植物原生质体培养和细胞杂交 第一节 植物原生质体培养 第二节 细胞融合（细胞杂交） 第三节 以原生质体做受体的遗传转化

第一节 植物原生质体培养 原生质体的概念： 植物细胞原生质体（protoplast）一词始于Hanstein（1880），在植物学上它是指植物细胞通过质壁分离后可以和细胞壁分开的那部分细胞物质。

原生质体培养的应用： 1 植物育种 2 打破有性杂交的局限（自由杂交局限、减数分裂局限、胞质基因局限）进行育种 3 遗传转化 1 植物育种 2 打破有性杂交的局限（自由杂交局限、减数分裂局限、胞质基因局限）进行育种 3 遗传转化 4 避免细胞壁上核酸酶对外源基因的破坏 5 利用原生质体瞬间表达系统 6 理论研究 细胞起源、细胞壁再生、质膜结构和功能、核质关系、胞间作用、激素作用机理等。

1、机械法分离原生质体时期 一 植物原生质体研究历史与现状 一   植物原生质体研究历史与现状 1、机械法分离原生质体时期 1892年由Klercker用于从质壁分离的Stratiotes aloides 细胞分离原生质体；随后为Chambers和Hofler（1931）将洋葱表皮组织的薄片浸在1.0mol/L 蔗糖溶液中，当原生质体收缩脱离壁时用快的刀片切开表皮细胞，获得了少量表皮细胞的原生质体。

2、酶法制备原生质体阶段 1960年英国Nottingham大学植物学系Cocking首次用纤维素酶从番茄幼苗的根分离得到原生质体，从此开创了用酶法分离植物原生质体的时期。其后纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶的商品化，使得实验室制备原生质体成为一中常规技术。

二、植物原生质体研究进展 1、分离方法的改进：商品酶的出现，从各类植物以及不同的器官、组织，都成功地分离到原生质体。

2、原生质体培养技术日趋成熟： 培养基、培养技术的改进极大地提高了培养的效率。现在常用的琼脂糖包埋培养（包括琼脂糖块周围加液体培养基的方法）、液体浅层培养、使用条件培养基或饲喂培养等技术，以及发展出来的一些专门实用于原生质体培养的培养基如KM8p、V—KM、D2a等的广泛使用，均极大改善了培养效率。

3、性细胞原生质体研究： 花粉原生质体、精子和生殖细胞、胚囊及其组成细胞分离成功；单个原生质体培养成功，使人们可以尝试在离体条件下对这些细胞进行操作，发展了雌雄配子的融合技术；培养小麦和大麦的受精卵形成的原生质体发育形成完整植株；利用花粉四分体原生质体与体细胞原生质体融合获得三倍体杂种植株等。

4、原生质体遗传操作： 利用原生质体导入外源DNA获得转化植物，在多种植物中获得成功，已由大豆、杠豆、柑橘、多种芸薹属植物、水稻、高粱、玉米、小麦等作物获得转基因植物；建立起有效的叶绿体转化试验系统；植物病毒在原生质体中增殖系统等。

三、植物原生质体的分离和培养 一）、 原生质体的分离 机械法 酶法 影响原生质体分离质量因素： 酶的种类及其组合、酶液的渗透压、原生质膜的稳定剂、酶解时间与温度、分离与纯化的方法等。

1、材料的选择： 要获得产量高，质量好且容易分裂的原生质体，就要注意用于制备原生质体的起始材料的特性和生理状态。 茄科植物一般选择生长旺盛、生理状态一致的刚展开的幼嫩叶片分离原生质体。 十字花科植物，一般认为是从种子萌发4～5天的无菌苗下胚轴分离原生质体，得率高、活力强、再生频率高。 豆科用未成熟种子胚的子叶较好。对禾本科植物，从幼胚、幼穗、花药或成熟胚建立胚性愈伤组织及其胚性悬浮细胞系分离原生质体有利于其后的再生。

2、酶制剂： 植物的细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质构成。一般而言，纤维素约占细胞壁干重的25%～50%不等。半纤维素约占细胞壁干重的53%左右，果胶质一般约占细胞壁的5%左右。 双子叶植物的叶片，需用纤维素酶和少量果胶酶 愈伤组织细胞及其悬浮细胞除用纤维素酶外，还需用较多的果胶酶，有些材料还需加入半纤维素酶。 花粉小孢子壁除含有纤维素、果胶质外，还有胼胝质，分解时需用蜗牛酶或胼胝质酶。

3、渗透压的稳定剂： 酶液、洗液和培养液中渗透压应和原生质体内的相同或接近，渗透压略大些有利于原生质体的稳定，过大会使原生质体收缩并阻碍原生质体的启动分裂。 广泛使用的渗透压调节剂使甘露醇和山梨醇、蔗糖、葡萄糖和麦芽糖，其浓度约在0.4～0.6mol/L。 加入CaCl2、KH2PO4、葡聚糖硫酸钾都可以提高原生质膜的稳定性，增加完整的原生质体数目和活力。葡聚糖硫酸钾是通过降低酶液中核糖核酸酶活性，而有利于原生质膜的稳定。

4、酶解处理 酶解植物材料处理：表面灭菌，材料分割。 酶的用量：植物材料应按比例和酶液混合才能有效地分离原生质体，一般叶片、子叶切条和下胚轴切片需酶量少，而胚性愈伤组织和胚性悬浮细胞则用酶量大。 渗透剂的选择：小麦和水稻胚性悬浮细胞，用葡萄糖作渗透剂优于甘露醇 酶解条件：PH值，时间，温度。

5、原生质体的纯化 沉降法：用过滤和离心相结合的方法。 漂浮法：采用较原生质体比重大、渗透压高的溶液，使原生质体浮于溶液的表面的，这种方法可以收集较纯的原生质体，但原生质体数量上损失较多，也往往因采用高渗溶液而对原生质体有害。 界面法：利用两种比重不同的溶液，使健康和完整的原生质体处于两液相的界面之中，这种方法能使细胞碎片和细胞器逐渐清除，并可获得更纯净的原生质体。

6、原生质体的活力鉴定 1）细胞壁染色法：荧光增白剂对植物细胞壁是一种最优越的染料。不仅可鉴定细胞壁是否完全除尽，而且可检查原生质体培养过程中壁的再生。细胞壁与染料形成显眼的绿色荧光，没有细胞壁的则无荧光反应，略带红色。 2）原生质体活性鉴定：短时间内测定活力有多种方法，如观察胞质环流作为旺盛代谢指标、Evans蓝活性染色、测定光合活性、用氧电极法测定氧呼吸、用荧光素双醋酸酯（FDA）等。

二）原生质体培养 1、培养基 原生质体培养与组织及细胞培养类同，原生质体与细胞的主要差别是除去了细胞壁，所用培养基一般是加以改良的培养基， 如KM8p和K8p培养基是以B5培养基为基础，NT培养基则以MS培养基为基础。 禾谷类植物的原生质体培养基多数是以MS、Du、N6、KM、AA为基本培养基。 十字花科和豆科植物则多数以B5、KM8p、K8p、KM为基本培养基， 茄科植物以MS、NT、K3为基本培养基。 原生质体培养基中需有一定浓度的渗透压稳定剂

2、培养方法 固体培养 液体培养 固液结合培养 念珠培养 看护培养

A、固体培养法（平板法）： 将纯化后悬浮在液体培养基中的原生质体悬浮液与热融并冷至45℃的含琼脂或琼脂糖或Gelrite的培养基等量混合，并迅速轻轻摇动，使原生质体均匀分布于培养基中，待凝结后，将容器倒置于四周垫有保湿纸或含水海绵的培养皿内，封口。由于原生质体被彼此分开并固定了位置，这种方法避免了细胞间有害代谢产物的影响，并便于定点观察，有利于追踪单个原生质体再生细胞壁的发育过程。

B、液体培养法： 将原生质体悬浮在液体培养基中。 最常用的是液体浅层培养法和悬滴培养法。

C、固液结合培养法： 最为简便的固液结合培养法为双层培养法，即在培养皿的底部先铺一薄层含琼脂或琼脂糖或Gelrite固体培养基（含或包含原生质体或细胞），再在其上进行印刷体的液体浅层培养。这种培养方式有利于固体培养基中的营养成分（或细胞代谢物）可以慢慢地向液体中释放，以补充培养物对营养的消耗，同时培养物所产生的一些有害物质，可被固体部分吸收，对培养物生长更有利。

念珠培养法： Shillito等建立了一种“念珠培养法”，将含有原生质体的琼脂糖培养基切成块放到大体积的液体培养基中，并在旋转摇床上振荡以利于通气。使用大体积的液体是为了防止琼脂糖块过度破碎。

看护培养法： 看护培养法是固液双层法的引申。将水稻或玉米悬浮细胞包埋于琼脂或琼脂糖的培养基中，在其上铺聚脂纤维或硝酸微孔滤膜，将含水稻或玉米原生质的液体培养基置于其上进行培养。采用看护培养法在水稻和玉米中，都证明看护细胞有促进原生质体生长和细胞分裂的作用。

3、培养条件 原生质体培养前的热激处理和超低温处理可提高原生质体植板率。 去除细胞壁的原生质体，在培养初期极其脆弱，由于光、温、湿度等条件的不适往往会引起培养基成分及渗透压的变化，影响原生质体正常生长发育。 一般对于叶肉、子叶、下胚轴等带有叶绿体的原生质体，在培养初期最好置于弱光或漫射光下，由愈伤组织和悬浮细胞脱壁的原生质体应避免光照置于暗中培养。 培养温度一般为25～30℃，随种而异。

二、 由原生质体再生植株 分离的植物原生质体在合适的培养条件下，可以再生形成植株。 1971年首次由烟草叶肉原生质体培养再生植株成功后，现通过原生质体培养形成芽或胚状体，进而再生植株的植物种类已达367种，分布于46科，160属，成功的种最多的是茄科，随后依次为豆科、禾本科、菊科、十字花科、伞形科和蔷薇科。

由植物原生质体培养再生完整植株，经历了由细胞壁的再生、细胞分裂、细胞团和愈伤组织的形成以及植株再生等几个不同的阶段。 1、原生质体培养中的再生过程 由植物原生质体培养再生完整植株，经历了由细胞壁的再生、细胞分裂、细胞团和愈伤组织的形成以及植株再生等几个不同的阶段。

2、原生质体再生植株形成的途径 1） 器官形成途径： 　　　（1）原生质体培养基 （2）分化培养基 （3）生根培养基

2）、胚胎发生途径： 通过胚胎发生途径再生植株的植物种类，多集中在禾本科、伞形科、芸香科、葫芦科和豆科中，还有裸子植物的松科。

3、原生质体再生植株的遗传特性 原生质体再生植株往往在形态和性状方面出现变异，如出现白化苗、“玻璃苗”、叶发生变异、性别、育性及发育期等发生变异。除形态和性状发生变异外，染色体的倍性和数目也常常发生变化。造成变异的原因是多方面的，一种是分离原生质体的材料本身所存在的，这在使用长期无性繁殖的植物材料时更易发生。另一方面更重要的原因可能在于原生质体操作本身引起的。

小结 原生质体分离 原生质体纯化 原生质体培养 胞壁再生 细胞分裂形成细胞团 再生植株

第二节 原生质体融合和细胞杂交 细胞融合（细胞杂交） 两种异源（种、属间）原生质体，在诱导剂诱发下相互接触，从而发生膜融合，胞质融合和核融合并形成杂种细胞，进一步发育成杂种植物体，称为细胞融合或细胞杂交。

一、细胞融合的类型 第一类最常用的即体细胞杂交，用双亲的体细胞原生质体或其衍生系统进行诱导融合，再经培养、筛选、鉴定等步骤得到细胞杂种； 第二类是配子间细胞杂交，即用双亲的性细胞原生质体为融合亲本，其他步骤同第一类； 第三类是配子—体细胞杂交，即一个融合亲本为性细胞原生质体，另一个为体细胞原生质体。目前工作仍以体细胞杂交为多，其他两类开始有些报道

1、体细胞杂交 常规细胞杂交是用双亲脱去细胞壁的原生质体来进行的，经诱导融合、筛选和鉴定，然后得到细胞杂种。 由于原生质体具有各自亲本的全部遗传信息，如果杂交组合是近缘而亲和的，则通过细胞杂交可以得到具有双亲所有遗传信息的细胞杂种，他们是对称的细胞杂种。 双亲都是二倍体原生质体则可以得到双二倍体，双亲都是单倍体的可以得到双单倍体。

细胞融合的过程 膜融合 胞质融合 核融合

植物体细胞杂交 过程示意图 (1) (2) (3) (4) (5)

2、不对称细胞杂交 除了用双亲完整的原生质进行诱导融合外，也有用一个亲本的原生质体与另一亲本原生质体的衍生系统 如： 原生质体与胞质体 原生质体与核质体 甘蓝白化苗下胚轴胞质体和甘蓝型油菜原生质体诱导融合得到胞质杂种。

3、 体细胞与性细胞杂交 性细胞原生质体融合以及体细胞原生质与性细胞原生质体融合，早已引起人们的注意。但由于性细胞原生质体的制备和培养存在技术上的问题，这方面的进展十分缓慢。近年来，由于制备分离精细胞原生质体与卵细胞原生质体取得成功，使在离体培养条件下探索受精作用有了可喜结果。

4、 微细胞杂交 在哺乳动物和人类的细胞生物学或细胞工程研究中，常采用微细胞杂交（microcell hybridization）法，转移单个完整的染色体以建立单体或多体的“染色体杂种”，这种方法也已开始在植物中应用。 其步骤是先用一些处理来诱导细胞中形成高频率的微核，然后再分离和制备具有此微核的原生质体，也有人称之为微原生质体。将微原生质体作为诱导融合的亲本进行细胞杂交，这样的细胞杂交就是微细胞杂交。

二、诱导细胞融合的方法及融合剂 自发融合 用酶法分离原生质体时，常常可以看到同种原生质体的聚集现象，称为同源自发融合。这种融合是发生在亲本之一 的自身，也称为自体融合。 诱导融合 加入融合剂有目的的诱导的融合。以融合剂划分为： 盐类融合法 高钙、高pH融合法 聚乙二醇融合法 聚乙二 醇结合高钙、高pH法。

盐类融合法 以硝酸盐类（硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙）、氯化物类（氯化钠、氯化钙、氯化镁、氯化钡）和葡聚糖硫酸盐类（葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠）为融合剂。对原生质体活力破坏小，但融合频率低，对液泡化的原生质体不易诱发融合。 高钙和高pH值融合法 用较高浓度的钙离子和较高的pH值促进细胞融合。 PEG法 以PEG为融合剂 PEG结合高钙、高pH值法 上面两种方法相结合提高融合率

三、细胞融合程序 双亲原生质体制备 分离、纯化和培养 原生质体融合 融合方法 细胞杂种选择 选择方法 植株再生 再生方式、培养基选择 杂种植株鉴定 形态、细胞和分子鉴定

四、融合体的类型 双亲原生质体融合时，首先发生膜融合、胞质融合，最后发生核融合。由于融合的情况不同，可分为“自体融合”和“异体融合”两大类。 自体融合得到“同核体”， 异体融合得到“异核体”。

亲本原生质体 A B A-A B-B A-B 对称细胞杂种 不对称细胞杂种 异胞质细胞杂种 嵌合细胞杂种

五、细胞杂种选择和鉴定 1、选择意义 淘汰双亲原生质体，仅异核体能存活，保证异核体分裂、分化和形成细胞杂种。 2、选择方法 互补选择法 白化互补 遗传互补 营养代谢互补 可见标记选择法

3、鉴定 形态学鉴定 以亲本为对照，进行形态特征、特性分析 细胞学鉴定 核型分析、显带技术等 分子鉴定 分子标记、同工酶、RAPD、AFLP、SSR等技术。

第三节 以原生质体为受体的遗传转化 植物细胞遗传转化： 指利用离体培养的植物组织、细胞及原生质体作为受体，通过某种途径和技术将外源基因导入植物细胞，获得能使外源基因稳定表达的转基因植株的技术。

一、利用原生质体导入外源基因的方法 最为常用的有PEG法、电击法和脂质体法。 （一）PEG介导转化法

影响转化频率的因素主要有： 1、植物的品种、原生质体的质量及原生质体再生形态的频率； 2、外源基因的浓度和构象： 3、携带DNA：最常用的是小牛胸腺DNA，它可以提高基因转化频率，并且这种作用不能被质粒DNA完全代替； 4、PEG溶液：随浓度升高，转化频率一般首先增大，达到最大值后再逐渐减小。PEG溶液的pH值也影响转化频率； 5、加入DNA和PEG的先后顺序：先加DNA，可提高转化频率； 6、转化介质中两价阳离子的种类和浓度：Mg2+比Ca2+转化频率高； 7、  转化细胞的筛选方法：何时加何种抗生素也影响转化频率； 8、  其它：原生质体的热激预处理、低剂量X—射线照射可提高转化频率等。

特点： 1、实验成本低，结果稳定，重复性较好，不需要特殊仪器设备，易于推广； 2、两个非连锁基因的共转化频率可以达到50%甚至更高； 3、用其它植物的基因组总DNA进行遗传转化，转化频率与用质粒DNA相近。这说明PEG法介导的遗传转化不一定需要克隆的基因和特定的载体，为转移抗之数量性状的基因，和在缺乏合适筛选标记条件下进行遗传转化也是可能的。 4、其局限性在于：以裸露的原生质体作基因受体，必须首先建立可靠高效的原生质体再生系统，这对大多数农作物，尤其是禾谷类还是很大的一个问题。

二）脂质体介导转化法 原理：脂质体（liposome）是一种磷脂（磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨）、胆甾醇和脂肪酸等脂类分子组成的球形双层膜囊结构，可将DNA、RNA等大分子物质包在脂质体内，免受细胞内源核酸酶的降解作用，同时在PEG的作用下，可以更有效地导入受体植物的原生质体。 缺点：在植物中始终未发现一种既能与外源DNA分子高效结合，又能较好地被原生质体吸收的脂质体配方，且每次转化前，都得从头合成脂质体，费时费力，重复性差，繁琐低效。因此在植物上的应用大受限制。

（三）电击穿孔转化法 原理：短时、高压脉冲电处理可导致细胞膜上出现短暂可逆性小孔（瞬间通道），从而产生新的渗透点，为外源DNA分子进入原生质体提高了通道。 特点：应用性广，不同基因型的植物均可使用且有效，特别适用于农杆菌不敏感的禾谷类，应用前景广阔。但需要高电压，对原生质体伤害较大。  除上述三种方法外，目前的基因枪法、激光微束法、超声波法、低能离子注入法和玻璃珠振荡法等。直接将外源基因导入原生质体的报道很少，或整合成功的较少。

二、原生质体瞬间表达系统及其应用 这一系统至今已广泛用于植物基因表达调控的研究。

1、  DNA导入方法 电激法、PEG法和基因枪法。 一般用质粒DNA。

2、  瞬间表达过程 瞬间表达指短时间内的基因表达，通常在DNA导入后数小时到十多天都能检测到，但一般第二天最高，随后逐渐下降。质粒导入后，大部分并未插入到染色体上，而是以游离状态存在。这部质粒在瞬间表达中起重要作用。质粒DNA的构象可能影响瞬间表达。

3、 原生质体瞬间表达在基因表达调控研究中的应用 3、  原生质体瞬间表达在基因表达调控研究中的应用 原生质体瞬间表达为研究基因表达的调控提供了一种方便有效的实验系统。 原生质体通常是一个相对比较均一的单细胞群体，导入外源基因后的表达有较好的同步性；它无需进行长时间的组织培养，或用转基因植物的情况中需要花很长时间照看植物，整个检测过程仅需很短时间（2天之内）即可获得与转基因植物相仿的结果。 原生质体瞬间表达系统至今已广泛用于研究，诸如不同的调控顺序和基因的功能、植物激素、紫外光、热激、厌氧条件、代谢产物等各种内外因素对基因表达的影响。