高效液相色谱法测定食品中的 防腐剂和甜味剂 High performance liquid chromatography 复旦大学 化学教学实验中心 雷 杰

内容提要 高效液相色谱法(HPLC)的特点 高效液相色谱法的主要类型和原理 高效液相色谱仪 色谱柱简介 色谱理论基础 实验内容

一、高效液相色谱法(HPLC)的特点 历史回顾 固定相、流动相；气相、液相。 1906 - Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919) 碳酸钙吸附剂 石油醚 1940‘s - 分配色谱和纸色谱 1950‘s - 气相, 薄层，凝胶过滤色谱 梯度洗脱色谱 1960‘s - 商业高效液相色谱. M.S. Tswett. Ber. Dtsch. Bot. Ges. 24: 384-393 (1906) 色谱历史回顾： 出现： 1903年，俄国植物学家Tswett（茨维特）研究植物叶子组成，用碳酸钙作吸附剂，分离植物干燥叶子的石油醚萃取物，发现三种颜色六条色带，他把这种色带称为“色谱”。1906年，发表于德国植物学杂志，属于液固色谱法。 发展： 1940年，Martin和Synge提出液液分配色谱；1941年，Martin和Synge提出气相色谱可能性；1944年，Consden发展了纸色谱；1949年，Macllean制作薄层板，使薄层色谱法TLC得以应用；1952年，Martin和Synge发展了气相色谱，并获得诺贝尔化学奖；1956年，Stahl开发薄层色谱板涂布器，使TLC广泛应用；60年代末，出现了商业高效液相色谱HPLC，但是由于泵、检测器的发展滞后，使得HPLC在80年代以后才得以迅速发展。

高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论；在技术上，流动相改为高压输送；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。高压液相色谱的特点有：

1. 高压：液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对流动相施加高压。 2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。 3. 高效：颗粒极细（一般为10 mm以下）、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高。 4. 高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。 5. 适应范围宽：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。 据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。

二、高效液相色谱法的主要类型和原理 （一）主要类型 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC） 化学键合相色谱法(bonded phase chromatography；BPC) 亲合色谱法（affinity chromatography；AC） 手性色谱法（chiral chromatography；CC） 胶束色谱法（micellar chromatography；MC） 电色谱法（electrochromatography；EC） 色谱历史回顾： 出现： 1903年，俄国植物学家Tswett（茨维特）研究植物叶子组成，用碳酸钙作吸附剂，分离植物干燥叶子的石油醚萃取物，发现三种颜色六条色带，他把这种色带称为“色谱”。1906年，发表于德国植物学杂志，属于液固色谱法。 发展： 1940年，Martin和Synge提出液液分配色谱；1941年，Martin和Synge提出气相色谱可能性；1944年，Consden发展了纸色谱；1949年，Macllean制作薄层板，使薄层色谱法TLC得以应用；1952年，Martin和Synge发展了气相色谱，并获得诺贝尔化学奖；1956年，Stahl开发薄层色谱板涂布器，使TLC广泛应用；60年代末，出现了商业高效液相色谱HPLC，但是由于泵、检测器的发展滞后，使得HPLC在80年代以后才得以迅速发展。

（二）化学键合相色谱法 通过特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面，现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。 以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法。 化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相。 优点： （1）固定相的均一性和稳定性好，在使用过程中不易流失，使用周期长； （2）柱效高；重现性好； （3）能使用的流动相和键合相的种类多，分离的选择性高 根据化学键合相与流动相极性的相对强弱 正相（normal phase，NP）和反相（reversed phase，RP）键合相色谱法：

（三）反相键合相色谱法 固定相：非极性键合相 流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键合硅胶 流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂 常用甲醇-水、乙腈-水体系等 应用：广。非极性至中等极性的组分，（还有有机酸、碱及盐等）

保留行为的主要影响因素 1、溶质的分子结构（极性） 2、固定相 极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。

3、流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大 溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂 溶剂比例：水的比例增加，使k增大 pH：影响弱酸、弱减的离解 流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱碱相反。

三、 高效液相色谱仪 高压输液/溶剂传输系统 样品进样/引入系统 样品分离系统 信号检测系统 数据处理系统 Agilent HPLC1100五个主要部分: 高压输液/溶剂传输系统 样品进样/引入系统 样品分离系统 信号检测系统 数据处理系统 仪器配置:在线脱气机、四元泵、多波长紫外检测 器、柱温箱、手动进样器、20 mL HPLC进样环。

Agilent HPLC1100堆积配置图

Load Inject Sample Syringe To Waste To Waste Column Sample Loop From (Fixed Volume) From Column Sample Syringe Load Inject Pump From Pump To Waste

Agilent 1100 数据处理系统（略） 见课堂讲解

四、 色谱柱简介 微型化 制备柱 锥形柱 填料

柱长、内径 柱长：一般为2.0-250 mm，柱越长，分离度越高，但柱压更高，分离所需时间更长。 分离度和理论塔板数的平方根成正比，所以增加柱长并不是最有效的分离手段。一般情况下20 cm、5 mm填料可以提供足够的理论塔板数。 内径：小于1 mm的为毛细管柱；4.6 mm的分析柱；大于10 mm的半制备或者制备色谱柱。 不同仪器设备配制由相应的最佳流速，因此适用于不同内径的色谱柱。如果配制不匹配，则柱外效应会放大。

色谱柱填料简介 常用基质： 硅胶 其他无机基质材料（氧化铝、氧化锆等） 有机高分子基质填料（多糖型、聚苯乙烯等） 微米球颗粒 整体柱

键合方式： 封端：（目的是减小残留硅羟基） 通过特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面，现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。 封端：（目的是减小残留硅羟基）

五、色谱理论基础 色谱参数 色谱过程热力学 －定性和定量：保留时间和峰面积（峰高） tR(B) - tR(A) 分离度 tR-t0 容量因子 Detector Response Time A B W Inject t0 tR(A) tR(B) t = 保留时间 t = 死时间 R W = 峰底宽度 tR(B) - tR(A) WA + WB R = 2 W1/2A + W1/2B = 1.176 K’= tR-t0 分离度 容量因子 色谱过程热力学 死时间t0：完全不保留组分流出系统的时间。 液相色谱中死时间的几种测定方法： 1.有响应的溶剂出峰时间为死时间； 2.进样后的阀切换峰，对应的时间为死时间； 3.工作站中输入柱子的空余体积，自动计算。 （对于C18柱，也可以用硝酸钠或硫脲来测定）

tR为样品的保留时间；Wb为峰底宽；tR‘为调整保留时间；L色谱柱长度。 色谱过程动力学 之 塔板理论 塔板高度 H＝L/n 理论塔板数 有效塔板数 tR为样品的保留时间；Wb为峰底宽；tR‘为调整保留时间；L色谱柱长度。

色谱过程动力学 之 速率理论 1956年范·第姆特（Van Deemter）根据物料平衡导出了： 塔板高度H与线速度u的关系图 色谱过程动力学 之 速率理论 1956年范·第姆特（Van Deemter）根据物料平衡导出了： 其中u为流动相线速度，A为涡流扩散项因素，B为纵向扩散项系数，Cm、Cs分别为流动相和固定相传质阻力项系数。 塔板高度H与线速度u的关系图

吉丁斯（Giddings）等人导出了液相色谱的速率方程如下 ： 停滞流动相的传质阻力项 流动相传质阻力项 涡流扩散项 纵向扩散项 固定相传质阻力项

六、 实验内容 防腐剂，苯甲酸和山梨酸及其盐类都是常用食品防腐剂，糖精钠是食品中常用的人工甜味剂。 我国食品卫生标准规定苯甲酸和山梨酸在饮料中最大使用量均为0.2 g/kg。糖精钠最大使用量为0.15 g/ kg。 我国对以上三种食品添加剂测定的标准方法有：薄层色谱法、气相色谱法及高效液相色谱法， 而高效液相色谱法可以对各种添加剂同时测定，具有高效、高速、高灵敏度及高自动化等特点。 本实验采用高效液相色谱配合多波长紫外检测器，反相色谱法同时测定上述三种食品添加剂，利用保留值定性，外标法定量。