第四章 设备和管道的清洗与灭菌 生物工程教研室 刘金锋
为什么设备、管道的彻底清洗和灭菌是十分必要的 降低潜在污染危险 保证产品质量 生产效率和收率下降 妨碍产物的分离纯化 FDA及GMP认证的需要 为什么设备、管道的彻底清洗和灭菌是十分必要的 ？ FDA，U.S. Food and Drug Administration “GMP”是英文Good Manufacturing Practice 的缩写，中文的意思是「良好作业规范」，或是「优良制造标准」，是一种特别注重制造过程中产品质量与卫生安全的自主性管理制度。它是一套适用于制药、食品等行业的强制性标准，要求企业从原料、人员、设施设备、生产过程、包装运输、质量控制等方面按国家有关法规达到卫生质量要求，形成一套可操作的作业规范帮助企业改善企业卫生环境，及时发现生产过程中存在的问题，加以改善。
设备管道的清洗与灭菌是工业生产和实验室研究的的基础性工作，也是提高产品质量的最关键的技术措施。 清洗灭菌的目的就是要尽可能地清除生产过程中管道和设备内部的污物。消除腐败微生物对生物工业生产和实验研究的威胁。
本章内容 常用的清洗方法及设备 设备及管路的灭菌 无菌检查及染菌处理
第一节 常用清洗方法及设备 一、生物工业常用清洗剂 二、设备、管路、阀门等清洗 三、CIP清洗系统及设备 四、清洁程度的确认
一、生物工业常用清洗剂 清洗剂 消毒杀生剂 特殊清洁剂
清洗剂：溶解或分解有机物，分散固形物，漂洗、多价螯合作用，无毒、无害，具有一定的杀菌作用。 生活清洗剂、工业清洗剂 表4-1 主要清洗机的性能
清洗方法 清洗过程中没有新物质生成， 主要包括借助机械力、超声波等。 在清洗中有新物质生成， 主要包括酸碱反应、 还原反应及微生物等。 物理法 化学法 清洗过程中没有新物质生成， 主要包括借助机械力、超声波等。 在清洗中有新物质生成， 主要包括酸碱反应、 还原反应及微生物等。
（二）消毒杀生剂 当设备或管道不能耐高温时，使用化学消毒法。 化学杀生剂：用于控制或杀灭水中细菌、藻类和真菌等微生物的一类试剂。 种类：氧化性杀生剂、非氧化性杀生剂。
1、氧化性杀生剂 溴基杀生剂： 二氧化氯：高效、安全 过氧化物、臭氧 氯基杀生剂：次氯酸钠、氯代异氰尿酸 过氧化物包括金属过氧化物、过氧化氢、过氧酸盐和有机过氧化物。 1 异噻唑啉酮。是一类衍生物的通称，Rohmand Hass公司对其进行广泛的研究，申请了一些专利。它的常用组份为2-甲基-4-异喧唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮，商品异噻唑啉酮是两者1：3的混合物。其杀菌性能具有广谱性，同时对粘泥也有杀灭作用。在低浓度下有效，一般有效浓度在0.5mg／L，就能很好地控制细菌的生长。混溶性好，能与氯、缓蚀剂、阻垢分散剂和大多数阴离子、阳离子和非离子表面活性剂等相容。对环境无害，该药剂在水溶液中降解速度快。 对pH值适用范围广，一般pH值在5.5～9.5均能适用。同时具有投药间隔时间长，不起泡等优点。80年代中后期我国也有多家单位研制出类似国外的同类产品，并投人生产。在循环冷却水中的应用日益广泛。 2 戊二醛是另一种非氧化性杀菌剂。国内已开始使用，其特点是几乎无毒，使用pH范围宽，耐较高温度，是杀硫酸盐还原菌的特效药剂，本身可以生物降解，其缺点是与氨、胺类化合物发生反应而失去活性，因此在漏氨严重的化肥厂不宜使用。戊二醛价格昂贵使其应用受阻。目前正在开展复配降低其用量的研究。LawrenceA.Grab等人的研究表明，戊二醛和季铵盐复配可大幅度降低成二醛的用量。 3 季铵盐。除具有广谱、高效的杀菌性能外。还有对菌藻污泥的剥离作用。早期的季铰盐以烷基二甲基苄基氯化铵为代表。目前国内冷却 水系统广泛使用的洁尔灭和新洁尔灭均属于此类产品。随着时间的推移和技术进步。该类季铰盐不足之处也逐步显现出来。主要表现在药剂持续时间短、细菌易于对其产生抗药性。使用剂量大（100mg／L以上）。费用高，且使用时泡沫多。不易清除等缺点。为了克服上述缺点，国外又先后开发出了有代表性的一些季铵盐新品种，如双烷基季铵盐。双季铰盐、聚季铵盐等。双烷基季铰盐以双烷基二甲基氯化铵为代表，其中双烷基链长为C8～C12的产品，具有优良的抗菌性，该产品具有投药浓度低、药效持续时间长、灭菌效果好、泡沫少、合成工艺简单、成本低等优点。 另外，据报道双烷基季铵盐与烷基二甲基苄基氯化铵复配可大幅度提高它们的杀菌性能。这类产品在国内已有初步的生产和应用。DiZ等人[11]于1994年报道的化合物，带有双季铰盐的结构，它具有高效、广谱的抗菌性。水溶性的聚季铵盐用作杀菌剂在水处理、油田开采。食品及包装材料等领域已经有所应用。近年来的资料表明，人们对聚季铵盐的研究已由早期的制作水溶性聚合物转向制作不溶性聚合物方向发展，以改善杀菌剂的性能，降低它对环境、人畜的毒害。一般通过将季铵盐聚合，或将其固定在高分子载体上制成水不溶性聚合物杀菌剂。如以聚苯乙烯或交联聚苯乙烯的氯甲基化物等为载体进行季铵化，所得到的 聚季铵盐水不溶性聚合物，当初始菌悬液细菌数约为5×108个／L的水，以10～12mL／min的流速流经聚合物树脂床时细菌存活率为0％～1％。该树脂失活后，可再生使用，具有长效性。可以预计这类聚合物在冷却水处理领域具有广阔的应用前景。 4 季磷盐。杀生剂研究的最新进展之一是季磷盐的出现。这类化合物与季铵盐有着相似的结构，只是用磷阳离子代替氮阳离子。例如 THPS（四羟烷基硫酸磷）、THPC（四羟烷基氯化磷）。THPS用作杀生剂，迄今虽对其各种性能参数的认识并不全面，但它用于工业水处理及油田水处理确实具有高效。快速、广谱，对环境、鱼类具有低毒，易生物降解和使用方便等优点。有研究表明，用于工业水处理，使用50μg/g THPS，在6h内能将2.5×105SRB／mL杀灭到2.7×103SRB／mL。早期的季磷盐主要带有三苯基膦的结构，已初步显示出好的抗菌性 。 如1987年Pernak等报道的ph3P+CH2ORCl-，式中Ph为苯基，当式中R为碳数11的烷基链时，则有最佳的抗菌活性。Akihiko。等研究的带有单、双长烷基链的季磷盐具有更佳的抗菌活性。国内于90年代初开始由石化企业弓l进使用该类产品。1992年石化科学研究院开发出了类似于国外B～350（十四烷基三了基氯化磷）的季磷盐产品，并已在循环冷却水系统中推广使用。 5 其它种类的非氧化性杀生剂。目前市场上常见的非氧化性杀生剂还有氯酚类、有机锡化合物、有机硫化合物（异唑啉酮前已述）、铜盐等。氯酚类杀生剂国内生产的有以双氯酚（2，2’——二羟基—5，5’——二氯苯甲烷）为主的复合杀生剂。该类杀生剂由于其毒性大，易污染环境水体，故近年来已逐渐被淘汰。有机锡化合物在碱性州值范围内的效果最好。它们常与季铵盐或有机胺类复配成复合杀生剂以改善其分散性。实践证明，这类复合杀生剂还有增效作用。该类杀生剂目前国内没有生产。有机硫化合物类杀生剂中目前国内使用较普遍的有二硫氰基甲烷、大蒜素（硫酮类化合物）。许多有机硫化合物杀生剂对于真菌、粘泥形成菌，尤其是硫酸盐还原菌十分有效。
2、非氧化性杀生剂 有机硫化合物：异噻唑啉酮 季铵盐类： 戊二醛 唑啉酮是通过断开细菌和藻类蛋白质的键而起杀生作用的。异噻唑啉酮微生物接触后，能迅速地不可逆地抑制其生长，从而导致微生物细胞的死亡，故对常见细菌、真菌、藻类等具有很强的抑制和杀灭作用。杀生效率高，降解性好，具有不产生残留、操作安全、配伍性好、稳定性强、使用成本低等特点。能与氯及大多数阴、阳离子及非离子表面活性剂相混溶。高剂量时，异噻唑啉酮对生物粘泥剥离有显著效果。 异噻唑啉酮衍生物的杀菌机理主要有三种：①阻碍菌体的呼吸作用。绝大多数微生物是靠呼吸作用进行新陈代谢，含有蛋白质硫醇的酶在呼吸作用中起关键作用。异噻唑啉酮一经加入，在极短的时间内便可迅速进入微生物细胞，并与蛋白质硫醇发生作用从而破坏酶。由于酶被破坏，细胞的呼吸作用立即受到抑制，于是细胞的生长马上停止。同时，异噻唑啉酮与蛋白质硫醇反应还可导致细胞内生成极具反应活性的游离基，这些游离基进一步破坏细胞，使其失去自身修复的功能，最终导致微生物死亡。②破坏细胞壁。杀菌剂能融化细胞壁，破坏了内外环境的平衡，导致细菌死亡。③异噻唑啉酮的活性基团可以与核酸上的碱基反应，阻碍核酸的形成，破坏菌体的生长和繁殖。
3、特殊清洁剂 色谱柱：6mol/l 尿素、氯化胍 树脂的处理
二、设备、管路、阀门等清洗 缺点: 传统方法：将设备拆卸下来用人工或半机械法清洗。 费时、费力, 易损坏联接件; 设备停机时间长, 设备利用率低; 清洗不彻底, 有时对操作者也不十分安全。
二、设备、管路、阀门等清洗 CIP清洗系统（clean in place）也叫在位清洗或原地清洗 定义：不拆卸设备或元件, 在密闭的条件下, 用一定温度和浓度的清洗液对清洗装置加以强力作用, 使与食品接触的表面洗净和杀菌的方法。 劳动强度、清洗时间、卫生质量
二、设备、管路、阀门等清洗 CIP清洗系统（clean in place）也叫在位清洗或原地清洗 HACCP（Hazard Analysis and Critical Control Point ), GMP - Good Manufacturing Practice SOP-Standard Operation Procedure，即标准作业程序，就是将某一事件的标准操作步骤和要求以统一的格式描述出来，用来指导和规范日常的工作。 劳动强度、清洗时间、卫生质量
CIP 的优点： 能维持一定的清洗效果, 保证产品的安全性。 节约操作时间、提高效率 节省劳动力, 保证操作的安全性。 节省清洗用水和蒸汽。
1、管件、阀门清洗 操作程序：清水→洗涤剂→清水→杀菌剂→去离子水（表4-4） 注意事项：流速（1.5m/m）、时间（＜20min）、温度（ ＜ 75℃）
2、罐的清洗 1、清洗的机理
2、罐的清洗 2、影响清洗效果的因素 污物与金属表面吸附能力的大小 污物的特点：新、旧 冲刷强度 清洗剂的类型、活性及浓度 温度
3、清洗方法及其对罐清洗效果的影响 小型罐：清洗剂浸泡 大型罐：灌顶喷洒清洗剂；原地清洗（CIP） 球型静止喷洒器： 旋转式喷洒器 结构简单、设备费用低，但喷射压力低。 旋转式喷洒器 1800自由旋转，较低的喷射流速达到较大的喷射半径 操作稳定性不好 ；不能自我清洗；投资大
4、发酵罐清洗应注意的事项 大型发酵罐的清洗以冷清洗为宜（＜40℃） 清洗液回流泵的流速应比清洗泵高约25% 含氯的清洗剂和灭菌剂都能对不锈钢产生侵蚀 CIP系统需要打开取样阀，使清洗液通过取样阀 安装固定洗球时，洗球的最下部留一个小孔；旋转喷射型洗涤器应能自动监视自转情况 清洗剂、灭菌剂的温度和浓度等参数 大罐清洗宜简化程序：清洗和灭菌一次完成；免冲洗杀菌剂 彻底的微生物检查、防止感染细菌
（三）生物加工下游过程设备的清洗 碟片式离心机、超滤系统、色谱柱
（四）辅助设备的清洗 换热器的清洗 空气过滤器的清洗
三、CIP清洗系统及设备 CIP的历史： CIP 系统最初于五十年代在美国的乳品工业得到应用, 1955 年CIP 系统与自动控制技术相结合,使其在食品工业的其它领域得以应用。 同一装置中同时进行清洗-灭菌，完全自动化、经济效率高
CIP装置的分类： 根据清洗液的使用方式分为： 清洗剂单次使用的CIP系统 (single-use CIP systems ) (reuse CIP systems ) 清洗剂多次使用的CIP系统 (multi-use CIP systems
洗涤剂一次性使用的CIP系统 1-过滤器 2-循环泵 3-喷射器 4-蒸汽进口 5-排污阀 6-洗涤剂贮罐 预洗、碱洗、水洗和灭菌
CIP清洗系统及设备 洗涤剂多次利用的CIP系统 1-过滤器 2-循环泵 3-喷射器 4-混合加热器 5-洗涤剂罐 6-回收水贮罐
洗涤剂重复利用的CIP系统 1-过滤器 2-循环泵 3-新鲜洗涤剂贮罐 4-回收洗涤剂 5-热水罐 6-回收水贮罐
三、CIP清洗系统及设备 一次性CIP系统 重复使用的CIP系统 同一装置中同时进行清洗-灭菌，完全自动化、经济效率高
清洗发酵罐常用的方法 按采用的清洗剂种类：酸性清洗、碱性清洗 按清洗操作温度：冷清洗、热清洗（表4-6、4-7）： 预洗、主洗、中间清洗、杀菌、终洗 回收水、清洗剂（酸性/碱性）、清水、杀菌剂、无菌水
四、清洁程度的确认 清洁程度的检验 简易定性评价洁净度的方法：擦拭法、水滴法、水雾法、呼气法、肉眼观察法 易污染最严重的部位为标准 三次试验，要求设备处于正常的状态 局部表面测定结果不代表整体污垢和清洁程度 简易定性评价洁净度的方法：擦拭法、水滴法、水雾法、呼气法、肉眼观察法 定量的检验：蛋白含量、残留细胞（ATP荧光法）
第二节 设备及管路的灭菌 一、发酵罐及容器的灭菌 使用前必须经耐压、气密性实验 消除罐内死角，确保下一批发酵的成功 杀灭与罐直接相通的各管路、阀门的微生物 杀灭上批发酵的活的微生物，减轻环境污染
发酵罐示意图
2、步骤： （热蒸汽法） 1）先彻底清洗 作用：a）有利于消除死角 b）免物料受热（尤其是干热的部位）干 焦于罐体、管或阀门 灭菌过程： 1）先彻底清洗 作用：a）有利于消除死角 b）免物料受热（尤其是干热的部位）干 焦于罐体、管或阀门 2）从底部通入蒸汽 3）排冷气 4）升压 打开各个需灭菌的管路、放气阀等（如 接种管、取样管、空气进管、流量计等）
或自然冷却，或泵循环水加速冷却；通无菌空气 5）保压 通常0.174MPa, 30-45 min 6) 降温 关闭各放气阀，切断汽源，慢慢放气； 或自然冷却，或泵循环水加速冷却；通无菌空气 Notes: 确保无死角产生
二、空气过滤器的灭菌 排除过滤器中的空气，从过滤器上部通入蒸汽，并从上、下排气口排气，维持压力约0.174MPa，灭菌2h，灭菌完毕通入压缩空气。
三、管道和阀门的灭菌 管道和阀门的彻底灭菌是确保生物工程生产高效率的重要一环。 所选择的阀门均应利于清洗、维护和灭菌。 隔膜阀：管径范围大、可在线维修、仅有阀体和隔膜与物流接触。
保证管道彻底灭菌的设计要求： 管道应有一定的斜度，通常取1/100或更大； 管路有足够的支撑点；凹陷低点安装排污阀； 尽可能减少和简化管路，少用弯头管件和阀门； 尽可能减少最高与最低点，且在每个最高点装设蒸汽进管，在最低点均装冷水阀； 每个罐及管道尽可能分开灭菌。这样才能保证蒸汽杀菌的严密性与稳定安全性。
隔膜阀进行灭菌3种形式 蒸汽直接进入阀门 利用阀门上的小阀 确保阀门接管的盲端管长与管径之比小于6（易出现死角）
管路系统在设计安装时，应具有一定的斜度（1：100）； 较长的管路，尽量减少管路并简化，弯头、阀门等尽可能少；
灭菌技术好坏与灭菌质量相关 蒸汽通入培养基，升温快慢、保温时间——产生过多泡沫 培养基和水的传热系数比空气的传热系数大，如果灭菌时升温太快，培养基急剧膨胀，发酵罐内的空气排出较慢，就会产生大量泡沫，泡沫上升到发酵罐顶，泡沫中的耐热菌就不能与蒸汽直接接触，未被杀死。 防止方法：缓慢开启蒸汽阀门，或加入消泡剂 蒸汽总压是否达到要求标准 杂菌数量：季节、原材料储存和保管 设备的清洗质量、有无灭菌的死角
培养基灭菌不彻底原因 蒸气压力或蒸气量不足、灭菌时间不够； 灭菌时培养基产泡沫或罐内有污垢堆积、或基质中有不溶解的固体颗粒； 蒸汽短路 原料性状： 假压的形成； 参数不稳定（连续灭菌）； 设备死角(下图) ；
生产上常把不能彻底灭菌的部位称为“死角” 不锈钢衬里破裂造成“死角”
罐底的加强板 发酵罐罐底脓疱状积垢
压力表安装不合理形成“死角” 1,6—发酵罐；2—缓冲管；3,4—压力表；5—旋塞
管路死角 种子罐放料管的死角 管道连接的死角（螺纹、法兰、焊接） 排气管的死角
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法
a—垫圈内径过小；b—垫圈内径过大；c—法兰不平造成的泄漏与“死角” 法兰的“死角” a—垫圈内径过小；b—垫圈内径过大；c—法兰不平造成的泄漏与“死角”
消灭死角 减少挡板和开孔； 焊接光滑； 法兰、阀门连接正好； 减少残渣沉积； 严格清洗和检查；
多个罐在使用前应该分段进行灭菌，应该考虑满足灭菌要求、减少死角，并确保无菌状态（4-10）； 对于蒸汽达不到的死角，要装设于大气相同的旁路（排气口）； 接种、取样、补料等管道要配置单独的灭菌系统。
四、灭菌的检验及可能出现的问题 （一）灭菌的检验 直接微生物培养 灭菌蒸汽的温度和压强监控法
（二）蒸汽灭菌可能出现的问题及对策 设备和管道未达到设定的温度（129℃）； 发酵过程中发现杂菌感染。
蒸气灭菌是否正常？ 上批发酵放罐间隔？ 气密性检测 重点检查阀门的隔膜、阀座、所有O型密封圈
染菌（contamination）检查与处理
一、种子培养和发酵的异常现象 发酵过程中的种子培养和发酵的异常现象是指发酵过程中的某些物理参数、化学参数或生物参数发生与原有规律不同的改变，这些改变必然影响发酵水平，使生产蒙受损失。
⒈ 种子培养异常 菌体生长缓慢 菌丝结团 代谢不正常 ⒉ 发酵异常 菌体生长差 pH值过高或过低 溶氧水平异常 泡沫过多 菌体浓度过高或过低 谷氨酸发酵时正常和异常的溶氧曲线
二、染菌的检查和判断 发酵过程是否染菌应以无菌试验的结果为依据进行判断。 ⒈ 显微镜检查法(镜检法) ⒉ 肉汤培养法 ⒊ 平板划线培养或斜面培养检查法
四环素的发酵过程最怕污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌；柠檬酸的发酵最怕青霉菌的污染；谷氨酸发酵最怕噬菌体污染 三、发酵染菌原因分析 造成发酵染菌的原因有很多，且常因工厂不同而有所不同，但设备渗漏、空气净化达不到要求、种子带菌、培养基灭菌不彻底和技术管理不善等是造成各厂污染杂菌的普遍原因。 ㈠ 染菌的杂菌种类分析 四环素的发酵过程最怕污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌；柠檬酸的发酵最怕青霉菌的污染；谷氨酸发酵最怕噬菌体污染 双球菌 梭状芽孢杆菌
㈡ 发酵染菌的规模分析 ① 大批量发酵罐染菌 ② 部分发酵罐染菌 ③ 个别发酵罐连续染菌 ㈢ 不同污染时间分析 ① 染菌发生在种子培养阶段，或称种子培养基染菌 ② 在发酵过程的初始阶段发生染菌，或称发酵前期染菌 ③ 发酵后期染菌
杂菌污染防治 一、种子带菌及其防治 种子带菌的原因 生产上的一些措施： ① 严格控制无菌室的污染，根据生产工艺的要求和特点，建立相应的无菌室，交替使用各种灭菌手段对无菌室进行处理 ② 在制备种子时对沙土管、斜面、三角瓶及摇瓶均严格进行管理，防止杂菌的进入而受到污染
③ 对每一级种子的培养物均应进行严格的无菌检查，确保任何一级种子均未受杂菌感染后才能使用 ④ 对菌种培养基或器具进行严格的灭菌处理，保证在利用灭菌锅进行灭菌前，先完全排除锅内的空气，以免造成假压，使灭菌的温度达不到预定值，造成灭菌不彻底而使种子染菌
二、空气带菌及其防治 要杜绝无菌空气带菌，就必须从空气的净化工艺和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统
三、操作失误导致染菌及其防治 淀粉质原料容易结块 “夹生” 搅拌混合或加入一定量的α-淀粉酶或罐外预先配料混均 灭菌时压力表显示“假压” 打开排气阀门及有关联接管的边阀、压力表接管边阀等排汽 培养基灭菌中产生泡沫 添加消泡剂 工人操作不当 加强技术培训和责任心教育
四、设备渗漏或“死角”造成的染菌及其防治 设备渗漏主要是指发酵罐、补糖罐、冷却盘管、管道阀门等，由于化学腐蚀(发酵代谢所产生的有机酸等发生腐蚀作用)、电化学腐蚀(如氧溶解于水，使金属不断失去电子，加快腐蚀作用)、磨蚀(如金属与原料中的泥沙之间磨损)、加工制作不良等原因形成微小漏孔后发生渗漏染菌。
生产上常把不能彻底灭菌的部位称为“死角” 罐底的加强板 发酵罐罐底脓疱状积垢
不锈钢衬里破裂造成“死角”
管道连接的死角 截止阀
阀门试漏的方法
隔膜阀 隔膜阀适用于移种、打料管道。 这些管道上若装置截止阀， 如渗漏或关闭不严，易发生染菌事故。
管路的连接 螺纹连接
法兰连接
a—垫圈内径过小；b—垫圈内径过大；c—法兰不平造成的泄漏与“死角” 法兰的“死角” a—垫圈内径过小；b—垫圈内径过大；c—法兰不平造成的泄漏与“死角”
五、噬菌体污染及其防治 利用细菌或放线菌进行的发酵生产容易受噬菌体的污染，由于噬菌体的感染力非常强，传播蔓延迅速，且较难防治，对发酵生产有很大威胁。 温和噬菌体（temperate phage）侵染菌体后由于具有溶源性，相对于烈性噬菌体（virulent phage）更加地隐蔽、危害更大。
环境污染噬菌体是造成噬菌体感染的主要根源。 防治噬菌体染菌的方法具体归纳以下几点： ① 严禁活菌体排放，切断噬菌体的“根源”； ② 做好环境卫生，消灭噬菌体与杂菌； ③ 严防噬菌体与杂菌进入种子罐或发酵罐内； ④ 抑制罐内噬菌体的生长。
生产中一旦污染噬菌体，可采取下列措施加以挽救： ⑴ 并罐法 ⑵ 轮换使用菌种或使用抗性菌株 ⑶ 放罐重消法 ⑷ 罐内灭噬菌体法
六、杂菌污染的挽救与处理 ⑴ 种子培养期染菌的处理 ⑵ 发酵前期染菌的处理 ⑶ 发酵中、后期染菌处理 ⑷ 染菌后对设备的处理
染菌的检查与判断 培养基 （1）细菌培养基 营养肉汤：glucose 10 g, peptone 5 g, beef extract 5 g, NaCl 5 g, distilled water 1000 ml, pH 7.2~7.4。 酚红肉汤：营养肉汤+1% phenol red 3 ml。 营养琼脂：glucose 5 g, peptone 10 g, beef extract 3 g, NaCl 5 g, agar 15~20 g, distilled water 1000 ml, pH 7.2~7.4。
（2）酵母培养基 萨氏培养基（Sabouraud’s agar）：glucose 40 g, peptone 10 g, agar 15~20 g, distilled water 1000 ml, pH 5.6。 （3）霉菌培养基 察氏培养基（Czapek’s agar）：sucrose 30 g, NaNO3 3g, K2HPO4 1 g, MgSO47H2O 0.5 g, KCl 0.5 g, agar 15~20 g, distilled water 1000 ml, pH 6.6。
无菌检查的流程： 取样 接入试管或斜面 培养（细菌32~37℃，1~2天；真菌25~28℃，1~3天） 肉眼检查 镜检
二、通过异常现象判断 溶解氧水平异常变化显示染菌 污染噬菌体 溶氧浓度 正常发酵 溶氧浓度 正常发酵 发酵时间 污染非好气性杂菌 污染好气性杂菌
二、通过异常现象判断 排气中CO2异常变化显示染菌 工艺一定，尾气中CO2量变化有一定规律 污染杂菌，糖耗加快，尾气中CO2量增加
二、通过异常现象判断 温度、pH、发酵液状态、气味
第二节染菌原因的分析 种子系统 空气带菌 设备渗漏 培养基灭菌不彻底 操作失误
从染菌规模分析 个别罐批 空气净化系统、 种子染菌、接种管道渗漏 培养基灭菌不彻底或操作失误 大规模 部分罐批 某一批号种子染菌、 某一套连消系统染菌、 补料管路渗漏或补料液带菌 培养基灭菌不彻底或操作失误
从染菌时间分析 2 3 1 培养基灭菌不彻底，加消沫剂、补料系统灭菌不彻底或渗漏，发酵设备渗漏 泡沫顶罐 . 3 空气系统有问题 . 1 培养基灭菌不彻底；种子带菌；接种管道灭菌不彻底或接种操作不当 中期染菌 早期染菌 后期染菌
从染菌的菌型分析 酵母菌：种子室、摇瓶间、计量罐、进料补料阀门、搅拌轴封、被倒流的空气介质 霉菌：种子室、摇瓶间、搅拌轴封、被倒流的空气介质、空气 普通杆菌：空气过滤介质、冷水设备渗漏、设备死角渗漏 芽孢杆菌：培养基灭菌不彻底、设备有死角 球菌：空气系统、无菌间摇瓶间空气中
第三节染菌的防治措施 一、一般染菌的防治 预防种子带菌： 环境清洁， 无菌操作设备完好、可靠， 无菌操作用品灭菌彻底， 操作熟练， 制度严格。
消灭培养基染菌： 严格物料采购、运输、仓贮 一、一般染菌的防治 配料（防止块状物料、清洗配料罐） 灭菌（保证蒸汽的压力、稳定及畅通、按操作规程操作） 保压 （防治培养基倒流）
一、一般染菌的防治 严防空气带菌： 提高空气进口的洁净度 除尽压缩空气中的油和水 空气过滤器灭菌时防止被冲翻 保证空气过滤器介质的填装质量
一、一般染菌的防治 杜绝设备污染： 良好的设计（无死角） 规范的安装 彻底的清洗 严密的维修 有效的灭菌。
染菌罐的处理 种子罐染菌 灭菌后放下水道 并对种子罐、管道进行检查和灭菌 启用备用罐或倒种
染菌罐的处理 发酵灌染菌 前期： 危害大的 灭菌后放下水道 危害不大，可重新灭菌，重新接种 中后期： 降低培养温度，降低通风 提前放罐 控制补料量
二、噬菌体污染的防治 噬菌体污染的鉴别 现象鉴别： 发酵液变稀、发粘，DO，泡沫。 平板鉴别： 观察噬菌斑。
污染的预防 选育抗噬菌体菌株； 环境、明沟、下水道定期消毒； 排气过滤，菌体排放前灭菌； 选用孔径为0.01 m的微滤膜空气过滤器； 发酵车间远离农田、排污明渠、污水处 培养基中加入适量化学消毒剂： 三聚磷酸钠 0.2%~0.3%， 植酸0.1%~0.2%，柠檬酸0.2%~0.5%， 草酸0.2%~0.5%， 新洁而灭0.02%~0.05。
污染后的处理 停产大消毒（用漂白粉、次氯酸钠、甲醛等对厂房和设备的所有角落进行大消毒）。 更换菌种或转产其他产品。