液相色谱 上海纳锘仪器有限公司 服务热线：021-60900829 60900830 耗材热线：021-61131051 传真：021-61131052 网址：www.nano-instru.com

一、色谱起源 石油醚 碳酸钙颗粒 色素 色谱 组分

二、定义 色谱法(Chromatography)：利用组分在两相 间分配系数不同而进行分离的技术 流动相：携带样品流过整个系统的流体 固定相：静止不动的一相

HPLC的分离类型 正相色谱 (NP-HPLC) 反相色谱 (RP-HPLC) 反相离子对色谱 (RPIC) 离子交换色谱 (IEC) 空间排阻色谱 (SEC) 手性化合物分离模式(Chiral separation mode)

液相色谱按两相极性不同分为: 正相色谱 反相色谱 化合物保留时间随流动相配比的变化 不同极性的化合物出峰顺序

正相HPLC色谱柱 硅胶型 氰基型 氨基型 糖类分析 二醇基型 蛋白质分析 Si Si Silica gel Modified Si 氨基型 糖类分析 二醇基型 蛋白质分析 -Si-CH2CH2CH2CN -Si-CH2CH2CH2NH2 -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH) Si Si Silica gel Modified Si

反 相 HPLC 色 谱 柱 Non-polar property -Si-C18H37 C18 (ODS) type C8 (octyl) type C4 (butyl) type Phenyl type TMS type Cyano type Non-polar property -Si-C18H37 Si

反 相 色 谱 色谱柱 : 非极性 溶剂 : 极性 水 / 甲醇 / 乙腈

液相色谱流程图 色谱柱 检测器 进样器 输液泵 柱温箱 溶剂 数据处理

流动相 流动相选择注意事项： 纯度：采用“ HPLC ”级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配 流动相配制时的顺序

溶 剂 等 级 纯化水 蒸馏水 去离子水 水的等级 吸光率 去离子水 纯化水 波长 (nm) 因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高 溶 剂 等 级 水的等级 纯化水 蒸馏水 去离子水 吸光率 去离子水 纯化水 波长 (nm) 因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高 纯化水中去除了无机和有机的污染物

溶 剂 等 级 鬼峰的出现 水 / MeOH梯度 Gradient Curve ODS 柱 1 ml/min, 0-100% MeOH 溶 剂 等 级 鬼峰的出现 水 / MeOH梯度 ODS 柱 Gradient Curve 1 ml/min, 0-100% MeOH over 10 mins and hold for 15 mins. 鬼峰

溶 剂 等 级 HPLC级 优级纯 分析纯 溶剂的等级 微量分析、梯度洗脱 都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒 溶 剂 等 级 微量分析、梯度洗脱 溶剂的等级 HPLC级 优级纯 分析纯 都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒 优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂 HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质

溶 剂 等 级 分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图 甲醇 乙睛 正己烷

溶剂前处理 过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。 过滤膜种类 水系过滤膜 有机系过滤膜

溶剂前处理 一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能容纳的空气总量要小 气泡对测定的影响： 1）柱压波动，流量偏小 2）基线波动 脱气 目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能容纳的空气总量要小 气泡对测定的影响： 1）柱压波动，流量偏小 2）基线波动 返回

流路中形成气泡引起的问题 改变保留时间和峰面积 峰变形 尖峰或锯齿状噪声 流动相中形成气泡对液流的不良影响 泵中形成气泡使液流波动 柱中气泡形成和累积使流动相绕流 尖峰或锯齿状噪声 检测池中气泡形成和累积产生基线噪声

输液泵 输液泵类型： 注射泵 柱塞往复泵 隔膜泵 输液泵控制方式： 恒流控制 恒压控制

柱塞往复泵 单向阀 马达和凸轮 柱塞杆 柱塞杆密封圈 泵头 10 -100uL

柱塞往复泵 优点 压力脉动小 易于更换溶剂 缺点 需要更换柱塞杆密封圈

岛津VP系列输液泵 目的 单元 流速范围 特性和应用 目的 单元 流速范围 特性和应用 分析 LC-10ADVP 0.001-9.999 无脉动，适于 半微量LC 和 LC-MS LC-10ATVP 0.001-9.999 非凡的耐用性， 适于常量分析 *所有单元都既可做高压梯度又可做低压梯度

等度洗脱 输液泵 进样器 色谱柱 柱温箱 检测器 单一或混合溶剂

梯度洗脱 A 泵 进样器 色谱柱 柱温箱 检测器 B泵 A B 时间 B 浓度

等度洗脱 分析时间长 分离度差 MeOH / H2O = 6 / 4 MeOH / H2O = 8 / 2 ( column : ODS type )

梯度洗脱 95% MeOH 浓度 30%

梯度洗脱： 注意事项： 优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度 溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差 梯度混合的溶剂互溶性要好 梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）

高压/低压梯度系统 高压梯度 低压梯度 混合器 低压梯度比例阀 脱气机

高压/低压梯度系统 高压梯度系统 梯度准确度好 系统复杂 (需两台或三台泵) 低压梯度系统 系统简单 需在线脱气机 存在时间滞后效应 返回

进样器 自动进样器 手动进样器 原理：（六通阀） 注入方式： 1）全量注入 2）部分注入 返回

手动进样器的原理图 装填状态 进样状态 返回

进样体积与响应值关系 检测器响应值 全量注入 部分注入 3倍定量管体积 定量管体积的一半 进样体积 返回

柱温箱 柱温控制的优点： 分析结果重现性好 提高柱效 降低柱压 保证检测稳定性

色谱柱 ODS柱的使用注意点： 1）柱压低于150kgf/cm2（15cm色谱柱） 2）柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃ 3）流动相PH使用范围为2～7.5 返回

流动相注意点 离子对试剂的使用 具有缓冲盐流动相的使用 分析结束及开始 流动相平衡 加快平衡时间 异丙醇的使用

LC检测器 紫外可见检测器（UV/VIS） 二极管阵列检测器（PDA） 示差检测器（RID） 电导检测器（CDD） 荧光检测器（RF） 电化学检测器（L-ECD） 质谱检测器（MS） 蒸发光散射检测器（ELSD）

紫外可见检测器 紫外可见检测器 原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 定量基础：Lambert-Beer定律，A＝KCL 优点：1）对温度和流速变化不敏感 2）可用于梯度分析 缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质

紫外可见检测器 样品池 参比池 光电管 Ein 光栅 D2 / W 灯 l Eout

二极管阵列检测器（SPD－M10AVP） 二十一世纪标准紫外检测器 色谱信息： 保留时间 常规紫外检测器 紫外光谱 二极管阵列检测器

二极管阵列检测器 样品池 光栅 每一单元可检测一个 波长下的吸光度 D2 / W灯 二极管阵列（512个单元）

三维谱图 时间 波长 吸光度 色谱 光谱

检测器 示差折光检测器 原理：连续测定流通池中溶液折射率变化以测定 试样各组分浓度。 优点：通用型检测器 缺点：1）对温度和压力变化敏感 2）不能用于梯度分析 返回

糖的色谱图 Analytical Conditions Column : Shim-pack CLC-NH2 Mobile phase : Acetonitrile / water = 7 / 3 Flow rate : 1.0 mL/min Temperature : Ambient Peaks 1. 甘油 2. 木糖 3. 果糖 4. 葡萄糖 5. 蔗糖 6. 甘露糖 7. 乳糖

荧光检测器 原理: 基于被分析组分发射的荧光强度进行 检测 缺点: 仅适用于测定可产生荧光的物质 原理: 基于被分析组分发射的荧光强度进行 检测 缺点: 仅适用于测定可产生荧光的物质 优点: 1) 灵敏度极高,是最灵敏的检测器之一 2) 选择性好 3) 对温度和流速不敏感,可用于梯度洗脱 可检测物质: 多环芳烃,霉菌毒素,酪氨酸,色氨酸,儿茶酚氨等(具有对称共轭体系)

液相色谱流程图 色谱柱 检测器 进样器 输液泵 柱温箱 溶剂 数据处理

液相色谱日常维护

维护流程图 吸滤头 单向阀 柱塞密封圈 线路过滤器 检测器

管线选择 材料 尺寸 0.1 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.3 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 不锈钢 Teflon PEEK (聚醚酮) 尺寸 0.1 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.3 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.5 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.8 mmI.D. x 1.6 mmO.D.

管线材料 不锈钢 (可用于所有连接) 能承受几千 kg/cm2 压力 酸性或高浓度盐环境中易腐蚀 (尤其在pH小于2时) PEEK (可用于所有连接) 能承受高达 250 kg/cm2压力 可在整个PH范围(pH 1-14)内使用 不适用于高溶解性溶剂如氯仿等 Teflon (用于柱后阻尼管、反应管和排液管) 化学惰性大 能承受 5 kgf/cm2 压力

接头 不锈钢接头 / 垫圈 垫圈 主要用于输液泵、进样器的连接 能承受 400 kgf/cm2压力 一旦固定，垫圈不可再动 不锈钢接头 PEEK接头 主要用于色谱柱、检测器的连接 易于安装 能承受 250 kgf/cm2压力 容易产生死体积 垫圈 不锈钢接头 PEEK接头

吸滤头 材料：不锈钢烧结，孔径10um 故障：堵塞 表现：管路中不断有气泡生成 措施：用异丙醇（或5％稀硝酸），超声波清洗，再用蒸馏水清洗

单向阀 T泵：串联式往复泵 D泵：并联式往复泵

单向阀 单向阀原理 单向阀结构 吸液冲程 排液冲程 出口单向阀 进口单向阀 泵头 抛光面 宝石球 流动相 球座

单向阀清洗 故障：宝石球或球座受污导致密封不好 表现：系统压力波动大 措施： 打开排液阀，以异丙醇为流动相输液 拆下单向阀，放入异丙醇中，超声波清洗

单向阀粘结 故障1：宝石球粘附于垫片 表现：泵无法吸液或排液，流路不通 措施：1）用针筒抽出口单向阀以产生负压，使宝石球与垫片分开 2）拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超声波清洗

柱塞密封圈的更换 故障：密封圈磨损导致密封不良 现象：系统压力波动大或漏液 措施：更换密封圈 注意点： 1）更换前，新密封圈用异丙醇 浸泡15 min 2）拆卸泵头前，柱塞杆复位 （P－SET） 流动相 泵头清洗管路 柱塞杆 密封圈

线路过滤器 故障：堵塞 现象：系统压力波动大或压力 偏高 措施：异丙醇（或5％稀硝酸）， 超声波清洗 判断依据：关闭排液阀，断开出口管路，设定流速1mL/min，如压力>5kgf/cm2，则堵塞。 排液阀 压力传感器 线路过滤器 流动相

手动进样器 操作注意点： 1）进样时，进样针应插到底 2）不使用时将针头留在进样器内 3）进样应使用液相色谱专用平头 进样针 4）样品溶液pH小于10, 常用密封垫的材质适用pH<10, 否则换特氟隆材质的密封垫pH10-13 5）清洗应使用专用针口清洗器 定子 转子 针头密封垫 弹簧 不锈钢套

清洗针口

色谱柱柱效降低原因 滤片或填料堵塞 样品或流动相中杂质吸附 机械振动产生空隙 填料变性

滤片或填料堵塞 使用预柱 缓冲液和溶剂使用0.45um滤膜过滤 样品溶液使用0.45um滤膜过滤 反向连接色谱柱，使用清洗溶剂以小流量送液 打开柱头，清洗或更换滤片 Back

样品或流动相中杂质吸附 杂质会产生拖尾峰 使用高溶解性溶剂清洗色谱柱 取出污染填料，装填新的填料 仅 1 cm深度 会被污染 色谱柱

产生峰变形（如拖尾等）的原因 柱进口污染 柱内存在空隙 样品过载 溶解样品的溶剂选择不当 二次保留效应 担体表面存在硅醇基 担体表面残留重金属

溶解样品的溶剂选择不当 20 uL 20 uL 10 uL 最好不要选择高溶解性的试剂作为溶解样品的溶剂 甲醇 作为溶剂 Caffeine 乙醇 作为溶剂 20 uL Caffeine 乙醇 作为溶剂 10 uL Caffeine 最好注入少量样品

溶解性效应 低溶解性溶剂 高溶解性溶剂 Back

机械振动产生空隙 不要撞击色谱柱如 色谱柱掉落或柱压急剧变化 。 输液时不要打开排液阀 Back LC-10AD ::::::: 000 0 8 9 4 5 6 1 2 3 7 xxxx 000 0 LC-10AD ::::::: 输液时不要打开排液阀 Back

反相色谱分析时 添加10-30 mM 三乙胺(triethylamine) 可以抑制碱性化合物色谱峰拖尾 添加1% 醋酸acetic acid 可以抑制酸性化合物拖尾 三乙胺(triethylamine) 也用于正相色谱中,使硅胶部分去活性, 以获得化合物合适的保留时间

紫外检测器 参比池 样品池 光线 硅光电池板

检测池清洗 故障：样品池受污 表现：样品池和参比池能量相差较大 检查方法：设定250 nm波长，通甲醇或水，查看SMPL EN 和REF EN，如两者相差较大，则样品池受污 措施：用针筒注入异丙醇，清洗样品池；如污染严重， 拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中清洗。

更换氘灯 判断氘灯能量： 设定220nm波长，检查参比池能量，如能量低于800，需考虑更换氘灯。