第五章 微生物的生长 生长是代谢的结果。当同化超过异化，细胞物质量增加，个体重量和体积增大，就是生长。 第五章 微生物的生长 　生长是代谢的结果。当同化超过异化，细胞物质量增加，个体重量和体积增大，就是生长。 　单细胞的细胞物质增加有限，细胞长大到一定程度就开始分裂繁殖，菌体数量增多，生长多通过繁殖表现出来，以群体细胞数目增加为生长标志。 　丝状微生物的生长主要表现为菌丝的伸长和分枝，通常以菌丝的体积和重量增长来衡量生长状况。

第一节 微生物纯培养的生长 一、纯培养的分离方法：在实验室条件下得到1个细胞繁殖后代的过程称为纯培养。第一步是分离培养，最常用的分离方法有稀释法、划线法、单细胞挑取法、组织分离法及利用选择培养基分离法等。

一 、纯培养的分离方法 （一）、稀释法： 1、液体稀释法--首先将待分离的材料接种于培养液中，经培养测定或估计单位容积中的含菌数目，然后进行稀释，使稀释后的一定容积(如两滴或三滴)液体中大约只含一个微生物个体；其次则将已稀释好的菌液接种1滴（0．05ml）至液体培养基试管中，摇匀，静置培养24～48小时后，观察如果管底只出现一个菌落，它可能就是由一个细胞繁殖而成。这种方法适用于细胞较大的微生物。

一 、纯培养的分离方法 2、固体稀释平皿倾注法--将待分离材料作系列稀释(1:10、1:100……)，分别取不同稀释度的溶液少许，与已熔化并冷却至45℃的琼脂培养基相混合摇匀后，倒入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，保温培养一定时间出现菌落。如果稀释得当，平皿上可出现分散的单个菌落，挑取单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。

　　　　　　　稀释倒平皿分离法

一 、纯培养的分离方法 （二）、平皿划线．涂布分离法：用接种环沾取少许待分离的材料，在平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物逐渐减少，划到最后，常可形成单个孤立的菌落，这种单个菌落可能由一个细胞繁殖而来，故可获得纯培养。用玻璃刮铲代替接种环在平板表面涂布，可得到同样结果。

平皿划线分离法：A.扇形划线;B.连续划线;C.方格划线

一 、纯培养的分离方法 （三）、单细胞挑取法：从待分离材料中挑取一个细胞，获得纯培养。具体方法是将显微镜挑取器装置在显微镜上，把一滴细菌悬液置于载玻片上，用安装在显微镜挑取器上的极细的毛细吸管，在显微镜下对准某一个细胞后挑取，再接种于培养基上培养。此法需要非常熟练的操作人员，多限于高度专业化的科学研究中采用。

一 、纯培养的分离方法 （四）、组织分离法：主要用来分离高等真菌和某些植物病原菌。取一小块植株或器官组织，用0.1%的升汞(HgCl2)溶液进行表面消毒3～5min，无菌水洗涤数次，移置培养基表面，适温培养。3～5天后，组织块周围出现菌丝生长，确认后，可由菌落边缘挑取部分菌丝转入斜面；对于能产生弹射孢子的高等真菌来讲，可将消过毒的菌盖剪成黄豆大的小块，悬挂在装有PDA培养基的三角瓶内，从而能较快地获得纯培养。

一 、纯培养的分离方法 （五）、利用选择培养基分离法：通过营养物质，生长环境（PH．高温等），化学试剂的特性，配制适合某种微生物生长，而限制其他微生物生长的各种选择性培养基，以达到纯种分离的目的。 有些病原菌可先将其接种至敏感动物，感染后，宿主的某些组织可能含有该种微生物，这样较易得到纯培养。

二、（群体）生长的测定方法 （一）、细胞数量的测定： 1、直接测数法或总菌数测定法--单细胞类群。需用细菌计数器或血球计数板(适用于酵母、真菌孢子等)。菌悬液浓度一般不宜过低或过高(常大于106个/ｍl )；简便、易操作，难于区分死活细胞及形状与微生物类似的杂质。

（一）细胞数量的测定 2、比浊法--在一定浓度范围内，菌悬液中细胞浓度与液体光密度成正比，与透光度成反比。菌数越多，透光量越低。通过光电比色计450-650nm测定光密度或透光率反映细胞的浓度。常用于观察和控制培养过程中微生物菌数的消长情况。如细菌生长曲线的测定和发酵罐中的细菌生长量的控制等。培养液的色调不宜过深，同时菌悬液浓度必须在107/ml以上才能显示可信的混浊度。其优缺点与直接测数法相同。

（一）细胞数量的测定 3、稀释平板计数法-- 高度稀释条件下，每一个活的单细胞能繁殖成一个菌落，可以通过菌落数去推算菌悬液中的活菌数。得到的数值往往比直接法数字小。本法是迄今广泛采用的活菌计数方法，具体分为平板涂抹法和倾注法。该法的缺点是程序麻烦，费工费时，而且在混合微生物样品中只能测定占优势并能在供试培养基上生长的类群。

（一）细胞数量的测定 4、液体稀释培养计数--将待测样品作一系列稀释，一直稀释到取少量该稀释液（如1ML）接种到新鲜培养基中没有出现生长繁殖为止。最后一级出现菌生长的稀释度称为临界级数，从3～5次重复的临界级数求最大概率数(MPN)，就可得到较可靠的结果。

（一）细胞数量的测定 例如：某一细菌在稀释计数法中的生长情况如下：

（一）细胞数量的测定 根据上述结果，其数量指标为“541”，查5次重复测数统计表，得近似值为17。乘以第一位数的稀释倍数（105 ）， 则原液中的活菌数=17×100000=1.7×106

（一）细胞数量的测定 例如：巴氏消毒的牛奶样品作100、 10－1、10－2稀释，各5管重复，分别加1ml样品接种（9＋1）。培养后， 1005管均出现生长， 10－13管生长， 10－2没有生长，其数量指标为530，查表的近似值为7.9，则每毫升牛奶中含活菌数为：7.9 × 100个。

（一）细胞数量的测定 5、浓缩法--本法适用于检测微生物数量很少的水和空气等样品。测定时先让定量的水或空气通过特殊的微生物收集装置(如微孔滤膜等)，富集其中的微生物，然后将收集的微生物洗脱后按上法测数，再换算成原来水或空气中的数量。

（二）细胞生物量的测定 1、细胞干重法--将单位体积培养液经离心或过滤后收集，用清水反复洗涤菌体，常压105℃、100℃或红外线烘干， 40℃或80℃真空干燥，精确称重，计算培养物总生物量。 丝状真菌用滤纸过滤 ，细菌用醋酸纤维膜等过滤。在琼脂平板上培养的菌体经短时间高温待琼脂溶化后滤出真菌菌丝，洗净、烘干后测干重。一般细菌每1mg干重约等于4～5mg鲜重，4～5×109 个细胞。本法适宜于含菌量高，不含或少含非菌颗粒性杂质的环境或培养条件。

（二）细胞生物量的测定 2、总氮量测定法--蛋白质是生物细胞的主要成分，核酸及类脂等中也含有一定量的氮素。已知细菌细胞干重的含氮量一般为12～15％，酵母菌为7.5％，霉菌为6.0％。用化学分析方法（如用硫酸、高氯酸、碘酸或磷酸等消化法）测出待测样品的含氮量，推算细胞的生物量。 适用于固体或液体条件下微生物总生物量的测定，需充分洗涤菌体以除去含氮杂质 ，操作程序较复杂，一般很少采用。

（二）细胞生物量的测定 3、DNA含量测定法--微生物细胞中的DNA含量不高(如大肠杆菌约占3%～4%)，比较稳定，可以根据分离出样品中的DNA含量来计算微生物的生物量。如细菌细胞平均含DNA8.4×10-5ng/个

（二）细胞生物量的测定 4、代谢活性法--测定单位体积培养物在单位时间内消耗的营养物或O2的数量，或者测定微生物代谢过程中的产酸量或CO2量等，均可以在一定程度上反映微生物的生物量。本法系间接法，影响因素较多，误差也较大，仅在特定条件下作比较分析时使用。

三 、细菌的群体生长—生长曲线 细菌在适宜条件下，若能保证营养供应，及时排出代谢产物将以较高速度繁殖。 在有限的液体培养基中，接种少量纯培养细菌，并在培养过程中定时取样测数，以时间为横坐标，菌数的对数为纵坐标，可以绘出一条类似于S形的曲线，这就是细菌的生长曲线。

细菌生长曲线： 1,2.延迟期；3.对数期；4,5.稳定期；6.衰亡期

（一）延滞期(适应期) 接种到新鲜培养液中，细菌需要重新调整大．小分子组成，以适应环境准备分裂。 通常表现为个体变长，体积增大和代谢活跃，RNA含量增加使细胞质的嗜碱性增强，贮藏物消失；细胞对外界理化因子的抵抗能力减弱。 增殖率与死亡率相等，均为零；菌数曲线平稳。 延滞期长短取决于遗传特性、菌龄及接种前后培养条件的差异等。细菌、酵母菌短，霉菌次之，放线菌最长。对数期菌种可缩短乃至消除延滞期。

（二）对数期(指数期) 生长旺盛，代谢活力增强，分裂速度加快，菌数以几何级数增加，代时稳定，活菌数与总菌数非常接近，曲线为一条上升的直线。 以细菌为代表，Nt＝No2n ；ｎ为to到ｔ繁殖代数。如果用G来表示世代时间(或倍增时间):即群体细胞数量增加一倍需要的时间，则：G＝(t-to)/n (1)ｎ= log（Nt/ No）/0.301 (2) G＝0.301(t- to)/log（Nt/No） (3) 测No、Nt．ｔo、ｔ，计算世代时间。

（二）对数期(指数期) 一般不超过40代。影响世代时间主要有3种。 1、菌种 漂浮假单胞菌9.8min，密螺旋体33ｈ。 　　一般不超过40代。影响世代时间主要有3种。 1、菌种　漂浮假单胞菌9.8min，密螺旋体33ｈ。 2、营养--丰富则代时短。浓度很低时，影响生长速率；浓度增高，影响最终菌体产量；提高到一定浓度，则生长速率和菌体产量两者均不受影响。凡是处于较低浓度范围内，影响生长速率和菌体产量的营养物，就称为生长限制因子。 3、培养温度-

（三）稳定期 在对数末期，营养物质逐渐消耗，有生理毒性的代谢产物积累及pH和Eh等不利变化，生长速度降低，增殖率下降而死亡率上升，当两者趋于平衡时，就转入稳定期。 活菌数最高，基本稳定并可相对持续一定时间。个体较小并开始累积贮藏物和特殊的次生代谢产物 ，芽孢细菌则开始形成芽孢。 稳定期长短与菌种和环境有关，发酵工业通过补料。调节ｐH、温度或通气量等延长稳定期。

（四）衰亡期（衰老期） 稳定期后，营养和环境进一步恶化，死亡率迅速增加，以致明显超过增殖率，尽管群体的总菌数仍然较高，但活菌数急剧下降，其对数与时间呈反比，表现为按几何级数下降，生长曲线直线下垂。又称为对数死亡期。 细胞多形态，大小或形态变异的畸形或退化型，革兰氏染色不稳定，许多G+细菌的衰老细胞可能表现为G-。

四 、分批培养 将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获，称为分批培养。 培养料一次加入，不补充和更换。随着生长，营养物质逐渐消耗，有害代谢产物不断积累，对数期不可能长时间维持。

五、连续培养 在培养器中不断补充新鲜营养物质，并以同样速度排出培养物(包括菌体及代谢产物)，从理论上讲，对数生长期就可无限延长。只要培养液的流动量能使分裂繁殖增加的新菌数相当于流出的老菌数，就可保证培养器中总菌量基本不变,此种方法就叫连续培养法。 连续培养可随时为微生物研究提供一定生理状态的实验材料，而且可提高发酵工业的生产效益和自动化水平，已成为当前的发展方向。

连续培养装置A.恒浊培养系统；B.恒化培养系统1.无菌培养基容器；2.控制流速阀；3.培养室；4.排出管；5.光源；6.光电池； 7.流出物

五、连续培养 （一）、恒浊连续培养：不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定的连续培养方法。装有浊度计，借光电池检测培养浊度(即菌液浓度)，根据光电效应的电信号变化，自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速。培养基含过量必需营养物时，可维持菌体最高生长速率。 为了获得大量菌体以及与菌体相平行的代谢产物时，使用此法具有较好的经济效益。

五、连续培养 （二）、恒化连续培养：控制恒定的流速，使营养物浓度基本恒定，从而保持细菌的恒定生长速率。营养物浓度低，才影响生长速率，一定范围内，生长速率与营养物的浓度成正相关。 必须将某种必需的营养物质（氮．碳源及生长因子，无机盐等）控制在较低的浓度，作为限制因子，而其他营养物均为过量，使生长速率取决于限制性因子浓度。通过自动控制系统保持限制因子的恒定流速，不断予以补充，使细菌保持恒定的生长速率。浓度不同的限制性营养物，可以得到不同生长速率的培养物。

营养物浓度对生长速率的影响

六、同步生长 在分批培养中，细菌群体能以一定速率生长，但所有细胞非同时分裂，细胞不处于同一生长阶段，生理状态和代谢活动也不完全一样。如果以群体测定结果的平均值代表单个细胞就必须设法使群体处于同一发育阶段，使群体和个体行为变得一致，即单细胞同步培养技术。

六、同步生长 能使培养的微生物比较一致，生长发育在同一阶段上的培养方法叫同步培养法，这种生长方式叫同步生长，所得到的培养物叫同步培养或同步培养物。 同步培养常用以下3种。 （一）、机械法(又称选择法)： （二）、调整生理条件同步法： （三）、抑制DNA合成法：

细菌的同步生长与非同步生长

六、同步生长 （一）、机械法(又称选择法)： 1、离心沉降分离法- 2、过滤分离法 3、硝酸纤维素薄膜法— 机械法不影响细菌代谢，菌体生命活动较为正常。有些微生物即使在相同的发育阶段，个体大小也不一致，甚至差别很大，采用这类方法。

（一）机械法(又称选择法) 1、离心沉降分离法— 生长阶段不同，个体大小不同。 离心使大小不同的细胞群体在一定程度上分开。 用同样大小的细胞进行培养便可获得同步培养物。

（一）机械法(又称选择法) 2、过滤分离法— 应用孔径大小不同的微孔滤膜，可将大小不同的细胞分开 。 用同样大小的细胞进行培养便可获得同步培养物。 用适宜孔径的微孔滤膜，将不同步的大肠杆菌群体过滤，刚分裂的幼龄菌体较小，能够通过滤孔，其余菌体都留在滤膜上面，将滤液中的幼龄细胞进行培养，就可获得同步培养物。

（一）机械法(又称选择法) 3、硝酸纤维素薄膜法— 将菌液通过硝酸纤维素薄膜。细菌与滤膜带有不同电荷，能使细菌附着于膜上； 翻转薄膜，再用新鲜培养液滤过培养； 附着于膜上的细菌进行分裂，分裂后的子细胞不与薄膜直接接触，由于菌体本身的重量，加之菌体附着的培养液重量，下落到收集器内 ； 收集器在短时间内收集的细菌处于同一分裂阶段，培养后，得到同步培养物。

硝酸纤维素薄膜法

（二）调整生理条件同步法 又称诱导法 ：主要通过控制环境条件诱导同步生长。 1、温度调整法 2、营养条件调整法 3、用稳定期的培养物接种 -2、营养条件调整法 2、营养条件调整法

（二）调整生理条件同步法 1、温度调整法--将培养温度控制在接近最适温度一段时间，缓慢进行新陈代谢，但又不进行分裂（使细胞的生长在分裂前不久的阶段稍微受到抑制），然后将培养温度调整到最适生长温度，大多数细胞就会进行同步分裂。

（二）调整生理条件同步法 2、营养条件调整法--控制营养物浓度或组成以达到同步生长。诱导因子必须不影响生长但可特异性地抑制细胞分裂，当移去(或消除)该抑制条件后，微生物又可立即同时出现分裂。 例如将大肠杆菌胸腺嘧啶缺陷型菌株，培养在不含胸腺嘧啶的培养基内一段时间，所有的细胞在分裂后，由于缺乏胸腺嘧啶，新的DNA无法合成而停留在DNA复制前期，随后在培养基中加入适量胸腺嘧啶，所有细胞都同步生长。

（二）调整生理条件同步法 加入某种抑制蛋白质合成的物质(如氯霉素)，诱导一定时间再转到另一种完全培养基中培养； 用紫外线处理，对光合性菌体采用光照与黑暗交替处理法等，可达到同步化。 诱导芽孢杆菌在同一时间内萌发，得到同步培养物。

（二）调整生理条件同步法 3、用稳定期培养物接种 处于稳定期的细胞，由于环境条件的不利，细胞均处于衰老状态，移入新鲜培养基中，可得到同步生长。

（三）抑制DNA合成法 DNA的合成是一切生物细胞进行分裂的前提。利用代谢抑制剂阻碍DNA合成一段时间，然后再解除抑制，也可达到同步化的目的。 氨甲蝶呤、5-氟脱氧尿苷、羟基尿素、胸腺苷、脱氧腺苷和脱氧鸟苷等，对细胞DNA合成的同步化均有作用。10~-6mol/L氨甲蝶呤或5-氟脱氧尿苷处理培养物，在16小时内可以抑制DNA的合成。加入4×10~-6mol/L的胸腺苷，解除这种抑制，细胞即可进行同步化生长。

六、同步生长 应该明确，同步生长的时间，因菌种和条件而变化。由于同步群体的个体差异，同步生长不能无限地维持，往往会逐渐破坏，最多能维持2～3个世代，又逐渐转变为随机生长。

七、微生物的生长规律 （一）、细菌在平板上的生长： 将单个非扩散性细菌接种到适宜的琼脂平板表面，细菌将从培养基中吸收养料而生长繁殖。由于细菌不能在固体基质表面扩散，新产生的子细胞不与母细胞分开而继续生长繁殖，直至形成肉眼可见的菌落。 研究表明，这一生长过程可分为两个阶段。

（一）细菌在平板上的生长 1、前期--指从单个细胞开始分裂到形成的微菌落的半径小于琼脂平板厚度的时期。 全部细胞都能获得培养基的营养支持，不断进行分裂繁殖。 微菌落半径R与生长速度V、菌落分裂区（相当于植物的分生层，进行分裂的菌层）宽度W和时间T成正比。即：R＝VWT (1)

（一）细菌在平板上的生长 2、后期--从微菌落半径等于琼脂平板厚度起到菌落停止增大为止的时期 。 位于微菌落中部的细胞得不到从底层培养基扩散进入的养料(它们将优先被位于菌落边缘细菌所利用)而停止生长。 设菌落停止生长的中心区半径为R0，则T时的菌落半径Rt为：Rt＝R0＋VWT (2)

（一）细菌在平板上的生长 V从世代时间G计算，V＝ln2/G ＝0.693G 分裂区宽度W值随菌种、时间、菌落数而异，如实验测得大肠杆菌的W值为46μｍ，粪链球菌为25μｍ。同一平板上菌数愈多，形成的微菌落愈小，反之亦然。

（二）真菌的生长 丝状真菌用液体振荡或深层通气法培养时，以菌丝干重为指标，发现与细菌相似的生长规律。 1、延滞期--孢子和菌丝在新的培养环境中需要一个适应过程，接种后出现出延滞期。延滞期的长短与菌的种类、菌龄及环境条件等有关。

（二）真菌的生长 2、迅速生长期--菌丝体干重迅速增加，其立方根与时间呈直线关系。菌丝伸长和分枝速率加快。呼吸强度和代谢速率均达到高峰，产生或不产生酸类等代谢产物。在静止培养时，此期末将在液体表面形成菌膜和分生孢子，振荡或通气搅拌培养时，成为絮状。

（二）真菌的生长 3、衰退期--生长速度减慢和菌丝干重下降。除少数新生菌丝外，多数菌丝细胞质中开始出现较大的空泡和贮存物颗粒，老菌丝开始自溶，多数次生代谢产物(如抗生素等)也在本期内合成。 原因主要是养料的消耗和有害代谢产物(如氨和有机酸等)的积累。在衰退期菌丝自溶程度也取决于菌种特性和培养条件。

（三）噬菌体的增殖 将噬菌体与敏感细菌混合，发生吸附，未吸附的噬菌体以离心法或加抗血清除去； 定时取样，接种在有敏感细菌的平板上，培养，计数光亮、透明的空斑—噬菌班。 以时间为横座标，噬菌斑数为纵座标绘图，所得曲线即为一步生长曲线。

（三）噬菌体的增殖 从噬菌体吸附到出现新的噬菌体的最短时间称潜伏期(或隐蔽期)。此期内，仅见新复制的核酸和新合成的蛋白质，尚未形成噬菌体。 噬菌斑数突然直线上升，新噬菌体大量释出，直至所有感染细胞全部裂解，此为裂解期。 裂解期与潜伏期的噬菌斑数(即细菌数)之比值即为噬菌体的裂解量。完全裂解后，噬菌斑数又趋稳定，曲线变平坦，称稳定期。

第二节 微生物生长的环境条件 生长是微生物与外界环境因子共同作用的结果。 一定限度内环境因子变化会引起形态、生理或遗传特性变化。超过一定限度的环境因子变化，常常导致微生物死亡。 微生物在一定程度上通过自身活动，改变环境条件，以适合于它们的生存和发展。 外界环境条件有最低、最适和最高界限之分。低于最低或高于最高值时，生长受抑或致死。最适条件下，微生物才会快速协调地生长繁殖。

一、 温度 有限的温度范围，具有最低、最适和最高3个临界值。 （一）、温度对微生物的作用：通过影响膜液晶结构、酶和蛋白质的合成与活性及RNA的结构和转录等影响生命活动。

温度对生长速率的影响

（一）温度对微生物的作用 温度升高，蛋白质和酶活性增强，反应加快，生长速率提高；温度敏感的组成成分（如蛋白质、核酸等）可能受到不可逆的破坏。超过最适温度，生长速率随温度升高而迅速下降。 最低和最适之间，生长速率随温度升高而增加，通常以温度系数Q10来表示二者关系，即温度每上升10℃，微生物的生长速率与未升温前的生长速率之比。高温微生物的Q10在2以上，中温约为2，低温在2以下。

（一）温度对微生物的作用 最低温度是生长下限。低温一般不易导致死亡，低温下可较长期地保存生活能力，可低温保藏。 反复冻融会使细胞内的水分变成冰晶，造成细胞明显脱水，此外冰晶往往造成细胞尤其细胞膜的物理损伤，从而导致细胞死亡。 采取快速冷冻，同时在细胞悬液中加入保护剂，则可减少冰冻对细胞的有害效应。快速冷冻形成的冰晶体积小，机械损伤小，保护剂（如甘油、血清、葡萄糖等）可降低脱水的有害作用。

（一）温度对微生物的作用 最适生长温度指生长繁殖速度最快的温度，代时也最短。不等于发酵的最适温度，也不等于积累某一代谢产物的最适温度。 较高温度下，分裂较快，时间不长，易老化。较低温度下，分裂较慢，时间较长，细胞总产量反而较高。发酵速度与代谢产物积累量之间也有类似的关系。

（一）温度对微生物的作用 微生物在最高生长温度下仅有微弱的生长，一旦温度超过此限，将停止其生长并导致死亡。 微生物所能适应的最高生长温度与其细胞内酶的性质有关。

（二）微生物生长温度类型 1、低温型或嗜冷　生长温度范围为-10℃～30℃，最适温度为10℃～20℃。一般分布在高纬度的陆地和海洋中，海洋、中高纬度陆地及冷藏食品上，包括细菌、真菌等许多类群，是造成冷冻食品腐败的主要原因。 低温下保持酶活性和细胞质膜类脂中的不饱和脂肪酸含量较高。

（二）微生物生长温度类型 2、中温型-生长范围10～50℃，最适生长20 ～40℃。 体温型　绝大多数是人或温血动物的寄生或兼性寄生微生物，最适温度35～40℃。 室温型　广泛分布于自然界，种类最多、数量最大的温度类群，最适温度25～30℃。

（二）微生物生长温度类型 3、高温型　生长温度25～80℃，最适生长温度50～60℃，主要分布在自然高温和人工高温环境。具有耐热酶和蛋白质及合成系统，细胞质膜类脂富含饱和脂肪酸和直链脂肪酸，疏水键利于膜结构在高温下保持稳定。在一定温度范围内，改变膜饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例，以保持膜的流动性。 芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属、高温放线菌属、甲烷杆菌属等能在55～70℃中生长。 耐高温微生物，损害食品工业和发酵工业等。

（二）微生物生长温度类型 高温引起核酸、蛋白质(酶)不可逆变性，或者因为含有脂类的质膜结构破坏，透性改变，细胞内含物泄漏引起死亡。 温度愈高，死亡愈快；出发菌数愈多 ，杀死全部微生物需要的时间愈长。 通常将能在10min内杀死微生物的温度称为致死温度。把在一定温度条件下杀死微生物所需的最短时间称为致死时间。

（二）微生物生长温度类型 耐热性：原核生物＞真核生物；非光合生物＞光合生物； 结构简单生物＞结构复杂生物。 大多数细菌、真菌的营养细胞、病毒致死温度55～60℃。放线菌和真菌孢子致死温度为70～80℃。细菌芽孢一般能耐100℃以上，少数类群如嗜热脂肪芽孢杆菌的抗热性很强，80℃能生长，120℃12min死亡。 耐高温：芽孢＞孢子＞营养细胞和菌丝体。

（三）高温灭菌 灭菌：用物理或化学的方法杀死物体上全部微生物的过程；常采用物理方法，如高温、紫外线等。 消毒：用物理或化学的方法杀死物体上大部分微生物(特别是病原微生物)，尚存少数无害微生物；多采用化学方法。 防腐：用物理或化学的方法抑制物体上微生物生长发育的过程。 高温灭菌：干热灭菌和湿热灭菌。

（三）高温灭菌 1、干热灭菌 ①火焰灭菌--直接将微生物烧死。接种针、金属小工具、试管口、三角瓶口等。 ②干热灭菌　以干热空气灭菌，营养体100℃1小时；芽孢160～170℃2h。因此，干热灭菌必须在160℃～17 0 ℃，保持2～3小时。如果处理物品体积较大，传热较差，则需适当延长灭菌时间。纸张、培养皿、玻璃、陶瓷器皿、金属用具等耐高温物品，保持干燥。

（三）高温灭菌 2、湿热灭菌 利用热蒸汽进行灭菌。在相同温度条件下，湿热灭菌效率比干热灭菌高。 2、湿热灭菌 　利用热蒸汽进行灭菌。在相同温度条件下，湿热灭菌效率比干热灭菌高。 ①菌体蛋白易凝固。如卵蛋白含水量50%时，30分钟凝固需50℃；18%，80～90℃；0%，160～170℃。 ②热蒸汽的穿透力强； ③热蒸汽凝结为水时放出潜热，每克水汽在100℃变为水时，放出2253焦耳的热量，从而可提高灭菌温度。

（三）高温灭菌 ①巴氏消毒--62℃～65℃加热30分钟或70℃处理15分钟后迅速冷却，杀死病原菌和一些微生物营养细胞，而且可保持食品的营养与风味。啤酒、黄酒、酱油、醋、牛奶等。 ②煮沸消毒--沸水中约30分钟，杀死芽孢需2～3小时，适用于一般食品、衣物、瓶子等。 ③高压蒸汽灭菌　 1kg／cm， 121℃，20～30min。金属、纤维、玻璃等制品，生理盐水、耐高温培养基、药品及其它物品。关健是排尽冷空气，使灭菌器内只有饱和蒸汽。

（三）高温灭菌 ④、间歇灭菌--蒸锅常压30～60分钟，杀死营养细胞。28～37℃保温过夜，促使芽孢或孢子萌发，再用同样的方法处理。如此反复进行3次，可杀灭所有的营养细胞和芽孢、孢子，达到灭菌的目的。一般适用于有些不宜用高压蒸汽灭菌的物品，如某些糖、明胶及牛奶培养基等。

（四）影响灭菌效果的因素 1、灭菌物品含菌数量--含菌量越高，杀死最后一个微生物细胞所需要的时间就越长。 2、灭菌锅内空气排除程度--预先排尽灭菌锅内的冷空气。 3、灭菌对象的pH-　6.0～8.0，不易死亡；＜6.0，最易引起死亡。 4、灭菌对象的体积— 5、加热与散热速度--

二、水分和渗透压 （一）、水分活度 表示环境中水对微生物生长可给性高低的指标。Aw：即在相同温度和压力条件下，密闭容器中该溶液的水饱和蒸汽压与纯水饱和蒸汽压的比值。  Aw ＝Ｐ/ＰO ＝RH×100 ---Ｐ为溶液或含水物质的蒸汽压 ---ＰO为纯水的蒸汽压 ---RH为空气的相对湿度

二、水分和渗透压 25℃，纯水的水活度为1.00，完全干燥条件下的水活度为0.00。 饱和NａCl（约30%）aw值0.80；饱和蔗糖(20.5％)0.85；饱和甘油(20.4％)0.65。 细菌一般为0.90～0.99，酵母菌和丝状真菌为0.90～0.95。少数类群可在较低aw值环境中生活，嗜盐细菌低至0.75，嗜盐酵母和丝状真菌达0.60。 微生物的aw范围为0.63～0.99。

二、水分和渗透压 （二）、渗透压：微生物细胞通常具有比环境高的渗透压，很容易从环境中吸收水分。除极端的生态条件以外，适合于微生物生长的渗透压范围较广。低渗溶液除能破坏去壁的细胞原生质体的稳定性以外，一般不对微生物的生存带来威胁。高渗环境会使细胞原生质脱水而发生质壁分离，因而能抑制大多数微生物的生长。常用食盐浓度10％～15％，蔗糖50％～70％。少数霉菌和酵母菌能在60％～80%的糖液或蜜饯食品上生长。

三、酸碱度 ｐH1～11，不同种类适应能力各异。大多数细菌最适ｐH值6.5～7.5，适宜4.0～10.0；放线菌多以ｐH值中性至微碱性为宜，最适pH7.0～8.0；真菌一般偏酸，最适ｐH值多为5.0～6.0。细胞内的ｐH值都近于中性，胞内酶的最适ｐH近于中性，胞外酶近于环境ｐH。

三、酸碱度 ｐH值：①影响细胞质膜电荷和养分吸收。如在酸性环境中，乙酸能进入细胞，而在中性或碱性环境中，乙酸离子化，不能进入细胞；②影响酶的活性；③改变环境中养料的可给性或有害物质的毒性。

三、酸碱度 发酵工业ｐH变化可以改变微生物代谢途径并产生不同的代谢产物。如酵母菌在4.5～6.0时发酵蔗糖产生酒精，当大于7.6时则可同时产生酒精、甘油和醋酸。如黑曲霉2.0 ～3.0时发酵蔗糖产生柠檬酸，升至中性时，则产生草酸。

三、酸碱度 微生物代谢反过来改变环境的ｐH值。如分解碳水化合物时产酸，使环境变酸；分解蛋白质时产氨，使环境变碱。在配制培养基时，不仅需要调节ｐH值，有时还要选择适合ｐH值的缓冲液(主要是磷酸缓冲液)，或加入过量碳酸钙等方法来维持微生物生长过程中的ｐH值。强酸和强碱具有很强的杀菌能力，但无机酸因对人和容器的腐蚀性强而很少采用。苯甲酸、乳酸等有机酸常用作防腐剂。石灰常用于卫生消毒。

四、O2和Eｈ值  （一）、氧气对微生物生长的影响：:好氧菌、厌氧菌和兼性厌氧菌。 （二）、Eｈ值与微生物生长：Eｈ值能较全面地反映环境的氧化还原状况。受通气状况或氧分压、氧化／还原物质的比值和ｐH等因素影响。ｐH＝7.0，完全富氧Eｈ值最高，＋0.82V；富氢环境的Eｈ值最低，-0.42V。

四、O2和Eｈ值  为满足厌氧性微生物生长需要在培养基中添加半胱氨酸、硫代乙醇或硫代硫酸钠等还原性物质。需氧菌一般在Eｈ值大于0.1V 生长，0.3～0.4V为适宜。厌氧菌一般要求Eｈ值小于0.1V生长。兼性厌氧菌两种条件均可生长。Eｈ值小于0.1V进行发酵作用，大于0.1V进行呼吸作用。

四、O2和Eｈ值  微生物生命活动反过来影响环境Eｈ值。在Eｈ值高的氧化型环境中，常能观察到由于好氧性微生物的大量繁殖，一方面耗掉了分子氧，另一方面也会因其代谢活动而产生某些还原态中间产物(如半胱氨酸、H2S等)，从而可以造成局部的厌氧环境,为厌氧性微生物的生长创造了条件。

五、辐射 以电磁波的方式通过空间传递的一种能量形式。（一）、可见光：可见光波长为397～800nm，光能自养和光能异养型的唯一或主要能源。非光合性微生物有少数类群，如闪光须霉和水玉霉表现趋光性，其孢囊梗总是向光的，它们的感光区域正处在孢囊之下，可能与孢子形成需要光有关；另一些真菌(如蘑菇和灵芝等)在子实体和色素形成时需要散射光。不同的光合微生物含有不同的光合色素，因而利用和吸收可见光的波段也各不相同。

五、辐射 强烈可见光可引起微生物死亡。是光氧化作用所致。当光线被细胞色素吸收，有氧时，引起一些酶或其它光敏感成分失去活性。在无氧条件下，发生光氧化作用，吸收的光不会造成细胞损伤。 在细胞悬液内，加入少量染色剂，如亚甲基蓝等，经过这些染料处理的细胞，对可见光产生高度敏感性，在可见光下照射几分钟后，即可引起菌体死亡，而在黑暗中它们仍可以继续生长。在低浓度染色剂中可见光对细菌的破坏作用称为光动力作用，其原因是染色剂诱使细胞吸收可见光中某些波长的光线而导致细胞死亡。

五、辐射 （二）、紫外线(UV)：波长136～397nm，非电离辐射。较强杀菌和诱变作用，最强波段265～266nm，是核酸的最大吸收峰波段。 紫外线的主要作用: 使细胞核酸和原生质发生光化学反应，导致相邻的胸腺嘧啶(T)形成二聚体，形成嘧啶水合物和使DNA发生断裂和交联，从而干扰核酸的复制。进而导致微生物的变异和死亡。

五、辐射 紫外线的作用效果也取决于微生物类群、生理状态和照射剂量。一般多倍体、有色细胞、干燥细胞、分生孢子或芽孢比单倍体、无色细胞、湿细胞和营养细胞的抗性要强。紫外线的穿透能力很弱，多用作空气或器皿的表面灭菌及微生物育种的诱变剂。在照射后为避免发生光复活现象，紫外线照射及随之要进行的分离培养工作应在黑暗条件下进行。

五、辐射 （三）、微波：波长1mm～1m，高频变换方向。 1、热效应：使分子极化，高频振荡，摩擦升温，蛋白变性，菌体死亡。 2、非热效应：改变带电粒子组合及电荷分布，诱发遗传物质突变等。

五、辐射 （四）、电离辐射：包括X、γ、α和β射线等。波长短、能量大，能使被照射的物质分子发生电离作用产生自由基，自由基能与细胞内的大分子化合物作用使之变性失活。α射线是带正电的氦核流，有很强的电离作用，但穿透能力很弱。β射线是带负电荷的电子流，穿透力虽大，但电离辐射作用弱。放射性同位素60Cｏ能产生γ射线杀菌，可用于不耐热食品、塑料制品及草炭吸附剂等的灭菌。

电磁辐射的波长和杀菌 作用的关系

六、超声波 振动频率超过20000Hｚ的声波。 通过强烈的振动使细胞破裂，细胞内含物外泄而死亡。破碎效果与处理功率、频率、次数、时间、微生物类型及其生理状态等因素有关。一般球菌的抗性比杆菌强，病毒由于颗粒小结构简单，对超声波也有较强的抗性。芽孢的抗逆性强，几乎不受超声波处理的影响。常用超声波破碎细胞，以分离细胞成分或用于研究。

七、化学杀菌剂和抑菌剂 通过破坏微生物细胞结构或代谢机能而杀死微生物的化学药剂称为杀菌剂；不破坏细胞结构而只干扰新细胞物质合成和微生物生长繁殖的化学药剂称为抑菌剂。

七、化学杀菌剂和抑菌剂 （一）、化学药剂一般规律：多种药剂在高浓度下起杀菌作用，低浓度为抑菌作用，极低浓度时则失去作用甚至表现为刺激作用。实际测定表明化学药剂对微生物的作用取决于药剂浓度、处理时间和微生物对药物的敏感性。C×N×t＝K　　　或logｔ＝logK－LogC×N C药剂浓度;ｔ作用时间;N浓度系数;K常数。 N主要取决于药剂性质和抑菌浓度范围，愈小，则表明该药剂的有效作用浓度范围愈大。K值则反映微生物对药剂敏感性，愈小表示愈敏感。

七、化学杀菌剂和抑菌剂 优良的化学药剂：①作用迅速；②抑菌或杀菌范围广；③对应用对象有较强的穿透能力；④易与水混合并形成稳定的溶液或溶胶；⑤杀菌效力不受应用对象表面有机物质的干扰；⑥不受光、热及其它不良气候条件的影响；⑦不对应用对象产生染色、腐蚀或破坏等有害作用；⑧安全、经济，无异味并易于包装运输等。 作用原理：①破坏细胞结构，如苯酚乙醇等；②干扰细胞的能量代谢，如重金属、CO等；③干扰细胞物质的合成，如磺胺、氨基酸类似物等。

七、化学杀菌剂和抑菌剂 （二）、常用化学杀菌和抑菌剂： 1、酸类； 2、碱类； 3 、盐类； 4 、氧化剂； 5 、其它有机化合物；

七、化学杀菌剂和抑菌剂 1、酸类：无机酸，盐酸、硫酸等；有机酸，苯甲酸及钠盐、酯类，山梨酸及钾盐，丙酸及盐类。 2、碱类：氢氧化钠（钾）、碳酸钠、石灰水等。 3、盐类：一价盐、二价盐、重金属盐等。 4、氧化剂：过氧化氢、高锰酸钾、氯气、次氯酸钙、过氧乙酸、碘等。 5、其它有机化合物：酚类、醇类、醛类、环氧乙烷、表面活性剂、染料物质等。

复习思考题 1.什么叫纯培养?获得微生物纯培养的分离方法有哪几种，各有何特点? 2.测定细胞数量和细胞生物量的方法有哪几种?各方法的测定原理和特点是什么? 3.细菌的群体生长有何规律?生长曲线分为哪几个时期?各时期有何特点?不同生长时期产生 的根本原因是什么?影响细菌代时的因素有哪些?

复习思考题 4.什么叫连续培养?恒化和恒浊培养各有何特点? 5.什么叫同步培养?获得同步培养的方法有哪些?各有何特点? 6.细菌在固体平板上生长有何规律?丝状真菌生长分为哪几个阶段?各阶段有何特点?

复习思考题 7.什么叫噬菌体的一步生长曲线?该曲线能提供哪些信息? 8.微生物生长的环境条件主要包括哪些因素?温度对微生物生长有何影响?按照微生物对温度 的适应能力可将微生物分为哪几种类型?各自分布及生理有何特点?

复习思考题 9.高温灭菌分为哪几种类型?具体方法有哪几种?各有何特点? 10.影响灭菌效果的因素有哪些?如何才能保证灭菌彻底? 11.水分、渗透压、酸度、氧气、辐射及超声波对微生物生长有何影响?如何利用这些因素保进有益微生物生长,控制有害微生物?

复习思考题 12.化学杀菌剂分为哪些类型?其作用机理如何?各有何优缺点?如何使用?