霍山石斛细胞悬浮培养及条件优化 目的要求 方法

Slides:



Advertisements
Similar presentations
“ 十五 ” 国家级规划教材 新世纪全国高等中医院校规划教材 中 医 妇 科 学 总 论 主讲人 李朝平.
Advertisements

中医护理 —— 鱼腥草 护理 1334 班 小组成员:郭丽丹 43 杨专 39 张建 35 李晓敏 27 陈燕红 25 张良州 8 分工合作: 收集整理 43 郭丽丹 35 张建 27 李晓敏 讲解 39 杨专 25 陈燕红 8 张良洲.
玉田三中 化学组. 生活中的这些物质 …… 酸的 食醋、酸奶和某些水果都是 酸的,你是如何知道的?
第三节 排气护理. 一、肠胀气病人的护理 肠胀气是指胃肠道内有过多的气体积聚,不能 排出。 1. 心理护理 2. 适当活动 3. 必要时遵医嘱给药或行肛管排气 4. 健康教育.
第四章 基础护理操作技术 中 国 医 科 大 学朱 闻 溪中 国 医 科 大 学朱 闻 溪 中 国 医 科 大 学朱 闻 溪中 国 医 科 大 学朱 闻 溪.
成癮物質的真相. 物質濫用 所謂「物質濫用」是指反覆使用某物質, 造成生理上的危害,並可能出現與物質有 關的違法問題,即使可能出現無法擔任工 作、學校或家庭職務的情形,依然無法放 棄、繼續使用此物質。
舌尖上的中国 —— 红烧肉 红曲米 豆腐乳 红曲甘、温、无毒, 主治消食活血,健 脾燥胃 …… 天然色素 —— 红曲色素.
畜禽繁殖技术 精液的品质检查. 学习目标 1. 了解家禽精液的组成。 2. 掌握精液品质鉴定的方法。
客家娘酒 生命科学院 062 第二组 组长:李宗权 组员:林立强 李嘉豪 郑灿明 李耀斌 程惠源.
芦荟汁酶解液 乳酸菌发酵饮料的研制 上海市奉贤区育秀实验学校 陈力. 2 设想的由来 3 问题的出现 由于芦荟含有较多的凝胶大分 子物质,加热、调酸等会影响 胶体稳定性,出现变色和沉淀 等现象。
5 消毒与灭菌 5.1 常用医疗物品的消毒灭菌法 5.2 船舶常见传染病的消毒处理措施.
基层医疗机构 环境物品的清洁消毒与灭菌 金凤玲.
常见鱼病的诊断与防治 主讲:黄志秋.
药物溶媒 生理盐水还是葡萄糖?.
分子生物学部分开发实验 植物遗传亲缘关系研究.
课 题 2 酸和碱的中和反应 课 题 2 酸和碱的中和反应 第 二 课 时.
第七章 各类中药制剂分析 药物分析学科.
中医美容保健.
第7章 隔离技术 厦门医学高等专科学校 基础护理教研室.
生活护理技术 项目一 医院感染的预防与控制 项目二 排泄护理技术 项目三 促进呼吸功能护理 项目一 冷热疗法 项目二 标本采集 项目三
国家示范性职业学校精品课程资源建设项目成果
食品分析 实验.
实验性质:综合 实验类别:本科基础实验 实验学时:4 实验教师:陈兴都
制冷系统脏堵、冰堵和有空气的识别与排除;系统抽真空
医疗废物管理 医院感染管理科 李建军.
第十章 发酵蛋制品与蛋品饮料.
公共场所卫生.
第十三章 神经系统疾病患儿的护理 第一节 小儿神经系统解剖生理特点 第二节 化脓性脑膜炎 第三节 病毒性脑膜炎、脑炎.
一寸光阴一寸金 寸金难买寸光阴 时间.
手足口病疫源地消毒指南 二OO九年七月二十一日.
生物技术制药 第六章 植物细胞制药.
2015年北京协和医院检验 科生物安全培训.
三种中国南海红树林内生真菌 次级代谢产物的研究
产后出血产妇的护理.
案例: 今年7月下旬在松江中心医院住院的刘某病情危重,血小板下降到正常人的10%左右,如不立即输血小板,极可能出现颅内出血、消化道出血等,任何止血药都止不住,可血库紧缺血小板。 松江区血站第一时间向成分献血志愿者发出了短信,立刻得到很多志愿者的响应,成分献血志愿者的接力捐献挽救了病患生命 。
实验11 植物的组织培养.
第九章 细 胞 培 养.
指導老師:顏明賢 班級:四高四A 姓名:蔡富凱 學號:4971G003
第二章 动物和人体生命活动的调节 第二节 通过激素的调节. 第二章 动物和人体生命活动的调节 第二节 通过激素的调节.
托幼机构消毒 隔离知识培训 海淀区疾病预防控制中心 消毒科
学校常见传染病消毒技术 晋江市疾病预防控制中心 2014年12月28日.
由一张“恶心”的图片说起 和大家一样我也不愿意看见这张恶心的图片,但可以想一下,如果你或你的家人在术后,手术切口感染到这种地步你会是什么感受?
第二部分 园 林 苗 木 培 育.
粪 便 检 查 主讲老师:沈萍.
重金属检查法.
中药注射剂 中药制剂学教研室 刘 莉
三峡大学化学与生命科学学院微生物学教学组
食物中主要营养成分的检验 上海市第二初级中学 王颖. 食物中主要营养成分的检验 上海市第二初级中学 王颖.
盆腔炎的护理 梅剑娟.
学校食物中毒的预防与控制 邓 红 四川旅游学院
托幼机构 消毒隔离知识培训 海淀区疾病预防控制中心 消毒科
洗手消毒液(优威) 1.杀菌力卓越,第一个获得中国卫生部“卫消字”批准文号的洗手液
卫生监督协管技术 规范及要点 广东省基本公共卫生服务项目办 2015年4月.
专题3 植物的组织培养技术 课题1 菊花的组织培养.
促胃肠动力药物筛选 —离体组织、器官水平药物筛选
培养基、试剂的配制及 细菌纯化培养.
3.8.1 代数法计算终点误差 终点误差公式和终点误差图及其应用 3.8 酸碱滴定的终点误差
模块八 发动机总成装配与试验 单元1 发动机总成装配 单元2 发动机的磨合 单元3 发动机竣工验收.
超越自然还是带来毁灭 “人造生命”令全世界不安
生物分离工程典型工艺单元操作 湖南科技学院 化学与生物工程学院.
精品课程 项目五 组培苗的培养 咸宁职业技术学院.
蔬菜农药含量的快速检测 康宁科技实验小学 一(2)班 | 顾思仪 |
土豆磷酸化酶的分离及直链淀粉的酶合成 中南民族大学 药学院 化学生物学教研室.
精品课程 项目十 观赏植物组织培养 咸宁职业技术学院.
遗传病的分析3 培养细胞的染色体制备.
床上洗头.
FH实验中电子能量分布的测定 乐永康,陈亮 2008年10月7日.
细胞分裂 有丝分裂.
实验性质:设计 实验类别:本科基础 实验学时:4 实验教师:温晓玫
病理生理学教研室 细胞信号通路检测(一) 总蛋白提取.
Presentation transcript:

霍山石斛细胞悬浮培养及条件优化 目的要求 方法 利用细胞悬浮培养技术生产霍山石斛单细胞,解决石斛药用植物资源短缺问题。 方法 以霍山石斛叶片等外植体为实验材料,通过不同的制备方法获得霍山石斛单细胞,研究霍山石斛细胞培养的多种影响因素,应用正交设计优化霍山石斛细胞悬浮培养的条件。

近年来,国内外对药用植物石斛进行了大量深层次的开发,对石斛的需求量也越来越大,而多年来石斛主要靠采收野生资源供药用和出口,由于野生石斛繁殖很慢,自然更新能力很差,加之生态环境的制约,人为过度采掘,致使野生资源日渐枯竭。 其中霍山石斛Dendrobium huoshanense C. Z. Tanget S. J Che 等名贵品种已成为日益稀少的濒危植物,被国家列为重点保护的药材品种。

应用种子离体萌发诱导原球茎或原球茎悬浮培养方式 培养霍山石斛 本实验应用霍山石斛为起始培养材料,以其茎尖和茎段为外植体,通过酶法和机械法获取单细胞,并进行大量培养。该培养方法可明显缩短霍山石斛生长繁殖周期,更宜于后期的有效成分提取等工业生产步骤,对解决石斛资源短缺问题具有重大意义。

1、材料与方法 1.1 材料与试剂 1.2 实验方法

1.1 材料与试剂 液体培养基为改良的MS; 碳源:蔗糖、葡萄糖; 氮源:NaNO3、NH4NO3、NH4Cl、脲; 1.1 材料与试剂 液体培养基为改良的MS; 碳源:蔗糖、葡萄糖; 氮源:NaNO3、NH4NO3、NH4Cl、脲; 植物生长调节剂:IAA、6-BA

1.2 实验方法 1.2.1 外植体灭菌 1.2.2 霍山石斛单细胞的制备 1.2.3 培养基的选择 1.2.4 接种与培养

1.2.1 外植体灭菌 取霍山石斛幼茎段冲洗干净,70%酒精浸1 min 后无菌水冲洗5 次,转入0.1%HgCl2 加1 滴聚山梨酯80 消毒10min 后,无菌水冲洗5 次,用无菌纱布或无菌滤纸吸干水后待用。

1.2.2 霍山石斛单细胞的制备 取霍山石斛灭菌后的外植体,采用组织匀浆机匀浆(或酶解法或玻璃珠捣碎法),滤过,离心,获得霍山石斛单细胞悬浮液。

1.2.3 培养基的选择 以 MS 为基本培养基,pH5.0~6.0; 1.2.3 培养基的选择 以 MS 为基本培养基,pH5.0~6.0; 6-BA/IAA 的配比分别为:2.0︰0.4、1.0︰0.4、0.5︰0.4、1.0︰0.2 和1.0︰0.(mg/L);添加物为香蕉泥。

1.2.4 接种与培养 用移液器移取3 mL 霍山石斛单细胞悬浮液注入各个培养瓶内,同时用超滤器向每瓶内各滴入不同质量浓度的IAA 和6-BA 组合,将已接种的三角瓶置于(25±2)℃,180 r/min 的恒温摇床中进行黑暗培养

2、 结果 2.1 不同提取方法对获取霍山石斛单细胞的影响 2.2 碳源对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 2、 结果 2.1 不同提取方法对获取霍山石斛单细胞的影响 2.2 碳源对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 2.3 氮源对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 2.4 pH 对霍山石斛细胞培养的影响 2.5 培养时间对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 2.6 不同激素配比对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 2.7 培养温度对石斛细胞悬浮培养的影响 2.8 正交试验的设计与结果 2.9 石斛细胞传代培养

2.1 不同提取方法对获取霍山石斛单细胞的影响 本实验获取霍山石斛单细胞主要用了3 种方法:机械匀浆组织破碎提取法、酶解法、玻璃珠捣碎法。 3 种方法得到的细胞数分别为:7.73×105、1.19×106、1.54×106 个/mL,说明玻璃珠捣碎法效果最好,本实验的操作均采用玻璃珠捣碎法。

2.2 碳源对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 分别选用蔗糖和葡萄糖作为碳源对霍山石斛细胞进行悬浮培养,实验结果表明,蔗糖培养的石斛细胞数目为1.13×106 个/mL,葡萄糖培养的石斛细胞数目为6.93×105 个/mL。蔗糖比葡萄糖更适宜石斛细胞的培养,故用蔗糖作为碳源;同时又用不同质量浓度蔗糖对霍山石斛细胞培养,结果如图1 所示。

图1 蔗糖浓度对石斛细胞悬浮培养的影响 10 8 6 4 2 10 20 30 40 50 蔗糖质量浓度/(g·L−1) 细胞数目/(×105个·mL−1) 8 6 4 2 10 20 30 40 50 蔗糖质量浓度/(g·L−1)

2.3 氮源对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 实验选用了 4 种不同氮源对霍山石斛细胞进行悬浮培养,结果见图2。

图 2 氮源对石斛细胞悬浮培养的影响

2.4 pH 对霍山石斛细胞培养的影响 培养基的 pH 值与细胞的生长繁殖关系密切,在培养过程中过酸或过碱可导致细胞死亡,这主要与蛋白质的变性和细胞膜的结构受损有关。植物细胞培养的pH 一般控制在微酸性的范围内,即pH为5.0~6.0本实验考察不同pH 对霍山石斛细胞数目的影响,结果如图3 所示。

图 3 pH 值对石斛单细胞培养的影响

2.5 培养时间对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 霍山石斛细胞在营养充足的情况下,开始快速地有丝分裂,细胞的数目随着时间的变化而变化。 通过培养、观察、计数,得到其数目变化的结果见图4。由图可知,在前12 d,石斛细胞进行迅速的有丝分裂;到第14 天有丝分裂开始缓慢,并趋于稳定达到最大值1.673×106 个/mL;18 d 以后逐渐呈下降趋势。因此最佳培养时间为14~18 d。

图 4 培养时间对石斛细胞培养的影响

2.6 不同激素配比对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 在植物细胞培养的过程中激素的种类及其比例都对植物细胞的生长、繁殖、分化、发育和新陈代谢起重要调节控制作用。取6-BA/IAA 分别为2.0︰0.4、1.0︰0.4、 0.5︰0.4、1.0︰0.2 和1.0︰0.1 不同配比(mg/L),进行培养,结果如图5 所示。

图 5 激素配比对霍山石斛细胞悬浮培养的影响

2.7 培养温度对石斛细胞悬浮培养的影响 培养温度与细胞的生长繁殖关系密切。不同培养温度下获得的石斛细胞数目结果如图6 所示。在其他条件均相同的情况下,当培养温度调控在(25±2)℃时,石斛细胞数目为1.019×106当培养温度调控在(35±2)℃时,培养的石斛细胞数目为6.15×105 个/mL。故培养的最适温度是(25±2)℃。

图 6 培养温度对石斛细胞培养的影响

2.8 正交试验的设计与结果 根据以上单因素优化的结果,选取影响霍山石斛细胞培养的4 个主要因素,采用L9(34)正交试验,考察pH (A)、碳源(B)、氮源(C)和激素配比(D),结果见表1。 表 1 正交试验因素水平表 个/mL。按正交试验设计,配制不同的培养基,接种后在温度(25±2)℃,转速120 r/min 条件下培养,结果见表2。

表2 正交分析试验结果及极差分析

对霍山石斛细胞培养条件进行L9(34)试验,结果表明:4 个因素对石斛细胞的生长影响顺序依次是B>D>A>C,即碳源>激素配比>pH>氮源。蔗糖35 g/L,NH4NO3 为1.3 g/L,pH 为5.6,激素配比6-BA/IAA 为1.0︰0.4 组合的培养细胞数最多,为9.42×105 个/mL。

2.9 石斛细胞传代培养 本实验在原代悬浮培养霍山石斛细胞 14 d 后,对石斛细胞进行了第1 次传代培养,即将原代细胞从培养箱中取出,静置10 min,然后在超净工作台上取5 mL 原代培养上清液注入到含有香蕉泥的完全培养基中,继续培养。随后每隔10 d 传代1 次,共传代4 次,以此来建立细胞系。传代后的细胞长势较原代不同,最大特点就是细胞较圆,可见细胞壁,如图7 所示。

图 7 霍山石斛细胞培养前(A)及培养后(B)的细胞形态

根据显微摄影图片可以看出,霍山石斛细胞在培养前后形态发生了很大变化。培养前的霍山石斛细胞悬浮液较分散均匀,单细胞较少,且多为游离状,可明显观察到细胞碎片,霍山石斛细胞多呈大小不一,不规则的多边菱形。培养后的霍山石斛细胞有的紧挨在一起,形成细胞团,经过4 次继代培养后霍山石斛细胞多为圆状或椭圆状,细胞数目明显增多。

3 结论与讨论 3.1 单细胞的制备 3.2 激素配比 3.3 添加物

3.1 单细胞的制备 植物细胞可以从外植体中直接分离获得,从外植体中直接分离植物细胞的方法通常有机械法、玻璃珠捣碎法和酶解法。 本实验主要采用玻璃珠捣碎法制备单细胞。

3.2 激素配比 植物激素是植物细胞培养中不可缺少的成分,其种类及比例都对植物细胞的生长、繁殖、分化、发育和新陈代谢起调节控制作用。 经过实验得出当6-BA/IAA 为1.0︰0.4 时是石斛细胞悬浮培养的最适激素配比,即6-BA 为1.0 mg/L和IAA 为0.4 mg/L。

3.3 添加物 香蕉泥:香蕉提取物除了提供植物细胞生长发育所需的养分外,还对维持培养基的pH 值在5.0~5.5 有缓冲作用 实验结果显示,石斛细胞培养的最适香蕉泥质量分数是15%