酶 酶的活力测定和分离纯化 酶的工作原理

第四节. 酶的工作原理 酶催化反应对生命体是必需的 生理条件下，生物大分子往往很稳定，化学反应在 没有酶的催化下速度奇慢。 在细胞环境内，如果没有酶，很多普通的生化反应 是很难或不可能直接发生的，如形成不稳定的带电 的中间物，反应分子按精确的顺序排列起来等等。 没有酶，消化食物，传递神经信号，或肌肉收缩都 不可能在一个“有用”的速度发生。

概念 1、活性中心（active site）：酶分子中结合底物并起催化作用的少数氨基酸残基，包括底物结合部位、催化部位。 2、底物（substrate）：结合于活性中心，并由酶催化的物质 胰凝乳蛋白酶 first proposed by Charles-Adolphe Wurtz in 1880, is central to the action of enzymes. It is also the starting point for mathematical treatments that define the kinetic behavior of enzyme-catalyzed reactions and for theoretical descriptions of enzyme mechanisms. 活性中心表面排列着一些带有特殊侧链的氨基酸残基，这些R基与底物结合，催化其化学变化。 酶的活性中心把底物完全从溶液中“攫取”出来，底物与酶因此形成复合体（酶-底物复合体，ES）

酶影响的是反应速度，不是反应平衡点 概念： 基态（ground state）：按任何一个方向进行反应的起始状态 where E, S, and P represent the enzyme, substrate, and product; ES and EP are transient complexes of the enzyme with the substrate and with the product. 概念： 基态（ground state）：按任何一个方向进行反应的起始状态 △G0 ：标准状态下（temperature 298 K; partial pressure of each gas 1 atm, or 101.3 kPa; concentration of each solute 1 M）反应系统的能量改变 △G’0：生化标准自由能变化，即在pH＝7.0时的标准自由能的变化 反应过程中的能量变化图 自由能 G 反应进程

反应速度依赖的参数，不是△G’0，而是活化能△G ‡ 能垒（energy barrier）： 反应基团的排列，不稳定电荷的形成，键的重组以及反应进行所需的其他转变过程所需要的能量。 过渡态（transition state）： 在能垒的最高点，具有相同可能性变成S和P的状态。基态不是一个化学物质（如ES，EP），而是一种瞬时的分子状态，伴随着共价键的断裂，生成以及电荷的累积，该状态的分子有相同的可能性沿两个坡顺下变成S或P △G ‡：基态和过渡态的能量差称为活化能 S和P的反应平衡点反映的是各自基态的自由能，由S到P △G’0为负，说明反应有利于P的生成。 有利于P的生成，并不意味着这个反应的速度是可见的。

△G’0极大，所以反应平衡时葡萄糖的量可以忽略； 但是能垒极高，需要的活化能极高，所以平常状态不反应； 有酶催化的作用下，反应可以很容易进行，其能量可以迅速释放，为生命活动所用

提高反应速度的两个方式： △G ‡不变，提高温度（eg.)使能够拥有克服能垒能垒的分子增多 加入催化剂降低△G ‡ Catalysts enhance reaction rates by lowering activation energies.

反应中间物（reaction intermediates）：反应过程中任何短暂存在的化合物。ES，EP 限速步骤（rate-limiting steps）：当一个反应中有数个步骤时，反应整体的速度取决于活化能最高的那一步（或几步），该步骤称为限速步骤

能垒的生物学意义： 使生物大分子相对稳定，不会迅速自发降解成简单的有机化合物，对保持生命体复杂的结构非常重要。 进化过程中，出现了酶，选择性的使某些反应的活化能降低，使得细胞能够存活

反应平衡和速率有准确的热力学定义 反应平衡 平衡常数 热力学上平衡常数与自由能变的关系： where R is the gas constant, 8.315 J/mol K, and T is the absolute temperature, 298 K (25 C). 平衡常数与反应的标准自由能变直接相关， △G’0越负，则Keq’越大，表示反应越倾向于形成P

反应速度 S→P 一级反应，速度完全取决于底物的浓度。 k的意义：在给定条件下进行反应的可能性。单位是s-1，k＝0.03? k=2000?

若反应有两个底物，则称“二级反应” 由过渡态理论得到下列关系式 M-1s-1 由过渡态理论得到下列关系式 where k is the Boltzmann constant and h is Planck’s constant. k与△G‡ 是负相关的，而且是指数式的。简单讲，活化能越低意味着反应速度指数式的加快！

酶可以降低反应的活化能，因此可以增加反应速度

如何解释酶的强大催化能力和特异性？ 1. 酶促反应过程中底物与活性中心共价键重新排 列，降低了活化能，为反应提供了另一种低能量的 路径。 2. 底物与活性中心非共价的相互作用降低活化能， 氢键，疏水相互作用，盐键等。 底物与酶形成ES，伴随着自由能的释放，赋予ES一 定的稳定性，酶与底物结合所衍生出的能量叫做结 合能（binding energy） △GB ，它是酶用来降低 反应活化能的主要自由能来源。 Chemical reactions of many types take place between substrates and enzymes’ functional groups (specific amino acid side chains, metal ions, and coenzymes). Catalytic functional groups on an enzyme may form a transient covalent bond with a substrate and activate it for reaction, or a group may be transiently transferred from the substrate to the enzyme.

很大程度上，酶的催化能力来源于酶与底物之间形 成的弱的非共价的相互作用时释放的结合能。 ES之间弱的相互作用在过渡态时最强。 理解酶促反应的两个关键点 很大程度上，酶的催化能力来源于酶与底物之间形 成的弱的非共价的相互作用时释放的结合能。 ES之间弱的相互作用在过渡态时最强。 锁钥模型 诱导契合模型

为什么锁钥模型在酶反应中是讲不通的？ 想象的“断棒酶”模型 酶与底物和产物的过渡态是完全契合的 first proposed by Michael Polanyi (1921) and Haldane (1930), was elaborated by Linus Pauling in 1946: 酶通过与过渡态的相互作用（结合能）用来“支付”部分反应需要的活化能

底物与酶之间弱的相互作用为酶促反应提供了一种较强的驱动力。 真实的酶以类似的方式工作：某些弱相互作用在ES复合体中已经形成，但只有底物处于过渡态时，E与S才完全互补。E与S结合所释放的自由能（结合能△GB ）支付了底物在没有催化的条件下达到过渡态所需要的部分能量。 也就是说，对反应不利的活化能 △G‡uncat（正的）与对反应有利的结合能△GB （负的）的加和，导致了一个相对较小的净活化能△G‡cat 底物与酶之间弱的相互作用为酶促反应提供了一种较强的驱动力。 对催化活性的主要贡献来源于只在过渡态形成的弱相互作用

催化需要大量的弱相互作用力是酶（以及一些辅酶）的分子量很大的原因之一： 酶需要提供形成离子键，氢键和其他相互作用的基团；同时必需精确的排列这些基团，以便在过渡态使结合能最优；需要将底物从水中攫取到“洞里”（活性中心）， 酶的大小反映了需要多少高级结构排列这些活性基团使其最易结合过渡态底物，以及使得活性中心免于“塌陷”。

结合能△GB贡献了催化的效率 根据上面的关系式，在一级反应中，在细胞内环境中，反应速度k要提高一个数量级， △G‡必需减少约5.7 kJ/mol，酶与底物多个弱相互作用的加和经常可达60－100kJ/mol，这可以用来解释许多酶对反应速度的增强程度。

结合能△GB也赋予酶底物的专一性 如果一个酶的活性中心活性基团的排列与某个特定底物形成弱相互作用的能力是最优的，那么该酶不可能与任何其他分子有相同程度的结合能力。 催化活性和特异性是密切联系的 80％的催化加速与3位碳上的磷酸基团密切相关，去掉该基团，反应速度大大下降

结合能具体如何降低活化能的？ 增加△G‡的物理和热力学因素 (1) 熵：反应需减少溶液中两种分子运动的自由度; (2) 溶质表面由水分子以氢键连接组成的“外壳”，该外壳可以在水溶液中帮助稳定大部分生物大分子; (3) 很多反应过程中底物分子要被扭曲 (4) 酶分子内部催化相关的功能基团的合适排列。 结合能可被用来克服所有这些障碍

限制分子的自由度可以增加反应速度 第一. 酶与底物的结合能可以使熵减少，变分子间反应为分子内反应

第二，底物与酶形成弱相互作用导致底物的“解溶剂化”（desolvation of the substrate) 第三，底物处于过渡态时释放的结合能可以帮助扭曲底物分子，经常是电子的重新分布。 最后，酶结合底物后，自身构象改变，产生诱导契合现象。该现象将特定的功能基团带到合适的位置进行催化，也可以“允许”与处在过渡态的底物形成附加的弱相互作用

NADP＋ 四氢叶酸 二氢叶酸还原酶

结合能以外的催化因素： 对催化有贡献的特定催化基团 大多数酶中，结合能只是整体催化机理的其中之一 由于其他机制需要酶与底物或转移的基团之间形成瞬时的共价相互作用，所以与结合能明显不同： 1. 广义的酸碱催化（General Acid-Base Catalysis） 2. 共价催化 3. 金属离子催化 也有重叠之处

广义的酸碱催化（General Acid-Base Catalysis） 许多生化反应过程包含形成不稳定的带电中间物，这些带电中间物倾向与断裂形成原来的反应物，所以会阻碍整个反应的进行。这种带电中间物常常可以通过转移进出质子而形成另一种中间物，该中间物更容易断裂形成产物 专一的酸碱催化

用于广义酸碱催化的氨基酸残基

改变了反应的通路，只有当新通路的活化能低于原来的活化能时，才表现催化效应。 共价催化 改变了反应的通路，只有当新通路的活化能低于原来的活化能时，才表现催化效应。 氨基酸残基侧链和一些酶的辅因子可以作为“亲核基团”与底物形成共价键 共价催化与酸碱催化有类似性，区别是是否与H形成共价键

金属离子催化 底物与酶中金属离子的离子键可以帮助底物朝正确方向排列，或者帮助稳定带电的过渡状态，与前面的结合能类似。金属通过可逆改变自身的氧化状态来介导氧化还原反应。 三分之一的酶需要金属离子

胰凝乳蛋白酶同时运用广义的酸碱催化和共价催化的机制