生物大分子波谱学原理 吴季辉 蛋白质核磁脉冲序列分析 阮科 kruan@ustc.edu.cn

脉冲序列基本原则 Ix Ix IzSz Iy Iz IySz 1、平衡态密度算符：SgIIZ，如15N标记蛋白，gHHZ+gNNZ 生物大分子波谱学原理 吴季辉 脉冲序列基本原则 1、平衡态密度算符：SgIIZ，如15N标记蛋白，gHHZ+gNNZ 2、Delay时期，Hamilton算符为wIIZ + wSSZ + pJIzSz(两核体系），多核体系包括所有的化学位移算符和可能的J耦合算符 3、短的硬脉冲，一般只考虑脉冲所起的作用（90，180…)，忽略化学位移和J演化 4、大多成形脉冲可以近似为90/180脉冲 5、Ix/y/z—Ix/y/z? Ix/y/z—Ix/y/zSx/y/z? Ix Ix IzSz   Iy Iz IySz

脉冲序列分析基本思路 1、乘积算符 基本单元：自旋回波，INEPT, COSY, TOCSY，NOESY 2、相干传递途径 生物大分子波谱学原理 吴季辉 脉冲序列分析基本思路 1、乘积算符 基本单元：自旋回波，INEPT, COSY, TOCSY，NOESY 2、相干传递途径 从0开始，-1接收 自由进动时相干阶不变，只有脉冲才能改变相干阶 相干传递途径只画出想要的途径 3、相位循环 脉冲相位变化f，则相干阶Dp经历的相位变化为-fDp，即接收相位变化。 若相位循环为360/N，Dp为想要的相干阶变化，则Dp+nN （n=…-3,-2-1,0,1,2,3…)也被选择，其它被抑制 t1 t2 t1 -t2

脉冲序列分析基本思路 4、梯度场 可作为z向的脉冲处理 Gz – 180 – Gz：完善180度脉冲 生物大分子波谱学原理 吴季辉 脉冲序列分析基本思路 4、梯度场 可作为z向的脉冲处理 Gz – 180 – Gz：完善180度脉冲 乘积算符z向后，+强梯度：除去所有的非z向相干阶 梯度选择Gz/gS – RevINEPT – Gz/gI： 5、间接维正交检波 States, TPPI，States-TPPI

http://www.bmrb.wisc.edu/ref_info/statful.htm#1

生物大分子波谱学原理 吴季辉 第六章 同核核磁实验方法 COSY型实验 多量子谱 TOCSY NOESY ROESY

生物大分子波谱学原理 吴季辉 同核核磁谱  

生物大分子波谱学原理 吴季辉 同核核磁谱 在记录二维谱或三维谱等之前均需要记录一维氢谱，通常蛋白质溶于水或适当的缓冲液，加5-10%的D2O作为锁场介质。一维氢谱可用于检查样品是否有足够浓度，通常16－32次采样要能得到足够信噪比的谱图，甲基由于快速旋转呈现窄峰，而酰胺质子由于化学交换及14N的标量弛豫呈现宽峰； 一维氢谱还可用于检查样品的共振峰宽是否合理，蛋白质在高浓度下容易聚集从而增宽谱线，严重时甚至1H谱上看不到明显的峰，样品在这种条件下显然无法进行核磁研究；一维氢谱还可用于判别样品的化学位移分布情况，可判别样品是否变性，同时也对研究工作的难度提供一些预测。 蛋白质的一维氢谱一般不应该有非常尖的峰，若出现这种峰，往往是残留的小分子杂质，当然蛋白质的末端及loop区由于分子运动较快也会出现一些较尖的峰。

当样品条件不佳时，一维谱（以及若干信号强的二维谱如1H-15N HSQC）可用来探索适合的样品条件。 生物大分子波谱学原理 吴季辉 当样品条件不佳时，一维谱（以及若干信号强的二维谱如1H-15N HSQC）可用来探索适合的样品条件。 ubiquitin（一种蛋白质，76个残基）的一维谱：a 水溶液中，b 箭头所指甲基区的放大，c 8M尿素溶液中，显示变性谱。

生物大分子波谱学原理 吴季辉

生物大分子波谱学原理 吴季辉

生物大分子波谱学原理 吴季辉

生物大分子波谱学原理 吴季辉

生物大分子波谱学原理 吴季辉 COSY型实验 COSY COSY的变型 Relayed COSY 多量子滤波COSY E-COSY

生物大分子波谱学原理 吴季辉 COSY COSY(correlated spectroscopy),是人们发明的第一种二维谱，同时也是研究蛋白质的最有用的二维谱之一。二个有J偶合的核在COSY上可产生一个交叉峰，由于蛋白质（包括多数其他有机物）中有J偶合意味着这两个核最多通过3个共价键连接，所以COSY谱对于分子结构的拓扑连接可提供非常有价值的信息。

生物大分子波谱学原理 吴季辉 COSY

COSY：脉冲序列分析 第一项为纵向磁化，第二项为多量子项，均不能被观测到； 生物大分子波谱学原理 吴季辉 COSY：脉冲序列分析 第一项为纵向磁化，第二项为多量子项，均不能被观测到； 第三项仍然是第一核的横向磁化，在检测期的频率同演化期类似，均是第一核的，对应于对角峰； 第四项是第二核的反向磁化，在检测期的频率为第二核的化学位移，与演化期不同，对应于交叉峰，这是二维谱最有意义的峰。

生物大分子波谱学原理 吴季辉 COSY：脉冲序列分析

生物大分子波谱学原理 吴季辉 COSY COSY的交叉峰为反相峰，这一点非常重要，决定了COSY型实验采样及处理时需要注意的问题。而交叉峰与对角峰在相位相差90度，对于谱图在对角线附近的质量有重要的影响。

生物大分子波谱学原理 吴季辉 COSY F 应用 在高场区由于化学位移的简并，谱峰的重叠，对角峰的干扰，通常不容易由COSY辨认整个自旋系统，在蛋白质COSY特别有用处是用于检查所谓的指纹区特别是酰胺质子与质子的交叉峰。在这个区域，脯氨酸由于没有氨基没有交叉峰；甘氨酸有两个质子故有两个交叉峰（除非两者的化学位移相同）；N端残基上的NH由于与水交换快也没有交叉峰。除特殊情况外，对于不大的蛋白质，所有的峰都应该能找到。

COSY的变型 1. COSY- 第二个90度脉冲用小于90度的脉冲代替，其结果是： 交叉峰被减弱 生物大分子波谱学原理 吴季辉 COSY的变型 1. COSY- 第二个90度脉冲用小于90度的脉冲代替，其结果是： 交叉峰被减弱 多核体系中被动偶合产生的某些交叉峰被减弱，导致精细结构的变化，起到简化图谱的作用

生物大分子波谱学原理 吴季辉 COSY的变型  

COSY的变型 生物大分子波谱学原理 吴季辉

COSY的变型 2 pre-TOCSY COSY 生物大分子波谱学原理 吴季辉 COSY的变型 2 pre-TOCSY COSY 预饱和同时抑制接近水峰的H信号，因而从H到其他质子特别是NH的交叉峰减弱甚至消失，而NH到H的交叉峰往往淹没在水峰产生的t1噪声中。在pre-TOCSY COSY中，在COSY序列前插入一个短时间的TOCSY混合脉冲，使其他质子的信号先传递给H，这样可部分恢复H到其他质子的信号。

生物大分子波谱学原理 吴季辉 COSY的变型

生物大分子波谱学原理 吴季辉 2QF-COSY

生物大分子波谱学原理 吴季辉 2QF-COSY

2QF-COSY 3，4项为交叉峰，二维均是反相裂分，被动偶合呈同相裂分； 1，2项是对角峰，二维均是反相裂分，被动偶合呈同相裂分； 生物大分子波谱学原理 吴季辉 2QF-COSY 3，4项为交叉峰，二维均是反相裂分，被动偶合呈同相裂分； 1，2项是对角峰，二维均是反相裂分，被动偶合呈同相裂分； 这两个对角峰的相位与交叉峰相同； 第5项也是对角峰，在两维均是反相峰（两个J偶合的作用均是反相），但相位与其他峰相差90度，在交叉峰调成吸收型时，这峰呈色散型，不过由于是反相峰，有部分相互抵销，其拖尾延伸不远，影响远不如普通COSY。 结论：即使在三核体系，对角峰有色散成分，对交叉峰的影响也不大

生物大分子波谱学原理 吴季辉 2QF-COSY

生物大分子波谱学原理 吴季辉 2QF-COSY

生物大分子波谱学原理 吴季辉 3QF-COSY 类似地可以记录三量子滤波COSY。至少三核体系才能产生三量子信号，要注意其交叉峰在两维对两个J偶合均呈反相峰即双反相峰，这同COSY及2QF-COSY不同。由于其交叉峰信号只有2QF-COSY的一半，一般用的不多。

生物大分子波谱学原理 吴季辉 E-COSY

生物大分子波谱学原理 吴季辉 E-COSY

生物大分子波谱学原理 吴季辉 E-COSY

生物大分子波谱学原理 吴季辉 双量子谱

生物大分子波谱学原理 吴季辉 双量子谱