruI FspI MscI T****A T****A

GTAC TATA TCGA TGCA TTAA **** **** Csp61 TaqI MseI **** RsaI **** A****T A****T A****T ClaI AseI A****T ScaI A****T

GTAC TATA TCGA TGCA TTAA A****T Nsi I C****G Bsi WI SfcI XhoI AvaI AvaI C****G C****G C****G C****G PstI G****C Asp718BanI Sal I ApaLI

GTAC TATA TCGA TGCA TTAA G****C AccI G****C Bsrl107I HincII HpaI G****C G****C KpnI Bsp1286 HgiAI T****A T****A BstBI T****A DraI T****A T****A

第二节 DNA 连接酶 一、DNA连接酶（ligase)的发现 从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。

二、DNA ligase的特点 1. 两种DNA连接酶 （1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端。 （2）T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。

2. 连接条件 （1）必须是两条双链DNA。 （2）DNA3’端有游离的-OH， 5’端有一个磷酸基团（P）。 （3）需要能量 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+

三、连接反应的机理 1. ATP（NAD+)提供激活的AMP。 2. ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。 +H3N AMP OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+

4. AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。 -OH HO-P- AMP -OH O-P-

5. 3‘-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。

四、连接反应的温度 1. 最佳温度 连接酶反应的最佳温度是37C。 2. 实用温度 但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。

五、影响连接反应的因素 1. 插入片段与载体的浓度比例 10~20倍。 增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。 2. 反应温度 12.5℃。 一般14~16℃

第三节 DNA聚合酶 一、基因工程中常用的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T7 DNA聚合酶 6. 逆转录酶

二、常用的DNA聚合酶的特点 1. 共同特点 把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。 2. 主要区别 持续合成能力和外切酶活性不同。 T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。 其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。

3. 常用DNA聚合酶的特性比较 DNA聚合酶 3’5’外切酶活性 5’3’外切酶活性 聚合速率 持续能力 大肠杆菌DNA聚合酶 低 有 中 Klenow fragment 无 T4DNA聚合酶 高 T7DNA聚合酶 快 化学修饰T7DNA聚合酶 遗传修饰T7DNA聚合酶 逆转录酶 Taq DNA聚合酶

三、DNA聚合酶在基因工程中的用途 1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I 主要用来制备带放射性标记的DNA探针。 ①一条单链多肽。 ②5’3’外切酶活性位于N端。 ③用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分。就成为Klenow fragment。

（2）DNA聚合酶I（Pol I）的反应条件 ① 底物： dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） ② Mg2+ ③ 带有3’—OH游离端的引物 ④ DNA模板 dNTPs 5’ -OH 3’

（3）用DNA聚合酶I 制备探针 ① 核酸探针（probe） 能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。 标记 已知序列的核酸片断 显示位置 与互补的待测序列杂交

② 探针的标记方式 5’ 标记 已知序列的核酸片断 已知序列的核酸片断 标记 3’ 带有放射性的已知序列的核酸片断

③ DNA聚合酶I 对探针序列的标记 放射性同位素标记： 切口转移法(nick translation )：

5’3’外切酶活性从DNA切口的下一段DNA5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3’一侧补上一个新的核苷酸。

5’ 3’ 纯化的DNA片断 3’ 5’ 3’ 5’ DNase I 制造单链切口 5’ 3’ 3’ 5’ 32P-dNTP 3’ 5’ 一种-32P-dNTP和dNTPs 5’ 3’ 32P-dNTP 5’ 3’ DNA Pol I 进行切口转移 3’ 5’ 从头至尾都被标记 8

2. Klenow fragment （1）Klenow fragment的性质 具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。（失去了5’3’外切酶活性）。 枯草杆菌蛋白酶 DNA Pol I  Klenow fragment (76KD）

（2）主要用途 ② DNA 3’末端标记 ① 3’端补平 补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。 klenow 5’ 5’ klenow 在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。

限制性内切酶切 EcoR I BamH I 3’隐蔽末端的DNA片断 25oC 1h Klenow fragment补平 末端标记的DNA 3’----CTTAA5’ 5’----G3’ 3’----CCTAG5’ 根据末端的顺序选择一种 -32P-dNTPs -32P-dATP -32P-dGTP 25oC 1h 5’----GAA3’ 3’----CTTAA5’ 5’----GG3’ 3’----CCTAG5’ Klenow fragment补平 5’----GAATT3’ 3’----CTTAA5’ 5’----GGATC3’ 3’----CCTAG5’ 末端标记的DNA

③ cDNA第二链的合成 mRNA 5’ 3’ 逆转录 cDNA第一链 3’ 5’ klenow 引物 cDNA第二链 3’ 5’

3. T4 DNA聚合酶 （1） T4 DNA聚合酶的性质 ① 来源 从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。 ② 酶活性 有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性（降解单链更快）。

③ 特点 当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3’5’外切酶功能，制造出3’隐蔽端。 如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。

5’ 3’ 3’ 5’ T4 DNA聚合酶 无dNTPs 5’ 3’ 3’ 5’ T4 DNA聚合酶 有dNTPs 5’ 5’

（2） T4 DNA聚合酶的用途 ① 补平隐蔽末端 ② DNA 3’末端标记 标记末端（取代合成法） 用3’5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隐蔽端、5’隐蔽端）制造出3’隐蔽端。 再利用它的5’3’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。

5’ 3’ DNA酶切片断 3’ 5’ T4 DNA聚合酶 （3’5’外切） 5’ 3’ 3’ 5’ 加入某种32P-dNTP和dNTPs 内切酶切 T4 DNA聚合酶 （5’3’聚合） 5’ 3’ 3’ 5’ 酶切中间产生两个末端标记 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’

a. 放射性标记的优缺点： 优点： 制作简单、 高比放射性、 放射自显影效果好。 缺点： 半衰期短（32P只有14.3天）、 不易保存、 对人体有害。 要求在专门实验室操作。

b. 非放射性标记 i）生物素标记： 生物素（biotin），又称维生素H、辅酶R CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH 可以与dNTP酰化结合成为生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。 也可以被生物素连接酶（biotin ligase）催化与蛋白质共价结合。

利用缺口转移法将生物素掺入DNA探针中 纯化的DNA片断 DNase I 制造单链缺口 生物素-dTTP和dNTPs 5’ 纯化的DNA片断 3’ 3’ 5’ DNase I 制造单链缺口 3’ 5’ 5’ 3’ 生物素-dTTP 生物素-dTTP和dNTPs 3’ 5’ 5’ 3’ 生物素-dTTP DNA Pol I 进行缺口转移 5’ 3’ 3’ 5’

光促生物素标记 探针序列 生物素 连接臂 光敏基因 + 光照 生物素 连接臂 光敏基因 探针序列

生物素的识别——亲和素： 能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用： 抗生物素蛋白（avidin）： 是一种鸡卵清蛋白。 链霉抗生物素蛋白（streptavidin）： 细菌中avidin的类似物。

ii）地高辛标记： 可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入DNA合成过程。形成地高辛标记的DNA探针。 地高辛的结合物是抗地高辛抗体。 生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂盒 (kit)。

iii）偶联酶及其底物 常用的两种酶： 辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase，HRPO） 碱性磷酸酶 （Alkaline Phosphatase, AP） 酶的作用： 催化一些特殊的反应，反应的过程中发出荧光（或生成有色的产物）。

化学发光底物

HRPO和AP的显色反应底物

发光反应机理

iv）用非放射性标记的探针检测原理 探针DNA用生物素或地高辛标记。 亲和素或地高辛抗体与酶偶联。 酶催化一个发光或显色反应。 底物 亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合。 底物 待测基因 生物素 探针序列 中间产物 酶 亲和素 发光 产物

核酸探针杂交筛选法的缺点是： 只检测是否有外源DNA插入，而不论该DNA是否表达出产物。

4. T7 DNA聚合酶 （1）来源 从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成： ① T7基因5编码的大亚基： 有5’3’聚合酶和3’5’外切酶活性。 ② 大肠杆菌编码的小亚基： 硫氧还蛋白。 增加大亚基对模板的亲和性。

（2）T7 DNA聚合酶的特点 ① 持续合成能力强 一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。 ② 3’5’外切酶活性高 单链和双链都能降解。 ② 3’5’外切酶活性高 单链和双链都能降解。 ③ 不受DNA二级结构的影响 其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍

（3）T7 DNA聚合酶的用途 ① 以大分子量DNA为模板的合成 如M13 ② 进行末端标记 取代合成法标记3’末端。 ③ 补平隐蔽末端 合成补平3’隐蔽末端； 水解修平3’突出末端。

5. 修饰后的T7 DNA聚合酶 （1）T7DNA聚合酶的化学修饰 去除3’5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。 双脱氧法。 ② 标记DNA 3’隐蔽末端 ③ 更有效地补平末端

6. 逆转录酶 依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。 （1）来源 RNA肿瘤病毒。 最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）： （2）AMV的性质 由和两条多肽链组成。

① 链 有反转录活性和 RNaseH活性。 RNaseH： 链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。 以5’3’或3’5’方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。 RNA DNA RNaseH RNA DNA

（3）逆转录酶的用途 ② 链 RNA-DNA杂交双链中5’3’DNA外切酶活性。 ① 合成cDNA 以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。 mRNA 5’ 3’ AAAAA 5’ TTTTT cDNA

② 合成DNA探针 用随机引物（random primer）或oligo dT做引物。 随机引物： 随机顺序形成的寡聚DNA片断。 （理论上它能与各种序列的模板结合） ③ RT-PCR用的模板 克隆某个基因时，用其mRNA反转录出cDNA第一链。

第四节 DNA修饰酶 一、末端脱氧核苷酸转移酶 （terminal transferase） 1. 来源 小牛胸腺。 2. 组成 大小两个亚基。 3. 特性 5’3’DNA聚合酶活性

① 需要3’—OH、二甲胂酸缓冲液。 ② 不需要模板！ ③ 底物可以是单链DNA、 是3’—OH突出的双链DNA、 平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。 ④ 随机添加的dNTPs。 如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。 3’ DNA 5’ dTTP ，末端转移酶 TTT

4. 末端转移酶的用途 （1）同聚物加尾 给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。 5’ 3’ 5’ 3’ dGTP dCTP 末端转移酶 CCC GGG CCC GGG

（2）再生酶切位点 便于回收克隆片断。 5’ AAGCTT TTCGAA 5’ HindⅢ酶切 A TTCGA AGCTT A Klenow补平

AAGCT TTCGA AGCTT TCGAA dTTP 末端转移酶 AAGCATTT TTCGA AGCTT TTTTCGAA AAA 外源DNA AAA

（3）非放射性标记DNA片断的3’端 连接 HindⅢ位点 HindⅢ位点 AAGCTTTT TTCGA AAA AGCTT TTTTCGAA AAA （3）非放射性标记DNA片断的3’端 催化非放射性标记物参入DNA片断的3’端。（生物素-11-dUTP等）

二、T4多核苷酸激酶 1. 来源 T4噬菌体的pseT基因编码。 从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。 多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。 2. 功能 催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。 不论5’-OH端突出与否。

5’ HO- -OH 3’ 3’ HO- -OH 5’ ATP T4多核苷酸激酶 3’ 5’ P- -OH 3’ HO- -P 5’ 如果ATP的磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5’端。 但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。

3. 多核苷酸激酶的用途 DNA 5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端。 （1）正向反应（forward reaction） 3’ 5’ P- -OH 3’ HO- -P 5’ 碱性磷酸酶 3’ 5’ HO- -OH 3’ HO- -OH 5’ (-32P)ATP 多核苷酸激酶 3’ 5’ 32P- -OH 3’ HO- -32P 5’

反应混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P与DNA5’端的磷酸交换。 （2）交换反应标记法 反应混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P与DNA5’端的磷酸交换。 3’ 5’ P- -OH 3’ HO- -P 5’ (-32P)ATP、ADP 多核苷酸激酶 3’ 5’ 32P- -OH 3’ HO- -32P 5’ 反应效果不理想。

三、碱性磷酸酶 1. 碱性磷酸酶种类 （1）细菌性碱性磷酸酶 Bacterial alkaline phosphatase，BAP 从大肠杆菌中分离出来。 具有抗热性。 （2）小牛肠碱性磷酸酶 Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP 从小牛肠中纯化出来。 SDS中加热68oC可完全失活。

2. 碱性磷酸酶的特性 3. 碱性磷酸酶的功能 催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。 3’ 5’ P- -OH 3’ HO- -P （1）防止线性化的载体分子自我连接

单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。 5’ AAGCTT TTCGAA HindⅢ酶切 5’ A-OH TTCGA- P P-AGCTT HO-A 5’ 碱性磷酸酶

A-OH TTCGA-OH HO-AGCTT HO-A OH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。 但同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能与脱磷酸的载体OH连接。

其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。 9 5’ 3’ P-AGCTT A-OH 外源DNA 3’ TTCGA-P HO-A 5’ 连接酶 -OH与-OH连不住 A TTCGA AGCTT A AGCTT A A TTCGA 其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。 9

第五节 核酸外切酶（ Exonucleases） 是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。 一、单链DNA外切酶 1. 大肠杆菌核酸外切酶I（exo I） 5’3’外切 识别5’-OH 2. 大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ（exo Ⅶ） 5’3’、3’5’外切 识别3’-OH、5’-P

二、双链DNA外切酶 1. 核酸外切酶Ⅲ（exo Ⅲ） 3’5’外切 识别3’-OH 主要用途： 在DNA双链的末端产生出单链区域。 5’ HO- 5’ exo Ⅲ 5’ 5’ 与klenow配合进行3’端标记

2. 核酸外切酶（ exo） 5’3’外切。 识别5’-P（但不能降解5’-OH） 主要用途： 使DNA双链变成单链（短）。 成为测序模板。

3. T7基因6核酸外切酶 5’3’外切。 既能识别5’-P，又能识别5’-OH。 5’ 5’ 5’ 5’ 用途与 exo一样。 已被克隆到大肠杆菌中表达。

DNA外切酶 切割方式 识别位点 单链 大肠杆菌核酸外切酶I（exo I） 5’3’ 5’-OH 大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ（exo Ⅶ） 3’5’ 5’-P 3’-OH 双链 核酸外切酶Ⅲ（exo Ⅲ） 核酸外切酶（  exo） T7基因6核酸外切酶

第六节 单链DNA内切酶 一、S1核酸酶 1. 来源 稻谷曲霉（Aspergillus oryzae）。 2. 特性 （1）高度单链特异性 （2）反应条件 ① 低水平Zn2+ ② pH4.0~4.3

3. S1核酸内切酶的功能 （1）催化单链RNA或DNA降解。 （2）切掉双链核酸中的单链区。 发卡或有缺口的部位。 S1 S1

甚至能识别单个核苷酸的单链区！ T TACGTA CGTACG ATGCAT GCATGC （3）降解限制酶切形成的单链突出端。 （4）不能降解双链DNA或RNA-DNA杂交链

4. S1核酸酶的用途 （1）定位RNA DNA RNA S1 RNA S1 200bp 400bp 内切酶位点不能位于内含子序列中！ 某限制酶位点（参照物） DNA 某限制酶切后再与RNA杂交 RNA S1 RNA S1 200bp 400bp 内切酶位点不能位于内含子序列中！

不能配对的内含子区域形成的单链环被S1切掉。 RNA位置 RNA位于某限制酶位点左200bp和右400bp。 （2）用mRNA测定基因中的外显子序列 不能配对的内含子区域形成的单链环被S1切掉。 DNA mRNA

二、Bal 31核酸酶 1. 来源 埃氏交替单胞菌（Alteromonoas espejiana） 2. 功能 既有单链特异的DNA（RNA）内切酶； 又有双链特异的DNA外切酶。 降解双链DNA或其上的单链缺口、未配对的单链区域。

4. Bal31的用途 3. 反应条件 Mg2+、Ca2+ EGTA（乙二醇双四乙酸）专一性螯合Ca2+，可终止反应。 定位测定DNA片断中的限制酶位点分布。 Hind III Pst I Pst I BamH I

Bal31控制消化法： 用Bal31消化线性DNA，并在不同的时间加入EGTA终止反应，再酶切电泳。

分别用各个内切酶切后电泳，记录片断数目和大小。 Hind III EcoR I BamH I Marker

分别用原内切酶切后电泳，判断片断数目和大小。 Bal31 BamH I Marker EcoR I Hind III 分别用原内切酶切后电泳，判断片断数目和大小。

总结 掌握Ⅱ类限制性内切酶的性质、用途、使用方法、影响限制性内切酶活性的因素；掌握DNA连接酶的性质、种类、连接机理；常用的DNA聚合酶、修饰酶、核酸酶的性质及用途。 了解限制-修饰现象；Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶；限制性内切酶的命名

思考题 什么是细菌的限制-修饰现象？ Ⅱ类限制性内切酶切割产生的末端类型有哪些？粘性末端有何实际意义？ 简述利用Ⅱ类限制性内切酶消化DNA的步骤？ 影响限制性内切酶活性的因素有哪些？ 使用限制酶应该注意哪些问题？ DNA连接酶有哪些性质，哪些种类？ 试述DNA连接酶的连接机理？ 影响DNA连接反应的因素有哪些？

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段各有哪些性质及用途？ 什么是切口平移？ 简述T4 DNA聚合酶的酶活性、特点及用途？ 常用的单链和双链DNA外切酶有哪些？各有什么特点？ RNase H和RNase Ⅰ各有什么用途？ S1核酸内切酶的功能有哪些？ 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些特性及功能？ T4多核苷酸激酶有什么功能、用途？ 碱性磷酸酶处理的载体为什么不会自连但能与外源DNA连接？