◆Animal Cell Engineering◆ Animal Cell Culture ◆ Biology of cells in culture ◆ Fluid for cell culture ◆ Standard cell culture techniques ◆ Establishing a cell line or cell strain ◆ Cell freezing and recovery

组织培养教学参考书 组织培养和分子细胞学技术，鄂征，北京出版社 体外培养的原理与技术，薛庆善，科学出版社 细胞培养是动物细胞工程的基础

Introduction to Cell and Tissue Culture Theory and Technique

Section 1：培养细胞的生物学特征 ◆ 动物细胞与组织培养基本概念 ◆ 动物细胞与组织培养发展历史 ◆ 动物细胞特点及其体外培养特性

通称的动物组织培养 (ATC - Animal tissue culture) 一、动物细胞与组织培养基本概念 通称的动物组织培养 (ATC - Animal tissue culture) （1）究竟在培养什么?

体外培养（In Vitro） 组织培养（Tissue Culture） 细胞培养（Cell Culture ） 器官培养（Organ Culture ）

分类: ◆ 组织培养(Tissue Culture) 指的是从体内取出组织，在模拟体内生理环境，无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法 ◆ 细胞培养(Cell Culture) 培养物是单个细胞和细胞群 ◆ 器官培养（Organ Culture） 培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法

研究体内相应器官、组织和细胞的正常和异常生命活动 失去了神经体液调节和细胞间相互作用，缺乏动态平衡 ◆ 体外培养细胞的目的是什么？应用价值 研究体内相应器官、组织和细胞的正常和异常生命活动 ◆ 体外培养细胞与体内细胞有否差异？ 增殖方式相同：有丝分裂 差异的关键：细胞的分化 ◆ 人工模拟条件与体内环境的差异？ 失去了神经体液调节和细胞间相互作用，缺乏动态平衡

（2）传代与原代培养？ ◆ 传代：（subculture） 体外培养细胞生存空间和营养有限，当细胞增殖达到一定密度后，需要分出一部分细胞或更新培养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。 ◆ 原代培养（primary culture） 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。

（3）代与细胞周期？ ◆ 代（subculture generation）：指从细胞分离接种到分离再培养时的一段时间；通常细胞要分裂3～5次，传一次即一代。 ◆ 细胞世代（generation）：一个cell cycle

(life span of culture cells) ●原代培养细胞的生命归宿● 培养细胞的生命期 (life span of culture cells) ★ 原代培养期 ★ 传代期 ★ 衰退期 ☆ 有限细胞系？ ☆ 无限细胞系？

◆原代培养期 也称初代培养期，指从体内取出组织接种培养到第一次传 代的阶段，一般持续1－4周。此期细胞移动比较活跃，可 见细胞分裂，但不旺盛。 初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似 性大。细胞群是异质的（Heterogeneous），也即各细胞 的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。 初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内 细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。　

◆传代期 原代细胞生长一定时间后，贴壁型细胞就会连接成片而铺 满瓶底，需要将原代细胞分开至多个新的培养瓶中，这个 过程叫传代。传代后的细胞称细胞系（初代培养细胞一经 传代后便改称做细胞系（Cell Line）） 。 此期的细胞系生长过程中持续时间最长，细胞增殖旺盛并 维持二倍体核型。 为保持二倍体细胞性质，细胞应在原代培养或传代后早期 冻存。

◆衰退期 此期细胞仍生存，但不增殖或增殖很慢，最后衰退死亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。 转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite Cell Line），也称连续细胞系（Continuous Cell Line）。 无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）.细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。

培养细胞生命期 原代培养 传代期 衰退期

◆ 每代细胞的生长过程 所有体外培养的细胞包括原代培养和各种细胞系（株），生长达到一定的密度后都要做传代处理。传代的频率和间隔与接种细胞数量、细胞生物学性质以及营养液性质等有关。 细胞一代指从细胞培养接种到分离再培养的一段时间。每代细胞一般要经过三个生长阶段：潜伏期、指数生长期和停止期。

◆ 潜伏期 细胞接种扩新的培养器皿后，胞质回缩，胞体五圆球形，先悬浮于培养液中，稍后开始附着于底物，逐渐恢复原来的状态。 此时细胞具有代谢及运动功能，但无增殖发生。以后出现细胞分裂并逐渐增多而进入指数生长期。

又称对数期，此期细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，适用于进行实验研究。 ◆ 指数生长期 又称对数期，此期细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，适用于进行实验研究。 一般可持续3－5d。

又称平台期，此期细胞已将其支持物表面占满，细胞活力减弱，已不再进行分裂增殖。 ◆ 停止期 又称平台期，此期细胞已将其支持物表面占满，细胞活力减弱，已不再进行分裂增殖。 此时应进行传代培养，将细胞接种到新的培养器皿中，开始再次繁殖，进入新的一代。

细胞一代 停止期

（4）细胞系？ ◆ 细胞系（cell line） 初（原）代培养物第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。 ◆ 有限细胞系（finite cell line） 细胞系的生存期有限，不能连续传代培养，大多为二倍体细胞。（Hayflick界限） ◆ 无限（连续）细胞系（infinite cell line） 已获得无限增殖能力能持续生存、连续传代的细胞系。大多已发生异倍化，具异倍体核型。

（5）细胞转化（transformation） ◆ 细胞转化 正常细胞在致变因素作用下，发生了遗传型改变和表型的变化（涉及DNA或基因的改变）。细胞发生转化后的性状可代代相传。 可分为：自发转化（原因不明） 人工诱变（物理、化学、生物诱变剂） ◆ 一般转化：细胞获得不死性，尚无恶性 ◆ 恶性转化：有致瘤性 不仅能自主增殖，还呈现侵袭性生长和转移性。 细胞转化或基因突变不一定就是癌变！

（6）细胞克隆与细胞株 ◆ 细胞克隆（cell clone） 由单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体。 ◆ 细胞株（cell strain ） 通过选择法或克隆形成法，从原代培养物或细胞系中获得的稳定的具有特殊性质或标志的培养物。 如：温度敏感突变株

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1907，美国的哈里森使用盖玻片悬滴培养蛙胚神经组织细胞 二、动物细胞与组织培养发展历史 动物细胞培养之创始 1907，美国的哈里森使用盖玻片悬滴培养蛙胚神经组织细胞 蛙胚延髓组织 培养在青蛙淋巴凝块内

1885年Roux最早尝试使组织离体培养，材料是鸡胚神经板，采用生理盐水为培养液，并首次采用组织培养这个术语。 1907年Harrison 和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法，用于研究离体动物细胞的培养。 由于组织培养在医学研究中的应用，如抗病毒疫苗的生产等，现已经逐渐发展成为一门精细技术。许多细胞株、细胞系的培育成功，尤其是以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如HeLa细胞系（Gay，1952），可用来进行一系列研究，更加促进了组织培养技术的发展。

细胞培养的优点 ⑴ 理化环境可控制。 ⑵ 细胞经培养后形成的细胞系和细胞株，特征均一。 ⑶ 培养物可直接被观测。 ⑷ 提供大量均一的细胞供制备用。 ⑸ 便于进行人工筛选。 ⑹ 结合电影技术，可观察细胞代谢活动和反应。 广泛应用于病毒学，免疫学，遗传学，肿瘤学，分化及发 育，细胞毒理试验，生物技术等各个领域。

细胞培养的缺点 现人工模拟体内环境的技术已经很高, 但, 人工所模拟的条件与体内实际情况 仍不完全相同. 当细胞被置于体外培养后, 生活在缺乏动态平衡的环境中, 久了，必然发生变化.

◆ 与体内主要不同 相对孤立、相对单一 缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节 和细胞相互间的影响 ◆ 主要表现 失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显；细胞趋向单一化； ◆ 提示 要正确认识体外培养细胞 是一种特定条件下生长的细胞群体。

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三、动物细胞特点及其体外培养特性

1. 体外培养细胞的生长条件 环境无毒和无菌； 适宜的温度；人和哺乳动物培养细胞最适温度均为35－37℃。 气体环境和氢离子浓度；需要一定量的O2（1995－9975pa）和CO2（95％空气+5%CO2）；pH7.2-7.4 渗透压；260－320mOsm/kg适用于大多数细胞 营养物质；六碳糖是主要的能源物质，还需要12种基本氨基酸和谷胺酰胺等

2.体外培养细胞的分型 根据形态特征分类 贴壁型 上皮细胞型 成纤维细胞型 游走细胞型 多形细胞形 悬浮型 悬浮在溶液中

体外细胞培养物的生长类型 按生长方式：主要分两型 1）贴附型细胞:附着在某一固相支持物表面才 能生长的细胞。 1）贴附型细胞:附着在某一固相支持物表面才 能生长的细胞。 2）悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而 在悬浮状态下即可生长的细胞。 绝大多数有机体细胞属贴附型细胞， 只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞 可在悬浮状态下生长

1）贴壁依赖型（贴壁细胞） 贴附是有机体细胞在体内生存和生长发育的基本方式，包括细胞与细胞之间的相互接触和细胞与细胞外基质之间的相互接触两种方式。体外培养时大多数细胞仍然保持了这种特性，必须贴附在一定的支持物上才能生长。 根据体培养细胞在支持物上贴附生长时的形态，大致分为四种类型：包括上皮细胞型（epithelium）、成纤维细胞型（fibroblast）、游走细胞型（wandering）、多形细胞（polymorphiet）

上皮细胞　 细胞培养时呈扁平的不规则多角形，中央有圆形核，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片，如皮肤表皮细胞、肝细胞、胰脏细胞和肺泡上皮细胞的培养细胞。

成纤维细胞型 细胞贴壁后呈梭形或不规则三角形，中央有圆形核，胞质向外伸出2－3个长短不同的突起，生长时呈放射状或火焰状。除真正的成纤维细胞外，心肌、成骨肌细胞培养时均属这一类型。

游走细胞型 细胞质常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，贴附于支持物上散生，一般不连接成片。单核细胞、巨噬细胞及某些肿瘤细胞在体外培养常呈现此种形态。

多形型细胞 生长时像神经细胞呈多角形，并伸出较长的神经纤维，很难确定它们的形状。体外培养时常见的多形型细胞是神经元和神经胶质细胞。

2）悬浮型 也称非贴壁型，这类细胞培养时不贴附于支持物上，可在培养液中悬浮生长。来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞等均属于此类，细胞一般呈球形。 优点 生存空间大，提供数量大 传代方便(不需消化)； 易于收获 可获得稳定状态 缺点 观察不方便； 很多细胞不能悬浮生长

◆贴附生长型细胞的形态不稳定 3）兼性贴壁细胞 动物细胞培养中，有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可以悬浮培养，如中国地鼠卵巢细胞、小鼠L929细胞等。 ◆贴附生长型细胞的形态不稳定 条件改变，细胞形态可有变化

◆培养细胞形态不稳定 血清 Hela 高血清 低血清 成纤维细胞样 上皮样细胞 pH Hela 太酸或太碱 标准pH 成纤维细胞样 上皮样细胞 细胞密度 3T3 低密度 高密度 成纤维细胞样 上皮样细胞 生长状态改变 悬浮或贴附 悬浮 贴附 圆形 成纤维或上皮样 转化与否 未转化 转化后 成纤维样 可成上皮样

3、体外培养细胞的生长特点 1）贴附 细胞贴壁过程

2）接触抑制和密度抑制 定义：细胞从接种到 长满底物表面后，由 于细胞繁殖数量增多 相互接触后，不再增 加。

4、培养细胞的生长与增殖过程 1）单个细胞的生长过程

2）细胞系的生长过程 培养群体细胞的生命期 ★ 原代培养期 ★ 传代期 ★ 衰退期

3）每代细胞的生长过程

◆ 潜伏期（Latent phase）： 细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。 二倍体细胞该期时间长（24~96h）； 连续细胞系时间短（10~30min）。 ● 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 ● 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。

细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究 ◆ 指数生长期（Logarthmic growth phase）： 细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指数（Mitotic index，MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数介于0.1~0.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、温度等影响。 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究

指数生长期是细胞活力最好的时期，在接种细胞数量适宜情况下，指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制（Contact inhibition）。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区分正常与癌细胞标志之一。 癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑制（Density inhibition）

◆ 停止期（平台期） 机制：接触抑制、密度依赖性 细胞达饱和密度, 可存活 仍有代谢活动，但基本不分裂， 细胞数量维持在某一水平上， 生长 活动停滞 机制：接触抑制、密度依赖性

5、培养细胞的遗传学特征 二倍体细胞 异倍体 干系 标记染色体 巴氏小体 Y小体 干系：当某一核型的细胞在该细胞群体中居多数时，具有该数值染色体数的细胞群称为干系 标记染色体：在各类培养细胞中，有时可见异形染色体；如：双着丝点、环形染色体、长臂或断臂缺失等，当某一特殊形态的染色体不断反复出现并占很大比例时，这种染色体称为。。。 巴氏小体：女性的两条X染色体有一条在间期明显异固缩，呈三角形或半月状小体，紧贴在核膜内侧 Y小体：男性Y染色体在间期形成颗粒状Y小体，位于胞核的近中央部位

6、体内外细胞的差异 总体： 与体内仍有相似-- 体外培养的细胞仍存在细胞和细胞、 细胞和基质的相互关系 与体内仍有相似-- 体外培养的细胞仍存在细胞和细胞、 细胞和基质的相互关系 但有不同 相对孤立、相对单一 失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显

相同点： ◆ 培养的细胞之间 仍有在形态和机能上的相互依存关系。 在结构上，如：上皮细胞仍见有桥粒 在生理活动上，单个细胞虽能生长繁殖,但不如群体细胞能力强，当相邻细胞接触，便导致运动停止 ◆ 培养的细胞对细胞外基质仍有依存性

不同点： ◆ 失去原有组织结构和细胞形态 如：肌肉细胞—纤维化 ◆ 分化减弱或不显 出现类似“返祖”现象：细胞趋向单一化 或获得不死性或变成具有恶性性状的细胞群 ◆ 因此要正确认识体外培养细胞 是一种特定条件下生长的细胞群体

7、培养细胞分化的改变 不适应（Deadaption） 脱分化（去分化）（Dedifferentiation） 细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不显。例如肝细胞在体外丧失了产生酪氨酸转移酶的特性。 脱分化（去分化）（Dedifferentiation） 由于基因变异而使细胞失去分化能力。如肝细胞失掉产生精氨酸酶及氨基酸转移酶的特性后，储存肝糖元的能力丧失，并很难再现。

不适应和脱分化两个概念不同： 不适应是因为生存条件改变而使分化发生抑制；而从分子水平考虑，脱分化很可能是基因变异所致。