第三章：光与生物样品的相互作用 主讲教师： 钱 骏 副教授 主讲教师： 钱 骏 副教授 Email: qianjun@zju.edu.cn Tel: 0571-88206516-215/13505815872/ 636278 Homepage： http://mypage.zju.edu.cn/qianjun

光与生物样品（细胞、组织）的相互作用 光与生物样品的相互作用 吸收：光强随着光在生物样品中的传播距离的增加而不断减小 光致发光：荧光、磷光 吸收：光强随着光在生物样品中的传播距离的增加而不断减小 光致发热 光与生物样品的相互作用 光化学效应：光蚀除、光诱导、光致活性氧 光声效应 弹性散射：瑞利散射、米散射、反射/折射 散射：由于折射率的不均匀造成的光子传播方向的改变 非弹性散射：拉曼散射、多普勒频移 部分非线性光学效应：二/三次谐波产生、四波混频等

提纲： 3.1 生物样品对光的吸收效应 3.2 生物样品对光的散射效应 3.3 生物样品发光效应

3.1 生物样品对光的吸收效应 生物样品对光的吸收: 光在通过生物样品时由于部分光能转换成电子、分子的某种运动或热运动从而导致光强度的衰减。 一般吸收： 对一定光谱范围内的所有波长的光的衰减程 度相同或相似 选择性吸收：只对某些特定波长的光有吸收或吸收比较强 比如：角膜和晶状体在可见光波段近似于透明体， 但在红外波段表现出强烈的吸收

吸收系数和吸收截面 吸收截面：被吸收的光功率Pabs与入射光强I0之比 吸收系数：在单位程长上一个光子被吸收的概率 （具有面积的量纲） 假设某一局部的光子辐射能流率为H（单位：光子/cm2*s），均匀分布的吸收粒子的能流密度为 （单位：cm-3），则单位时间，单位体积内被吸收的光子数目为 （单位：光子/cm3） 。定义 吸收系数 比如：在可见光波段内，水的吸收系数均小于0.026cm-1

比尔-朗伯定理： 朗伯定律 吸收系数 对于厚度无限薄的吸收层dl，某一波长辐射能的减少由下式给出： 式中， 为摩尔吸光系数或摩尔消光系数（mM-1*cm-1），物质特有属性； C为摩尔浓度（mM），l为光程。 设入射到吸收层的初始光强为I0，测量得到的传输光强为I，则： 吸收系数 朗伯定律 令：

比尔-朗伯定理 光密度（optical density）OD=lg(I0/I)， 即： 式中 称为消光系数，是吸收物质在特定波长处的特性，不随吸收物质的浓度和光程长度的变化而改变 比尔-朗伯定理是比色法和分光（吸收）光度法所依据的基本定律

对于n个吸收物质 测定混合物中各吸收物质含量的定量方法的理论基础 对于组织中的n种成分，如water，lipid，HbO，Hb，已知它们的消光光谱 在已知光程的情况下，通过测试不同波长的入射出射光强， 则能得到不同成分的浓度C

分子吸收种类： 对于自由原子（原子间的相互作用可以忽略）： 生物组织的基本单元是细胞 细胞由生物分子组成的 分子由碳、氢、氧、氮、磷等原子组成，各个原子之间以化学键 相连而组成分子。 对于自由原子（原子间的相互作用可以忽略）： 跃迁的形式：原子外层电子发生从基态到高能级的跃迁。 跃迁的种类：Electronic transitions 跃迁的条件：吸收（光）能量，可以是 UV, visible, NIR light

对于分子： 分子的能级取决于分子的运动和状态 分子的运动 电子相对于原子核的运动-电子态间的跃迁 原子核间的相对振动-振动能级间的跃迁 非自由原子靠化学键聚在一起组成分子，因此分子对光子的吸收与单个原子的吸收相比要复杂得多 分子的能级取决于分子的运动和状态 电子相对于原子核的运动-电子态间的跃迁 分子的运动 原子核间的相对振动-振动能级间的跃迁 分子的转动-转动能级间的跃迁

（1）电子相对原子核的运动及吸收 分子中与吸收光谱有关的三种价电子是： 构成单键 （如C-C、C-H）的 电子 未共享成键的n电子 牢固程度： 键> 键 分子在吸收光辐射能量后可以产生电子态间的跃迁，此时电子由一个低能级的轨道（即成键轨道）跃迁到高能级轨道（称为反键轨道，用上标*表示）, 分子也由基态变成为激发态。 跃迁需要的能量最高，一般该吸收发生在真空紫外区，例如C-H的电子跃迁发生在100-150 nm。 跃迁需要的能量稍低于 跃迁，吸收峰一般发生在近紫外区，例如C=O的吸收发生在小于200 nm的光波段 跃迁需要的能量较低，吸收峰一般位于近紫外和可见光区 总的来说，电子态之间的跃迁所引起的吸收出现在可见光、紫外或波长更短的光谱区

（2）分子的振动及吸收 分子从一个振动态变化到另一个振动态移动时造成的能量的变化 伸展振动：原子沿着键价方向来回运动 分子的振动 弯曲振动：原子在垂直于键价方向运动 高频区 伸展振动能量>弯曲振动能量 低频区 引起振动跃迁的能量通常对应在红外区域

振动吸收峰的种类： 基频吸收（很强）：分子吸收红外辐射后，由基态振动能级(ν=0)跃迁至第一振动激发态(ν =1)时，所产生的吸收峰称为基频峰。 倍频吸收（较弱）：振动能级由基态(ν=0)跃迁至第二振动激发态(ν=2)、第三振动激发态(ν=3)，所产生的吸收峰称为倍频峰。由ν=0跃迁至ν=2时，△ν=2，即吸收的红外线谱线是分子振动频率的二倍，产生的吸收峰称为二倍频峰。 合频/差频吸收（较弱）：此外，还有合频峰(ν1+ν2，2ν1+ν2等)，差频峰(ν1-ν2，2ν1-ν2等)，这些峰多数很弱，一般不容易辨认。 倍频峰、合频峰和差频峰统称为泛频峰。

（3）分子的转动及吸收 分子的转动是指分子绕质心进行的运动，转动能级代表分子处于不同转动状态时所具有的能量 转动吸收所需要的能量低于实现振动能级跃迁所需要的能量，通常其吸收谱位于红外区。转动吸收是在振动吸收的基础上所产生的附加的精细结构。 红外光谱区所测得的吸收表现了分子的振动与转动吸收的加和，因此红外光谱也被称为分子光谱或振动光谱。当分子结构稍有不同时，红外吸收光谱就有细微的差异，并显示出分子特征。这种情况就像人的指纹一样，因此红外光谱也被称为指纹光谱，可以作为化合物存在某种基团的旁证。

分子吸收总能量可以看成是电子、振动和转动能量的总和 转动能级跃迁需要的能量 < 振动能级跃迁需要的能量 < 电子跃迁需要的能量 分子吸收总能量可以看成是电子、振动和转动能量的总和

各光波段对应的跃迁 要把电子跃迁和分子振动、转动的跃迁完全分开是不可能的。 由于转动、振动在电子态间形成了很多精细能级，因此可能发生的跃迁是多种多样的，分子吸收光谱应该是带状光谱而非线状光谱。

血红蛋白/氧合血红蛋白 (in blood) 血糖 (in blood) 生物样品中的吸收物质 水 (74% of body mass) 油脂 (in every cell) 黑色素 (in skin) 血红蛋白/氧合血红蛋白 (in blood) 血糖 (in blood)

水的吸收光谱 在小于800 nm的波段内，水的吸收系数均小于0.026 cm-1，说明光在水中传输100 cm后，至少还剩余约7%的光强。 在1460 nm处，水的吸收系数约为28.4 cm-1，说明光在水中传输1 mm，只剩余原来约6%的光强。

油脂、 血红蛋白/氧合血红蛋白等的吸收光谱

水、血糖、白蛋白在1000-2500 nm范围的吸收光谱

生物组织的光学透明窗口 光学透明窗口只由吸收决定吗？ 答案是否定的，另外一个重要的因素就是散射

3.2 生物样品对光的散射效应

散射与反射、折射等的区别？

弹性散射：入射和散射光子频率相同 光散射 非弹性散射：入射和散射光子频率不同 如拉曼散射，布里渊散射 如果待测样品的折射率不均匀尺度远大于光波长的数量级，例如处理样品边界、样品和探测器之间的区域时，则发生折射，反射等宏观的效应。此时更多考虑光的波动性。 如果尺度达到光波长数量级的待测样品小块间存在折射率的较大差异，光线除了按照几何光学规律传播发生反射和折射外，还会发生散射。此时更多考虑光的粒子性，同时待测样品也要被看作是由亚微米或微米量级尺度的离散颗粒组成。 弹性散射：入射和散射光子频率相同 如瑞利散射，米散射 光散射 非弹性散射：入射和散射光子频率不同 如拉曼散射，布里渊散射

弹性散射的分类 根据粒子的尺寸进行的划分 相对折射率m：散射粒子的折射率ns和背景媒质的折射率n之比 尺寸参数x：散射粒子的半径和入射波长 的比 弹性散射的分类 当x<<1时，散射被称为瑞利散射（Rayleigh Scattering），也称为分子散射 当0.1<x<50时，散射被称为米散射（Mie Scattering），也称为大颗粒散射 当x>50时，散射属于几何光学范畴，光会在样品边界发生反射和折射 根据粒子的尺寸进行的划分

瑞利散射： 米散射： 散射光的强度与波长的四次方成反比， 即散射光的强度随波长增加而减小。 散射前后向对称。 散射强度比瑞利散射大得多 对波长的依赖性弱。 散射粒子的尺寸与光波长相近时，散射光强度的对称性被破坏。散射具有强烈的前向趋势，且随着颗粒尺寸的增加，散射的前向趋势也随之增大

细胞内的弹性散射

散射截面和散射系数 散射截面：光强为I0的光在被粒子散射后，部分光功率Psca成为空间各个方向的分布，定义被散射的功率与入射光强度的比值为散射截面 （具有面积的量纲） 散射系数：单位体积内具有 个散射粒子，每一个粒子的散射截面均为 ，则定义散射系数为 （单位：cm-1） 经过距离 l 后没有被散射的光强表示为：

修正的比尔-朗伯定理 绝大多数生物样品同时具有吸收和散射效应，则： 总衰减截面： 总衰减系数： 对于足够薄的生物样品，如细胞，散射所导致的光程增加可忽略，则： 对于厚的生物样品，如生物组织，散射所导致的光程增加不可忽略，则： 路径因子，用以描述散射引起的光程加长 背景引起的损耗

由生物组织出射的光子的分类 提高高散射生物样品中成像深度的方法： 选择合适的光波长，降低散射效应 在组织中加入适当的清透剂，使组织内部的折射率相对匹配

Olympus公司清透剂 小鼠大脑孵育清透剂两周前后 WD: 4 mm or 8 mm

CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails) COCKTAIL: chemical mixtures containing aminoalcohols mCherry EGFP Neuron-YFP Cell 157, 726–739 2014

非弹性散射：拉曼散射 印度物理学家C. V. Raman 1928年发现拉曼散射， 1930年因此获得诺贝尔物理学奖 拉曼散射（Raman Scattering）是指当光通过介质时与分子发生相互作用而引起的频率发生变化的非弹性散射。

当处于在基态（E0）的分子受到能量为hν0 的入射光子碰撞时，由于介质分子以某个频率νm振动或者转动吸收了入射光子的一部分能量，这时辐射出的散射光（ hν0 -hνm ）叫做斯托克斯线，光子能量变少，波长发生红移 若分子处于激发态（E0+ hνm），碰撞过程中介质分子释放出一部分能量，则辐射出反斯托克斯线（ hν0 +hνm ），光子能量变大，波长发生蓝移。 遵守波尔兹曼分布定律，反斯托克斯线的强度比斯托克斯线弱 当入射光子和分子相碰撞时，分子的振动能量或转动能量和光子能量相叠加，因此利用拉曼光谱可以把处于红外区的分子能谱转移到可见光区来观测，反映了分子的结构和振动，也是一种指纹光谱。

自发拉曼散射非常弱，大约一百万个光子中才有一个作用产生拉曼光子。如何提高拉曼散射的强度？ 增强拉曼光谱的方法 自发拉曼散射非常弱，大约一百万个光子中才有一个作用产生拉曼光子。如何提高拉曼散射的强度？ 共振拉曼散射 表面增强拉曼散射 （SERS） 受激拉曼散射（SRS） 相干反斯托克斯拉曼散射（CARS） 针尖增强拉曼散射 （TERS） 增大约105倍 低背景噪声 无需引入金属材料 系统复杂 增大102－106倍 荧光背景噪声 特定波长激发 增大104－1012倍 克服荧光背景噪声 引入新的金属材料

（增强）拉曼光谱在生物光子学中的应用 生物医学诊断 生物分子传感 生物成像 拉曼编码

3.3 生物样品发光(luminescence)效应 自发发光 激励发光：光致发光(photonluminescence)，电致发光， 声致发光，化学发光 荧光(fluorescence) 磷光(phosphorescence)

三重态(T)具有比单重态(S)更低的能量和更大的激发态寿命 单重态和三重态 单重态 (singlet, S)：同一轨道上的电子具有相反方向的自旋 单重激发态 (S1, S2…)：被激发的电子在新轨道中的自旋方向和（自己）原来相同 三重激发态 (triplet, T1, T2…)：被激发的电子在新轨道中的自旋方向和（自己）原来相反 三重态(T)具有比单重态(S)更低的能量和更大的激发态寿命

荧光和磷光的产生机制 无辐射跃迁：指以放热的形式将多余的能量辐射给周围环境 辐射跃迁：指以放光（荧光、磷光）的形式将多余的能量辐射给周围环境 Jablonski能级图 无辐射跃迁：指以放热的形式将多余的能量辐射给周围环境 辐射跃迁：指以放光（荧光、磷光）的形式将多余的能量辐射给周围环境

荧光光谱的特点 发射光谱形状和吸收光谱的形状极为相似， 并呈现“镜像”现象 荧光发射波长总是比激发波长稍长—单光子 发射光谱的形状和激发光的波长无关 荧光发射的强度和激发光的波长有关

表征荧光的参数 荧光发射光谱 荧光激发光谱 荧光量子效率 (quantum yield) 内部因素：分子内可进行能量转换的振动能级的数目等 不同激发波长的激励引起荧光剂发射同一波长相同荧光强度的相对效率 荧光量子效率 (quantum yield) 内部因素：分子内可进行能量转换的振动能级的数目等 外部因素：荧光分子所处的环境 荧光寿命 脉冲激光激励下，荧光辐射由其本来强度衰减到1/e 时所需要 的时间，称为荧光寿命，用   表示。 荧光强度 若溶液浓度C极稀，则

用于生物样品荧光成像的荧光团 内源荧光团 生物体内固有的荧光团 常用的内源荧光团： 吸收一定波长的光发射內源荧光 内源荧光团 生物体内固有的荧光团 吸收一定波长的光发射內源荧光 常用的内源荧光团： 黄素 (flavin) : 黄素最普通的形式就是单核苷酸黄素（FMN），其最强辐 射发生在530nm波长， NAD（P）H: 自由NAD（P）H的最强激发波长是360nm，它辐射460nm 波长的荧光，而蛋白质束缚的辅酶则辐射440nm波长附近的荧光。 脂褐质：最强激发波长处在紫外波段（330nm－390nm），而最强的辐射 波长在不同环境中从蓝光（420nm）到橘黄光（540－560nm）变化。 弹性蛋白和胶原质:在480nm左右波长的激发光照射下，胶原质和弹性 蛋白这些结构蛋白质会辐射绿黄色的荧光

外源荧光团 在很多生物结构和生物过程中，由于缺乏内源荧光团，不能利用本征荧光进行成像和探测。在这种情况下，需要用外源荧光团对生物结构进行标定来进行生物成像。 理想的外源荧光团必须满足以下基本的要求： · 荧光团在生物媒质中具有较好的分散性/溶解性，便于探测 · 具有和目标分子、细胞器、细胞特定结合的能力 · 高量子辐射效率 · 环境稳定性 · 不会有光漂白现象 · 生物毒性低

常用的外源荧光团 有机荧光染料 荧光蛋白 无机荧光量子点

常用的外源荧光团 ACQ dye AIE dye Tang, B. Z. et al. Chem. Commun. 2001, 1740 Ion sensing Explosive sensing Bio-molecule sensing ACQ dye AIE dye Tang, B. Z. et al. Chem. Commun. 2001, 1740 Bio-imaging Laser OLED

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