肽链合成后的加工和输送 化学工业出版社 www.cip.com.cn

在核糖体上直接合成的蛋白质通常没有生物活性，新生肽链在合成的同时或合成后，需要经历多种多样的生化事件, 才能成为具有特定结构和功能的成熟蛋白质。蛋白质的成熟可以理解为以下几层含义：一是蛋白质正确三维构象的形成；二是对氨基酸残基进行修饰，使蛋白质表现出其应有的生物活性；三是蛋白质被输送到机体或细胞的正确部位。蛋白质的成熟所需要经历的生化事件包括肽链的剪切、新生肽链的折叠、二硫键的形成、蛋白质氨基酸残基的糖基化作用、羟基化作用、磷酸化作用等多种化学修饰，以及蛋白质被输送到细胞内或细胞外的特定部位等，这些事件统称为肽链合成后的加工与输送，其中加工影响的是蛋白质的结构，输送影响的是蛋白质的分布，此二者均为蛋白质执行正常的生理功能所必需。

10.1 肽链合成后的加工 肽链合成后的加工指的是肽链在核糖体上合成后，经过细胞内各种修饰处理，成为有生物活性的成熟蛋白质的过程。对新生肽链的加工方式可分为三类：对肽链主链的修饰处理，即肽链的剪接；对氨基酸残基的修饰，包括泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙酰化作用等；蛋白质高级结构的形成，包括多肽链的折叠、亚基聚合及辅因子（如金属离子、各种辅酶等）的添加。

10.1.1 肽链的剪接 肽链的剪接是在特定的蛋白水解酶的作用下，切除肽链末端或中间的若干氨基酸残基，使蛋白质一级结构发生改变，进而形成一个或数个成熟蛋白质的翻译后加工过程。常见的肽链的剪接方式有： （1）肽链N端fMet或Met的切除 蛋白质刚刚被合成时，都以fMet（formyl Met，见于原核生物）或Met（见于真核生物）开始。肽链合成后，其N端的fMet或Met残基通常在氨肽酶的催化作用下被切除，部分原核生物的蛋白质保留Met，但需要在脱甲酰酶的作用下去除甲酰基。 （2）信号序列的切除 需要被运输到各细胞器及细胞外的蛋白质N端一般有一段信号序列，用于指导蛋白质的输送（详见下一节），这一信号序列通常在完成任务后被相应的蛋白水解酶切除。

（3）蛋白与多肽前体的剪切 胰岛素、甲状旁腺素、生长激素等激素先合成无活性的前体，经蛋白水解酶切去部分肽段而成熟。如新合成的前胰岛素原（preproinsulin）在内质网中被切除信号系列，成为由A链（含21个氨基酸残基）C链（含33个氨基酸残基）和B链（含31个氨基酸残基）三个连续的片段构成的胰岛素原（proinsulin），被转运到胰岛细胞的囊胞中，C链被切除，A、B链通过3个二硫键连接为成熟的胰岛素（图10-1）。多种消化酶（如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等）以及与血液凝固相关的凝血因子在合成后，以无活性的酶原形式存在，需要切除部分氨基酸残基，才能成为有活性的酶，这一过程又称为酶原激活。由中枢性（如下丘脑、丘脑等）神经元产生的促阿黑皮素原（proopiomelanocortin, p-OMC）是一条大肽链，通过剪切可以产生促黑激素（MSH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、-内啡肽等多种成熟产物。HIV病毒在宿主体内复制时，其基因组的表达产物gag-pol为一条多肽链，需要在HIV病毒携带入宿主的蛋白酶的水解作用下，分裂为数种病毒生长和感染宿主细胞所需的成熟蛋白质。

（4）蛋白质的剪接 指前体蛋白中间的蛋白质肽段被剪切出来，其两侧的肽链通过新的肽键连接起来，形成成熟蛋白质的加工过程，两侧的肽链称为外显肽（extein），被切除的中间肽段称为内含肽（intein），具有自我催化功能，其两端含有的保守性较强的特殊序列可激活内含肽N 末端和C 末端剪接处肽键的断裂以及外显肽之间新肽键的形成。蛋白质的剪接属于自我催化反应，包括分子内的转换、中间产物的形成、Asn的环化、肽键的断裂和形成等步骤，其中肽键的断裂和形成是蛋白质剪接的关键反应。蛋白质剪接不同于RNA剪接（前者发生在蛋白质水平，后者发生在mRNA水平），也不同于胰岛素原的剪切（胰岛素的A链和B链在剪切后不以肽键相连，而是通过二硫键连在一起）。蛋白质的剪接可发生于细菌与真菌蛋白质，如酵母液泡H+-ATP酶亚基、T. Litoralis DNA多聚酶、红海束毛藻的RIR基因产物、集胞藻DNA聚合酶、结核杆菌recA基因产物亚基等的加工过程，也见于伴刀豆球蛋白A等高等生物蛋白质的加工过程中。

10.1.2 氨基酸残基的修饰 在生物细胞中有几十多种针对蛋白质氨基酸残基的修饰途径，均在相关酶的催化作用下完成，常见的有以下几种： （1）泛素化 泛素由76个氨基酸组成, 高度保守, 普遍存在于真核细胞内，故名泛素，共价结合泛素的蛋白质能被特定的蛋白酶识别并降解, 这是细胞内蛋白降解的普遍途径。在泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素蛋白质连接酶（E3），的连续传递作用下，泛素的羧基末端通过异肽键与靶蛋白Lys残基的-氨基连接在一起。

（2）磷酸化 磷酸化是在蛋白激酶的催化作用下，将ATP 的-磷酸基转移到蛋白特定位点上的过程，磷酸化的作用位点为蛋白上的Ser、Thr、Tyr 残基侧链，反应过程见图10-2。磷酸化的逆过程为去除磷酸基的水解反应，由磷酸水解酶催化。蛋白质的磷酸化修饰常发生于成熟的蛋白质中，是生物体内调控酶活性的重要手段。蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程几乎涉及所有的生理及病理过程，如新陈代谢、信号转导、肿瘤发生、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等。

（3）糖基化 蛋白质的糖基化是在一系列糖基转移酶的催化作用下，蛋白上特定的氨基酸残基共价连接寡糖链的过程，氨基酸与糖的连接方式主要有O 型连接与N 型连接两种（图10-3）。

N型连接始于内质网，是在内分泌蛋白和膜结合蛋白的天冬酰氨残基的氨基上结合寡糖（通常是一个由N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖和葡萄糖形成的14糖的核心寡糖），普遍认为N 型连接发生在蛋白的Asn-Xaa-Ser/Thr（Xaa 为除脯氨酸外的所有氨基酸残基）序列上，核心寡糖与多肽链的结合进行于多肽链合成过程中，而且是由脂质载体-多萜醇磷酸（dolichol phosphate）直接转移到天冬酰胺残基侧链上的，N型寡糖链的具体合成与转移过程如图10-4所示。N 型连接的核心寡糖链在内质网与高尔基体中会受到进一步的修饰，部分糖分子被切除，新的糖分子被添加。

 2分子活化的N-乙酰葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）连续加到结合于内质网膜上的多萜醇磷酸上，形成多萜醇焦磷酸寡糖； 5分子活化的甘露糖（GDP-Man）加到多萜醇焦磷酸寡糖末端，并形成分支； 含有7个糖残基的多萜醇磷酸寡糖在膜上移位，翻转到内质网腔内； 4个甘露糖残基与3个葡萄糖残基由多萜醇磷酸载体上转移到正在增长的寡糖核心分子上，该载体同样由细胞质侧移位而来； 14糖的核心寡糖转移到进入内质网的多肽链的天冬酰胺残基侧链上； 释放出的多萜醇焦磷酸分子进行移位，转移到内质网膜的细胞质侧，并失去一个磷酸基团形成多萜醇磷酸，可参与下一轮核心寡糖链的合成。

O 型连接多发生于临近脯氨酸的丝氨酸或苏氨酸残基上，通常以逐步加接单糖的形式形成寡糖链，O型连接反应发生于细胞内两个部位, 一是高尔基体上, 一是细胞核或细胞质中，发生在高尔基体上的糖基化始于在丝氨酸或苏氨酸侧链羟基上连接N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖、海藻糖等的还原端，对进入高尔基体的分泌蛋白和膜结合蛋白来说，其O 型糖基化发生于N 型糖基化及蛋白折叠之后, 在高尔基体顺面上完成，发生在细胞核和细胞质中的O型糖基化是在丝氨酸或苏氨酸残基上连接N-乙酰葡萄糖胺。糖基化是许多蛋白质的准确转运所必需的，糖基化的蛋白及其上的糖链在许多生物过程中起着重要作用，如免疫保护、细胞分裂、细胞生长、细胞之间的黏附、炎症的产生等。

（4）脂酰基化 蛋白质的脂酰基化是长脂肪酸链通过O 或者S 原子与蛋白质共价结合得到蛋白复合物（脂蛋白）的过程, 例如蛋白质分子中半胱氨酸残基的侧链巯基可被棕榈酰化, 甘氨酸残基可被豆蔻酰化，通过脂肪酸链与生物膜良好的相溶性, 可使蛋白质固定在细胞膜上。脂蛋白是一类膜结合蛋白, 其特定的脂酰基化修饰可帮助这类蛋白在细胞膜上定位, 并进一步协助该蛋白发挥生物功能。

（5）甲基化 蛋白质的甲基化修饰是在甲基转移酶催化下, 将S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到赖氨酸或精氨酸侧链上，另外也可对天冬氨酸或谷氨酸侧链羧基进行甲基化，形成甲酯的形式。甲基化对蛋白质的功能及其参与的生命过程具有重要的调节作用，例如组蛋白的甲基化同转录调节和异染色体的形成有关，不仅在真核细胞染色质的遗传外修饰中占有中心地位, 对细胞分化、发育、基因表达、基因组稳定性及癌症的产生等均有一定影响，蛋白质甲基化的异常或甲基转移酶的突变常会导致疾病。

（6）乙酰化 蛋白质氨基酸残基的乙酰化在乙酰转移酶的催化作用下进行，例如组蛋白的乙酰化修饰发生在核心组蛋白N 端的赖氨酸残基，由组蛋白乙酰转移酶催化, 去乙酰化则由组蛋白去乙酰酶催化。核心组蛋白N 端的赖氨酸在生理条件下带正电，可与带负电的DNA 或相邻的核小体发生作用，导致核小体构象紧凑及染色质高度折叠，乙酰化使组蛋白与DNA 间的作用减弱, 导致染色质构象松散，这种构象有利于转录调节因子的接近, 从而可以和转录因子结合, 促进基因的转录，去乙酰化则抑制基因转录。 （7）羟基化 在结缔组织的胶原蛋白和弹性蛋白中，脯氨酸和赖氨酸可经过羟基化修饰成为羟脯氨酸和羟赖氨酸，位于粗面内质网上的三种氧化酶（脯氨酰-4-羟化酶、脯氨酰-3-羟化酶和赖氨酰羟化酶）负责特定脯氨酸和赖氨酸残基的羟基化，胶原蛋白的脯氨酸残基和赖氨酸残基的羟基化需要维生素C，饮食中维生素C不足时就易患坏血症（血管脆弱，伤口难愈），原因就是胶原纤维的脯氨酸和赖氨酸无法羟基化，从而不能形成稳定的结构。

（8）腺苷酸化 在腺苷酰转移酶的催化作用下，将ATP中的腺苷酸基团（AMP）转移到蛋白质的氨基酸残基侧链上，称为腺苷酸化，蛋白质的腺苷酸化可用于调节蛋白质的生物活性，例如在氨基酸的合成代谢中，谷酰氨合成酶的活性可利用腺苷酸化作用调控，当该酶的一个酪氨酸残基被腺苷酸化修饰后，酶即失去活性，去腺苷酸化可使酶获得活性。 此外，有些蛋白质的Glu可以被羧基化，如凝血酶原的N-端有多个羧基化的Glu。有些寡肽激素C-端的Gly残基被酰胺化，从而使其半寿期得以延长。

10.1.3 多肽链的折叠 在生物体内，新生肽链在核糖体上生成后，需要正确地进行折叠，才能形成有特定空间构象和生物学功能的成熟蛋白质。蛋白质的折叠指的是肽链经过疏水塌缩、空间盘曲、侧链叠集等行为形成蛋白质的天然构象，同时获得生物活性，折叠是蛋白质构象变化的一种行为。 1961年，Anfinsen核糖核酸酶的体外变性和复性试验，提出“蛋白质折叠的信息包含在氨基酸顺序中”，即蛋白质的一级结构决定高级结构的著名假说，此后许多研究结果证实了这一观点所具有的普遍意义。根据Anfinsen的假说，蛋白质分子中氨基酸的排列顺序不仅决定了蛋白质的最终构象，还指导了蛋白质分子的折叠过程。新生肽链要实现正确的折叠，就要依赖于氨基酸序列本身所包含的信息以及诸细胞因子对这些信息的识别和调控。

尽管目前还无法直接研究在生物体内肽链的折叠过程，但通过对蛋白质体外折叠的研究，人们已经了解蛋白质的体内折叠所必须遵从的一些基本准则，例如： 蛋白质的折叠不是随机尝试所有可能的构象直到遇到最适构象，蛋白质能在一个很短的时间范围内折叠，一定是受到某种方式的指导，沿着特定的动力学途径进行。 多数具有复杂结构的蛋白质的折叠是一个序变过程，蛋白质折叠要经历中间状态。蛋白质在折叠过程中产生的中间态应被保护，以防止降解作用或其它与折叠相互竞争的作用。 从热力学角度看，蛋白质折叠过程是一个自由能和构象熵均逐渐减少的过程，成熟蛋白质的构象通常是单一的。 在整个肽链合成完毕之前，新生肽链的错误折叠或分子间的相互作用应该被抑制； 要穿过膜进行输送的蛋白的折叠需要在通过生物膜之后进行； 寡聚蛋白各亚基的折叠要相互调节以形成正确的寡聚体等； 蛋白质的合成与折叠并不是彼此分离的行为，许多蛋白质的折叠是随着新生肽链的延伸过程同步进行的。

同在体外一样，在体内蛋白质的折叠总是同错误折叠及蛋白质的聚沉相竞争（图10-5）。在活体细胞内，生物分子的浓度非常高，称为大分子拥挤，这更增加了蛋白质折叠的困难度与蛋白质的聚沉倾向。生物的进化必然会创造一种机制克服这些问题，研究发现，多数新生肽链的折叠需要其他细胞因子（主要是蛋白质）的帮助，帮助其他蛋白质进行折叠的蛋白质分为折叠酶和分子伴侣两类，只有少数新生肽链的折叠不需要折叠酶和分子伴侣。

折叠酶包括二硫键异构酶（Protein Disulfide Isomerase，PDI）和肽酰脯氨酰顺反异构酶（Peptidyl-prolyl cis-trans Isomerase，PPI）。许多蛋白质特别是分泌蛋白均含有二硫键，二硫键形成于相同或不同肽链的两个半胱氨酸残基侧链之间，正确二硫键的形成对于蛋白质的结构及功能具有重要作用。PDI催化蛋白质中二硫键的形成、还原和异构化反应，因此是二硫键依赖的蛋白质折叠的关键因素。PDI主要存在于内质网中，在内质网的氧化环境中PDI催化折叠过程中新生肽链二硫键的氧化以及异构化不正确的二硫键，它能加速蛋白质折叠，但不影响蛋白折叠途径。 对于一些蛋白质来说，不正确Xaa-Pro肽键（Xaa指任一种非Pro残基）的异构化是其折叠的限速步骤，1984年，Fischer首次从猪肾中分离纯化到一种新的蛋白质，这种蛋白质能够有效加速短程的脯氨酰肽键顺反异构化，故命名为肽酰脯氨酰顺反异构酶，它可以催化脯氨酰之前的C-N肽键180o反转，同时不涉及新共价键的形成和断裂，所以PPI是一种高效折叠酶，同样能加速蛋白质的折叠，但不影响蛋白折叠途径。

分子伴侣(molecular chaperon)是一类帮助新生肽链折叠和组装的蛋白质分子的总称。分子伴侣通过与其底物蛋白的结合与释放，参与其在体内的正确加工与输送过程：折叠、寡聚体的装配、输送到细胞内特定的部位、在活性/非活性构象之间进行可控转换等。分子伴侣不含有蛋白质正确折叠的空间信息，但是能够阻止非天然蛋白质分子内或分子间的不正确相互作用（如蛋白质分子的聚沉），从而增加蛋白质正确折叠的机率。与折叠酶相比，分子伴侣并不加快蛋白质的折叠反应速度。分子伴侣能够识别并有选择性地结合非天然态的蛋白质，与蛋白质形成相对稳定的复合物，将蛋白质与拥挤的细胞环境相隔离，为蛋白质提供折叠的内环境。在大多数情况下分子伴侣利用结合并水解ATP产生的能量使自身与靶蛋白解离，释放折叠好的靶蛋白。 分子伴侣能识别错误的蛋白构象，使分子伴侣能够扮演两个与蛋白质折叠有关的角色：其一，当一个蛋白刚开始在核糖体上合成时，它以未折叠的形式出现，新产生的序列会与已合成的序列相互作用，从而发生自发的折叠，分子伴侣通过控制蛋白活性表面的可及性（accessibility）来影响折叠的过程，这一过程与最初正确构象的获得有关。其二，当蛋白质变性时，新的区域被暴露并且可以相互作用，这些相互作用会被分子伴侣标记为错误折叠，并采取措施帮助其复性或介导其降解。

目前已发现数量众多的蛋白质及非蛋白质分子（如糖、脂、RNA）具有分子伴侣活性，常见的分子伴侣中包括Hsp90、Hsp70和Hsp60家族成员（HSP 是热激蛋白Heat Shock Proteins的简称）。Hsp90家族成员存在于所有的原核与真核细胞中，在真核细胞的细胞质中含量丰富，对细胞的生存是必需的，它们参与新生肽链的折叠，可以防止蛋白折叠过程中的聚合，还和许多重要的调节蛋白结合，参与细胞分裂和细胞凋亡，并在激素介导的信号转导中起重要作用。Hsp70家族成员（如DnaK与DnaJ）可与高度去折叠或错误折叠的多肽结合，阻止聚沉并帮助其重新折叠，在蛋白质重组及降解过程中均有重要作用，还是帮助蛋白质跨膜转运入特定细胞器的重要成分。Hsp60家族成员存在于真核生物的线粒体与叶绿体中，在原核生物E. coli的细胞质中被称为GroEL，GroES是它的辅助蛋白(co-chaperone)。此外，还存在一些小相对分子质量的Hsp蛋白，被称为sHsp (small Hsps)。它们也可以与非天然态的蛋白结合并帮助它们的折叠。

一般认为，GroEL可以同蛋白质的折叠中间体结合并阻止蛋白聚沉的发生，从而提高蛋白质正确折叠的几率。GroEL是一个14聚体，具有复杂的四级结构。14个亚基形成两个共轴的环状体，每个环状体由7个Hsp60亚基组成，它们的空间结构为一圆柱体，直径14.5 nm ，高16 nm，内含一直径6 nm的空洞，GroES七聚体如同一个帽子复盖于GroEL圆柱体的一端，形成一个稳定的复合体（图10-6）。 GroEL具有微弱的K依赖性的ATP水解酶活力，它的每一个单体含有一个ATP的结合位点，Mg-ATP是GroEL帮助蛋白质折叠所必需的，它通过水解ATP产生能量，供给底物蛋白折叠所用，GroES对GroEL与底物蛋白及ATP的结合具有调节作用。

（a）去折叠或部分折叠的蛋白结合于GroEL未被GroES与ATP占据的一端，形成Protein·GroEL·GroES·ADP聚合体。 （b）ATP及GroES的结合调整了GroEL的构象，形成一个宽的内部空穴，使其与底物蛋白的结合状态发生改变，由紧密结合变为松弛结合，同时，另一端的GroES与ADP被释放）。 （c）伴随ATP的水解，蛋白质进一步折叠，蛋白质的折叠发生在一个相对密闭的环境中，防止了在折叠过程中折叠分子与其他非折叠的蛋白质之间的聚合。 （d）ADP脱离GroEL，ATP结合于GroEL的另一端，导致GroES与已折叠蛋白的脱离（新的GroES同时结合于GroEL的另一端）。 真核生物的分子伴侣蛋白是由8个或9个55kD亚基构成的双环结构，称TCP-1环复合物(TCP-1 ring complex, TRiC)，或CCT(cytosolic chaperonin containing YCP-1)，没有GroES的对应物。

10.2 肽链合成后的定向输送 绝大多数蛋白质的合成部位只有一个，即细胞质中的核糖体。但是成熟的蛋白质在细胞内均有不同的定位，即在细胞内或细胞外的不同部位执行生理功能，有的蛋白质在细胞质中起作用，如催化糖酵解反应的各种酶，有的蛋白质在细胞膜上起作用，如各种细胞外的信号受体，有的蛋白质在特殊的细胞器内起作用，如参与光合作用的蛋白质在叶绿体中起作用，参与细胞有氧呼吸的蛋白质在线粒体中起作用，有的蛋白质在细胞核中起作用，如各种组蛋白和转录因子，还有的蛋白质需要被分泌到细胞外面，如各种蛋白类激素和消化酶原。那么，在细胞质中合成的蛋白质如何到达细胞的特定部位，从而执行正常生理功能的呢？这个问题被称为肽链（或蛋白质）合成后的定向输送，或称为肽链的转运。

根据定位的不同，可以将蛋白质分为两大类：一类是不与生物膜以及各种通道联系的，称胞质蛋白，它们在核糖体上合成后即留在细胞质中。另一类是与生物膜以及各种通道联系的，在合成后需要穿过生物膜上的通道进入细胞的特定部位，如内质网、细胞核、各种细胞器等。与第一类蛋白质相比，第二类蛋白质均含有一段或几段特殊的氨基酸序列，可用于引导蛋白质进入细胞的特定部位，这些氨基酸序列被称为信号序列（signal sequence），或信号肽(signal peptide)。由G. Blobel和D. Sabatini提出的信号学说（signal hypothesis）认为，多肽链本身具有的信号序列决定新合成蛋白质离开核糖体后的去向，本节主要介绍第二类蛋白质的定向输送。

表10-1　某些代表性蛋白质上的信号序列 蛋白质名称 蛋白质定位 信号序列 信号序列的位置 人胰岛素原 细胞外 MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA N端 蛋白质二硫键 异构酶 内质网腔 KDEL C端 细胞色素c 氧化酶亚基IV 线粒体 MLSLRQSIRFFKPATRTLCSSRYLL 细胞色素c1 MFSNLSKRWAQRTLSKSFYSTATGAASKSGKLTEKLVTAGVAAAGITASTLLYADSLTAEA SV40 VP1 细胞核 APTKRKGS 中间 过氧化氢酶 过氧化物酶体 SKL 注释：KR碱性氨基酸；LV疏水氨基酸

引导蛋白质到达不同细胞部位的信号序列有不同的氨基酸组成与分布规律，表10-1列举了一些较为典型的蛋白质的信号序列。肽链的定向输送除了需要信号序列之外，还需要一系列识别和利用信号序列的生物分子，根据这些生物分子与信号序列相互作用机制的不同，可以将肽链定向输送的途径分为两条，一条为共翻译途径，即定向输送在蛋白质翻译没有结束的时候就已经启动，通过这条途径输送的蛋白质包括定位于内质网的蛋白、高尔基体蛋白、细胞膜蛋白、溶酶体蛋白和分泌蛋白；另一条为翻译后途径，即定向输送在翻译结束后进行，通过这条途径输送的蛋白质包括定位于细胞核的蛋白、线粒体蛋白、叶绿体蛋白和过氧化物酶体蛋白等（图10-8）。

10.2.1 共翻译途径 参与共翻译途径的蛋白质都是在粗面内质网结合于内质网上的核糖体中合成的，蛋白质穿过内质网膜上的通道进入内质网腔，多数进入内质网的蛋白质在翻译尚未完全结束前就开始穿越内质网（膜蛋白没有完全通过内质网膜，而是停留在膜中），此后非定位于内质网的蛋白质从内质网进入高尔基体，然后被引导入溶酶体、分泌小泡或细胞膜等最终目的地。 在粗面内质网上合成的蛋白质的N末端通常包含由15～30个氨基酸组成的信号肽，其特征为：疏水性氨基酸主要位于信号肽中部，组成疏水核心。疏水核心前端常有一个或数个带正电荷的碱性氨基酸，后端常有数个带有小侧链基团的氨基酸残基（如Ala、Gly等）。信号肽后有蛋白水解酶切割位点，使信号肽能够在进入内质网后被切除。 实验证明信号肽的存在足以导致细胞质中的多肽链进入内质网，例如将信号肽连在珠蛋白的N端可使该蛋白进入内质网，而不是留在细胞质里。

蛋白质通过内质网膜的转运可被分为两个步骤：首先，带有新生肽链的核糖体与膜结合；随后新生肽链进入并穿过膜上的通道。这两个步骤均需要特定生物分子的帮助，其中最重要的是信号肽识别颗粒（signal recognition particle，SRP）和SRP受体（SRP receptor）。在SRP和SRP受体的帮助作用下，带有新生肽链的游离核糖体结合到内质网膜上，其具体机制是，SRP首先识别并结合新生肽链N末端的信号肽，然后SRP与内质网膜上的SRP受体结合，使核糖体通过与膜上特定受体的相互作用结合到膜上。 需要注意的是，SRP与信号肽的结合将使蛋白质的翻译停止，这一过程通常发生于大约70 个氨基酸残基长度的肽链产生后。当SRP与其受体结合后，SRP释放信号肽，此时翻译可以继续进行。当核糖体被转运到膜上之后，SRP和SRP受体就完成了其功能，这时它们离开核糖体上正在合成的多肽，去介导另一个新生多肽及核糖体与膜的结合。SRP在核糖体转运到膜上的过程中阻止翻译的功能对防止蛋白质释放到拥有水溶性环境的细胞质中有重要意义。

SRP是一种核糖核蛋白复合体，含有6个大小不等的蛋白(SRP54, SRP19, SRP68, SRP72, SRP14, SRP9)和1个小的7S RNA，7S RNA是形成复合体的结构骨架，缺少它蛋白质不能组装成SRP。组成SRP 的不同蛋白质具有不同的功能，SRP54 能与新生蛋白质的信号肽结合，它决定底物蛋白质的识别，SRP54 还是一种GTP水解酶，GTP的水解可为将信号肽插入膜通道的过程提供能量，SRP68-SRP72二聚体与RNA的中心区域结合，参与对SRP受体的识别，SRP9-SRP14二聚体结合在分子的另一端，负责使翻译停止，SRP19参与SRP的组装，对P54与7S RNA的结合是不可少的。 SRP 受体是一个异二聚体，由SR-与SR-两个亚基组成。SR-是一个膜内在蛋白质，用于将SR-的氨基端锚定在内质网上，SR-的其余部分伸入到细胞质中。SRP 受体胞质区域的大部分序列与核酸结合蛋白质相似，含有许多带正电的残基，说明SRP受体有可能识别SRP中的7SL RNA。SRP受体的两个亚基均可结合并水解GTP，SRP 从SRP受体上的释放需要GTP 水解提供能量。

内质网膜上的蛋白质通道称易位子（translocon），由多种跨膜蛋白质组成（图10-9），包括Sec61复合体（由、、三种蛋白质组成）和TRAM。Sec61复合体是构成水相通道的主体部分，TRAM 为部分蛋白质的转运所必需，并可以促进所有蛋白质跨内质网膜的转运。

信号肽进入内质网后，即被称为信号肽酶（signal peptidase）切除，信号肽酶存在于内质网膜的内腔侧，表明信号肽必须在穿过膜后才能被切除。另外，新生肽链在进入内质网后，肽链在内质网腔内进行初步加工（如糖基化、羟基化、脂酰基化以及二硫键的形成等），还要进行正确的折叠与装配，错误折叠的蛋白质可被识别并转运回细胞质被降解，参与共翻译途径的蛋白质输送入内质网的流程见图10-10 。 对于定位于各种生物膜的膜蛋白来说，其转运过程的起始阶段与分泌蛋白相同，依靠信号肽进入膜通道，但在转运的后期，并没有完全通过内质网膜，而是停留在膜中，原因在于膜蛋白还具有停止转运序列（stop-transfer sequence）。这个序列的特征是在一些带电的残基附近具有一系列的疏水氨基酸残基，这些疏水氨基酸残基可以使蛋白质锚定在膜上，并且阻止蛋白质完全穿过膜。前述引导肽链穿过内质网膜的信号肽可以视为开始转运序列（start-transfer sequence），含有多个开始转运序列和多个停止转运序列的多肽将成为多次跨膜的膜蛋白。

进入内质网的蛋白除了需滞留内质网的蛋白外，均被运输到高尔基体，这种运输是通过内质网出芽形成的运输小泡进行的，运输小泡与高尔基体的形成面，即顺面（靠近细胞核的一侧）的扁囊膜融合，小泡中的蛋白质即转入高尔基体。滞留内质网中的蛋白含有滞留信号，在许多脊椎动物中它是C端的四肽：Lys-Asp-Glu-Leu（简称KDEL），酵母中是HDEL或DDEL。假如删除这些序列或者在其后加入其它氨基酸，则蛋白质可能会被分泌到细胞外，相反如果该四肽序列被加到溶菌酶的C 末端，则溶菌酶不再被分泌而是留在内质网腔内，这表明存在着识别C末端四肽并使其定位在内质网腔内的机制。另一个位于C端的信号序列是KKXX（X指任一种氨基酸）序列，负责将蛋白质定位于内质网膜，其特征为带有两个赖氨酸残基。 蛋白质运输到高尔基体后，在高尔基体中进行一系列的修饰与加工（糖基化、脂酰基化或磷酸化等），并经浓缩、分类包装后，以分泌小泡的形式运走。其中质膜蛋白嵌在分泌小泡的膜上，当分泌小泡与质膜融合后，该分泌小泡膜与其上的质膜蛋白就成了质膜的一部分。携带有分泌蛋白的分泌小泡经胞吐作用，可将分泌蛋白排出细胞。近期的研究结果表明滞留高尔基体的蛋白质也具有特定的信号序列，如C端的YQRL序列。

需要进入溶酶体的蛋白质（主要是各种水解酶）一般是高甘露糖型糖基化的对象，它们在内质网内开始进行N型连接的糖基化修饰。在进入高尔基体顺面的扁囊后，在扁囊中的N-乙酰葡萄糖胺磷酸转移酶（phosphotransferase）和葡萄糖胺酶（glucosaminidase）的作用下，蛋白质糖基上的甘露糖残基被磷酸化，同时N-乙酰葡萄糖胺被水解去除，形成甘露糖-6-磷酸（M6P）末端。这种特异的反应只发生在溶酶体的酶上，不发生在其它的糖蛋白上，估计溶酶体酶本身含有某种磷酸化的信号，可被高尔基体中负责修饰的酶识别。 在高尔基体成熟面（反面）扁囊上存在M6P的受体，可以专一地与M6P结合，这种亲和作用使溶酶体酶与其他蛋白质分离并起到局部浓缩的作用。在高尔基体反面，M6P-M6P受体复合物包入由衣被蛋白包被的转运小泡（早期内吞体），其再转化为后期的内吞体，内吞体内的pH为酸性，在该低pH 条件下，磷酸化的溶酶体酶与其上结合的M6P受体分离，受体可被转运回高尔基体膜，从而可以反复使用。后期的内吞体又分裂为小的转运体，将溶酶体酶输送入溶酶体中，溶酶体酶脱去甘露糖上的磷酸根，成为溶酶体内的成熟蛋白。

10.2.2 翻译后途径 参与翻译后途径的蛋白质都是在细胞质内游离的核糖体中合成的，然后被定向输送到各种细胞器如线粒体、叶绿体、过氧化物酶体中，或者细胞核中。 10.2.2.1 蛋白质向线粒体的输送 线粒体虽然具有少量编码蛋白质的基因, 但是大多数的线粒体蛋白质都是由核基因编码的，它们先在细胞质内以前体形式合成, 再通过特定的方式输送入线粒体。 需要进入线粒体的蛋白质在其N端具有称为导肽（leader peptide）的信号序列，导肽由相互间隔的疏水氨基酸与碱性氨基酸组成，不含有酸性氨基酸，可形成两亲性的螺旋结构。导肽介导蛋白质前体与线粒体膜之间的相互作用，使蛋白质前体能穿过膜。导肽中存在使线粒体蛋白质定位的所有信息，将一个线粒体蛋白质（如细胞色素C 氧化酶IV亚单位）的导肽与一个胞质蛋白质连接（如二氢叶酸还原酶）就可使该胞质蛋白质被输送到线粒体中。

含导肽的前体蛋白在跨膜运送时，首先被线粒体表面的受体识别，然后进入膜上的通道。在跨膜运送之前该前体蛋白需要去折叠为松散的结构以利于运送，前体蛋白通过线粒体膜之后，导肽即被线粒体中的导肽水解酶水解，剩余部分重新折叠为成熟的蛋白分子。在蛋白质去折叠与再折叠的过程中需要有分子伴侣参与，包括Hsp70与Hsp60家族成员，其中Hsp70家族成员在线粒体内外均起作用，线粒体外的Hsp70负责伸展肽链由细胞质中到线粒体表面的转运，线粒体内的Hsp70促进蛋白质通过通道，Hsp60家族成员只在线粒体基质中起作用。线粒体蛋白前体的跨膜运送需要ATP的水解提供能量，内膜两侧的质子电化学电势也具有驱动作用。

线粒体蛋白质的转运涉及多种蛋白复合体，称为转运蛋白（translocator）的蛋白复合体由识别蛋白质的受体和使蛋白质通过的通道两部分构成，主要包括：① TOM（translocase of the outer membrane）复合体，负责使蛋白质通过外膜进入膜间隙；② TIM（translocase of the inner membrane）复合体，负责使蛋白质通过内膜进入基质。当蛋白质通过TOM 复合体时，通常并不被释放到膜间隙中，而是直接转运到TIM 复合体上，这表明蛋白质在转运过程中可直接跨过两层膜，TOM 与TIM 复合体之间没有直接的相互作用，它们通过被转运的蛋白质结合，然后协同作用完成蛋白质向基质的运输。需要进入线粒体基质的蛋白质的输送见图10-11。

线粒体具有四个功能区域，即外膜、内膜、膜间隙和基质，进入不同部位的蛋白具有不同的转运途径，默认途径是穿过两层膜进入基质，定位在其他部位的蛋白质除导肽外还需要额外的信号序列，使其能够被输送到线粒体内的特定部位，以结合在内膜上并面向膜间隙的细胞色素c1为例，其N末端的61 个氨基酸可分为具有不同功能的片段，前32 个氨基酸序列含有基质定位信号（matrix-targeting signal），负责引导蛋白质进入基质，基质定位信号后的片段提供使蛋白质定位在内膜的另一个信号，称为膜定位信号（membrane-targeting signal）。关于膜定位信号的作用机制存在一定争议，一种模型认为整个蛋白质在基质定位信号的引导下进入基质，然后在膜定位信号的作用下蛋白质再重新进入内膜或通过内膜进入膜间隙，另一种模型认为膜定位信号阻止蛋白质的其余部分与基质定位信号一起通过内膜进入基质。两种模型的共同之处在于都认为基质定位信号由基质内的水解酶切除，从而使膜定位信号暴露于N端并发挥作用，膜定位信号最终由位于膜间隙的水解酶切除。

10.2.2.2 蛋白质向叶绿体的输送 与线粒体相似，大多数的叶绿体蛋白质由核基因编码，它们需要先在细胞质内以前体形式合成, 再通过特定的方式输送入叶绿体。 叶绿体蛋白质的输送与线粒体蛋白质有许多相似之处，例如细胞质中合成的叶绿体前体蛋白在N-末端有称为转运肽（transit peptides）的信号序列，它是叶绿体蛋白输送的必要成分，分子伴侣在蛋白质的输送过程中同样起了重要的辅助作用。叶绿体膜上具有相应的转位因子复合体，负责叶绿体前体蛋白质的识别与转运，外膜上负责转运的蛋白称为OEP（outer envelope membrane protein）或TOC（translocon of the outer membrane of chloroplasts）, 内膜上负责转运的蛋白称为IEP（inner envelope membrane protein）或TIC（translocon of the inner membrane of chloroplasts），TOM 与TIM协同作用完成蛋白质向基质的运输。

前体蛋白穿膜运输进入叶绿体可分为3 个步骤：首先前体蛋白与叶绿体外表面结合，该结合涉及到前体蛋白N-端的转运肽与叶绿体外表面转位因子复合体中受体的相互作用，还需要水解少量ATP为结合反应提供能量，同时前体蛋白还可能与外膜上特定区域的脂质发生相互作用。随后是转运的早期阶段，在GTP 或低浓度的ATP存在下，前体蛋白与转位因子复合体紧密结合。最后是转运的末期，当存在足量的ATP 时，前体蛋白穿膜转运进入叶绿体基质，加工成为成熟蛋白。 由于叶绿体具有类囊体，在结构上比线粒体多出了类囊体膜与类囊体腔，因此蛋白质输送的过程更复杂。被输送的叶绿体蛋白的最终目的地不同，其上的信号序列也不一样。例如输送到叶绿体基质中的前体蛋白只含定向基质的序列，输送到类囊体腔中的前体蛋白信号序列则由两部分组成：N 端含有定向叶绿体基质的序列，C 端具有可引导蛋白向类囊体膜输送的序列，这类蛋白前体首先穿过叶绿体外膜与内膜进入基质，经基质内蛋白酶作用后，定向基质的序列被切除，余下的信号序列继续指导蛋白质穿过类囊体膜进入类囊体腔。

10.2.2.3 蛋白质向细胞核的输送 需要被输送到细胞核中的蛋白包括组蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、转录因子、核糖体蛋白等，统称为核蛋白，这些核蛋白进入细胞核的机制与线粒体蛋白和叶绿体蛋白有很大区别。首先核蛋白在细胞质中进行折叠，保持折叠好的状态被输送，其次蛋白质上的信号序列可位于肽链的Ｃ端或肽链中间，并且在核蛋白的输送完成后不被切除。核蛋白上的信号序列称为细胞核定位序列（nuclear localization sequence, NLS），通常由一簇或几簇短的碱性氨基酸残基组成，暴露于折叠后的核蛋白表面，用于引导核蛋白进入细胞核，该序列上发生的突变可阻止核蛋白进入细胞核，而将该类序列连接到非核蛋白上也可使其能够进入细胞核。 核蛋白通过核膜上的核孔复合物（nuclear pore complex，NPC）进入细胞核，NPC是一个多蛋白复合体，由胞质环、核质环、转运体、轮辐各部分组合成为一个外径120 nm的篮网状结构，其中心亲水通道的直径约为9 nm。NPC具有分子筛功能，可以允许相对分子质量小于40～50 kD 的小分子物质（如离子、有机小分子和小分子蛋白）以自由扩散的方式自由通过，相对分子质量超过此范围或直径大于6 nm 的生物大分子（如各种核蛋白）则必须在细胞质内特定转运蛋白称为输入蛋白（importin）的介导下, 以主动运输的方式进入细胞核。输入蛋白由、两个亚基组成，在图10-12表示为Imp和Imp。

经典的核蛋白输入过程主要是输入蛋白/二聚体依赖的蛋白质入核机制，该机制的具体过程主要包括：① 待输送的核蛋白与输入蛋白/二聚体结合，输入蛋白负责识别和结合核蛋白表面的NLS；② 核蛋白与输入蛋白的复合体与NPC胞质环上的纤维结合，输入蛋白负责与NPC的作用；③ 在NPC蛋白和各种辅助蛋白的帮助下，复合体通过NPC进入细胞核；④ 复合体与核内的Ran-GTP结合，复合体分解并释放出核蛋白；⑤ 与Ran-GTP结合的输入蛋白被运回细胞质，在细胞质中Ran所结合的GTP水解，Ran-GDP返回细胞核重新转换为Ran-GTP；⑥ 输入蛋白在核内输出素的帮助下运回细胞质，与输入蛋白装配为异二聚体，参加下一轮的输送过程。 Ran是一种典型的单体GTP/GDP结合蛋白，对核蛋白的输送起重要的调节作用，一般来说，Ran-GTP 存在于核内， Ran-GDP 存在于细胞质中，Ran-GDP 的存在可使核蛋白与输入蛋白/稳定结合，而Ran-GTP 的存在则使核蛋白-输入蛋白复合物解离，从而导致被输送的靶蛋白在细胞核内的释放。

10.2.2.4 蛋白质向过氧化物酶体的输送 过氧化物酶体（peroxisome）是由单层膜围绕的细胞器，内含一种或几种依赖黄素的氧化酶和过氧化氢酶。过氧化物酶体中所有的酶都由核基因编码，在细胞质基质中合成并完成折叠，然后在信号序列的引导下进入过氧化物酶体。该信号序列又称为过氧化物酶体定向序列（peroxisome targeting sequences，PTS），主要分两类，PTS1序列通常为Ser-Lys-Leu，位于蛋白的C端。PTS2序列为一段九肽序列（Arg/Lys-Leu/Ile-XXXXX-His/Gln-Leu），位于蛋白的N-端或内部。在细胞质中存在可识别信号序列的受体蛋白，在过氧化物酶体膜上存在通道蛋白，这些蛋白均参与了蛋白质的跨膜输送。

思考题 1. 蛋白质合成后的加工修饰包括哪些内容？ 2. 简述蛋白质氨基酸残基糖基化修饰的类型及其生理意义。 3. 试举例证明蛋白质的一级结构决定高级结构。 4. 什么是分子伴侣？分子伴侣具有哪些生理功能？ 5. 什么是信号序列？信号序列有哪些特点？试总结不同类型蛋白质信号序列的异同点。 6. 简述蛋白质进入内质网的过程及机理。 7. 概述在内质网和高尔基体中，蛋白质的加工与修饰过程，这些修饰对蛋白质的结构与功能有什么影响作用？ 8. 比较蛋白质进入线粒体、叶绿体与细胞核过程的异同之处。