大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA （一）生物结构 外形呈丝状由外壳包装蛋白和 正链DNA组成；不裂解宿主细 胞，但抑制其生长。 约有10个基因 　M13、f1和fd，是一类丝状大肠杆菌噬菌体，它们都含有长度为6.4kb、彼此具有很高同源性的单链环状DNA分子。这些丝状噬菌体表现出一系列其它载体所不具备的优越性： 有时亦称为感染性的单链 M13噬菌体颗粒的外形呈丝状，在颗粒中包装的仅是（十）链的DNA，有时亦称为感染性的单链（图5-11）。 　　M13噬菌体首先吸附在F性须上，其吸附的位点看来是在性须的末端（图5-12）。噬菌体的基因组从性须末端进入到细胞的内部，进入细胞内部的M13（＋）链DNA，便起到一种模板的作用，合成出互补的（一）链 DNA。由此形成的双链形式的M13DNA，称为复制型 DNA。它按θ形式进行几轮复制之后，基因 Ⅱ的产物便在RFDNA的正链待定位点上作切割反应，形成一个缺口。这样，M13基因组的扩增活动便正式开始启动。其基本特点是利用大肠杆菌的DNA聚合酶I，以环形的MI3（一）DNA为模板合成 M13（＋）DNA。当DNA复制叉沿着模板DNA分子转移到复制终点时，在基因Ⅱ编码产物的作用下，新合成的（十）DNA便会被切除下去，并进一步环化形成单位长度的 M13基因组DNA（图5-13）。

M13噬菌体载体 M13是一种含单链（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。 这类载体主要用来获得大量的单链DNA片段，主要用来测定DNA序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。 在 M13 基因组中，除基因间隔区（IS region）外，其他均为复制和组装所必需的基因。外源 DNA 插入 IS 区，可不影响 M 13 活动，因而野生型 M 13 的改造主要在 IS 区中进行。

无论是RF DNA或ss DNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。 M13噬菌体的特点 感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型DNA （ replication form DNA, RF DNA）。可以象质粒DNA那样在体外进行纯化和操作。 无论是RF DNA或ss DNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。 噬菌体颗粒的大小是受其DNA的大小制约的，这一点正好与λ噬菌体相反，所以M13噬菌体并不存在包装限制的问题。 成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞，这是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。

M13噬菌体产生单双链DNA的机制 1、以（+）链DNA为摸板，合成互补（－）链，该双链称复制型DNA（RFDNA）。 2、RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约200个拷贝。 3、单链特异的DNA结合蛋白结合在（+）链上，从而阻断了其互补链，即（－）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（+）链DNA 。 4、游离出来的（+）链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从（+）DNA链上脱落下来，余下的M13（+）链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。

M13 DNA载体的构建

M13mp 载体系列 插入一段lac DNA片段，即带有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列及其N端头146个aa编码信息，宿主F’因子携带缺失第11-41位氨基酸的lacZ’

M13 DNA载体的特点 1、克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，在DNA定向突变中非常有用. 2、M13重组体筛选简便 可以利用菌落的蓝白斑筛选转染的转化子 3、制备的单链DNA、双链RF-DNA M13噬菌体，不经体外包装，可以转染大肠杆菌受体。 通过感染或转化的方法能将M13DNA导人宿主菌中， 包装不受DNA大小的限制，其噬菌体颗粒的大小可随DNA的大小而改变.即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍，仍能进行包装。

噬菌体载体和质粒载体比较 单纯以噬菌体为基础构建的载体: 单纯以质粒为基础构建的载体: 装载量大， 有天然的抗性选择标记， 能排斥空载体， 转染效率高, 操作较难， DNA不稳定。 单纯以质粒为基础构建的载体: 有天然的抗性选择标记， 操作容易（易于分离和转化）， 较稳定, 装载量小， 转化效率较低；

第一节 克隆载体 1. 质粒载体（plasimid vectors） 2. 噬菌体载体（phage vectors） 第一节 克隆载体 1. 质粒载体（plasimid vectors） 2. 噬菌体载体（phage vectors） 3. 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 4. 人工染色体载体（B/Y/HAC）

柯斯质粒（cosmid） （一）柯斯质粒的构建 柯斯质粒：一类人工构建 的含有λDNA两端cos序 列和质粒复制子的特殊类 型的载体。 cos site-carrying plasmid”缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点（cos）的质粒。

（二）柯斯质粒的特点 1、具有λ噬菌体的特性。 具有cos位点，能像 λ-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞。 2、具有质粒载体的持性。可以在受体细胞内 自由复制，以质粒DNA的形式存在于细胞内。 3、 具有高容量的克隆能力。可以装载比质粒或 λ-DNA大得多的外源DNA片段，40kb。 4、 便于筛选：携带质粒的选择标记 。 由于λ-DNA包装蛋白只识别粘性末端的一小段顺序cos区。将这段DNA与质粒连在一起，构 建的重组质粒，可装载外源DNA（45.5kb)，它仍可象λ-DNA一样，在体外被包装成有感染 活性的噬菌体，进入细胞后，要通过质粒上的复制子进行复制。 柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点，一两个选择记号和COS位点等三个组成部分，其分子量较小，一般只有5～7kb左右。因此，柯斯质粒载体的克隆极限可达45kb左右。 5、便于克隆：有质粒上的多种单一酶切位点。 6、不能体内包装，不裂解受体细胞，在细胞内不能 形成噬菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑 。

利用Cos质粒进行克隆 “柯斯克隆” （cosmid cloning） 应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术，叫做柯斯克隆。 这种技术的理论依据是，在线性λ噬菌体DNΑ分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列，即所谓的粘性末端（cos位点）。在λ噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个λDNA拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，前后两个λDNA基因组之间都是通过cos位点连接起来的。λ噬菌体具有的一种位点特异的切割体系（site-specific cutting system），叫做末端酶（terminase）或Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点，将多连体分子切割成λ单位长度的片段，并将它们包装到λ噬菌体头部中去。只有在被作用的λDNA分子具有两个cos位点，而且它们之间的距离保持在38～54kb的条件下，Ter体系才能对它们发生作用。 　　应用柯斯质粒作载体进行基因克隆的一般程序是：将外源DNA片段与柯斯质粒线性DNA分子进行体外连接反应。由此形成的连接产物群体中，有一定比例的分子是两端各有一个cos位点的长度为40kb左右的真核DNA片段，而且这两个cos位点在取向上是一样的，可作为λ噬菌体Ter功能的一种适用底物。当加入λ噬菌体的包装连接物时，它能把这些分子包装进λ噬菌体的头部，可以用来感染大肠杆菌 “柯斯克隆” （cosmid cloning）

黏粒载体的克隆原理及步骤 1．分离外源DNA片段35～45kb 2．外源DNA与两个粘粒相连，且cos方向相同 3．体外包装：在的A蛋白的功能作用下切割cos位点并将其中的DNA包装到成熟的噬菌体颗粒中去 4．感染E.coli：线状的重组DNA被注入细胞并通过cos位点的环化，而形成黏粒载体，象质粒一样复制

常用黏粒载体结构图

噬菌粒载体 由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。 它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。

pBluescript噬菌粒载体 用于体外转录 T7 T3

常用噬菌粒载体的一般特征

第一节 克隆载体 1. 质粒载体（plasimid vectors） 2. 噬菌体载体（phage vectors） 第一节 克隆载体 1. 质粒载体（plasimid vectors） 2. 噬菌体载体（phage vectors） 3. 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 4. 人工染色体载体（B/Y/HAC）

人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb 的DNA片段， 此时柯斯质粒(45kb)和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。 或称为自主复制序列(ARS)

人工染色体克隆载体（artificial chromosome vector） 人工染色体载体（artificial chromosome vector）:利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。 实际上是一种“穿梭”克隆载体，含有质粒克隆载体所必 备的第一受体(大肠杆菌)源质粒复制起始位点(ori)，还含有 第二受体(如酵母菌)染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位 点的序列，以及合适的选择标记基因。 与其他的克隆载体相比，人工染色体克隆载体的特点是能容纳长达1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。

（一）酵母人工染色体（YAC） 装载量为350-400kb 含有的元件： 把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使酵母chr的转录功能和复制功能。 含有的元件： 酵母4号染色体的复制起点和着丝粒序列 装载量为350-400kb 酵母系统的选择标记 a) YAC载体的结构和应用 pYAC3是在pBR322的基础上，插入了几个酵母基因。其中两个基因是URA3和TRP1，可以作为选择标记分别存在于YIp5, YRp7，就像在YRp7中一样，携带TRP1的同时也包含一个复制起点，但在pYAC3中这一片段扩展到CEN4，他是一段来自4号染色体着丝粒的DNA片段。TRP1-origin—CEN4片段已经包含了人工染色体组成三部分中的两部分。 　　第三部分端粒，有两段称为TEL的序列提供，并不是他们自身组成端粒序列，而是在引入酵母细胞核后，作为种子序列建立端粒。还有最后一部分没有提到的是SUP4，他在克隆实验中作为插入片段的选择标记基因。 利用pYAC3克隆的策略如下： YAC 载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列（autonomously replicating sequence， ARS）、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒 （centromere , CEN）和两个端粒（TEL）。 YAC 人工染色体载体是利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色体的复制元件构建的载体,增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。 YAC 载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列（autonomously replicating sequence， ARS）、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒 （centromere , CEN）和两个端粒（TEL） 　YAC 载体为能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要，必须含有以下元件： 　　·端粒重复序列（telomeric repeat ， TEL）：定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的 DNA 不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。 　　·着丝粒（centromere ， CEN）：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点， 使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中 。在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。 自主复制序列（autonomously replication sequences，ARS） 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号。 　 YAC 载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突变抑制基因 sup4 。 与 YAC 载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变 ade 2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。 有的可达 1Mb 以上，甚至达到 2Mb 质粒复制起点 质粒选择标记 四膜虫大核rDNA分子末端端粒重复序列

克隆位点：位于sup4基因内 SuP4是一个赭石突变（UAA）抑制基因。 宿主酵母菌的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变 ade2。 有外源基因插入时，sup4基因遭破坏，则形成红色菌落，十分容易挑选出有DNA插入片段的红色菌落，建成YAC文库。 酪氨酸 。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源 DNA 片段插入的重组子。 这是一种无意义突变。它是由于碱基代替换所产生的突变,这种突变使得原来对应于某种氨基酸的密码子变为赭石型终止密码子UAA,

酵母人工染色体的使用 pYAC3 1. 载体用BamHI和SnaBI双酶切，形成3个片段。 2. 移去BamHI之间的片段，留下另外两段，每一段的两端都分别是TEL序列和SnaBI位点。 3. 被克隆的DNA，两端必须切成平末端(SnaBI是一个平末端内切酶，识别TACGTA序列)。 4. 把三者连接起来，形成了人工染色体。

酵母人工染色体的使用 对于 BamHⅠ切割后形成的微型酵母染色体，当用 EcoRⅠ或 SmaⅠ 切割抑制基因 sup4 内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段 DNA 在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段DNA 的目的。装载了外源 DNA 片段的重组子导致抑制基因 sup4 插入失活，从而形成红色菌落； 而载体自身连接后转入到酵母细胞后形成白色菌落。这些红色的装载了不同外源 DNA 片段的重组酵母菌菌落的群体就构成了 YAC 文库。 YAC文库装载的 DNA 片段的大小一般可达 200-500kb，有的可达 1Mb 以上，甚至达到 2Mb

用pYAC3进行克隆筛选如下： 用原生质转化的方法把人工染色体转入酿酒酵母。用作宿主的菌株是双营养缺陷型Trp1-ura3- ，可以被人工染色体上的筛选标记基因恢复成Trp1+ura3+ 。 在基本培养基平板上培养，只有含有结构正确的人工染色体的转化体可以生存。 如果染色体构建错误，如在被克隆的DNA两侧连接了相同的两段载体DNA片段，则因缺少一种筛选标记，使得转化体不能在基本成分培养基上存活。 外源DNA的是否插入，可由SUP4的插入失活判断，即可以很简单地由菌落的颜色看出：红色的菌落是重组体，而白色的菌落则不是。

3、YAC 染色体与宿主细胞的染色体大小相近，影响了YAC 载体的广泛应用 1、插入片段大，稳定性差 2、内部存在重组和嵌合现象 3、YAC 染色体与宿主细胞的染色体大小相近，影响了YAC 载体的广泛应用 YAC 载体功能强大，但有一些弊端。一个YAC中 克隆的DNA片段可能来自两个或多个不同的染色体上。)。插人的DNA较大，序列发 生重排，导致和原来染色体的序列不一致。重组很难检出 YAC结构和酵母天然染色体结构相 似，使用常规方法不易将YAC和酵母夭然染色体分开，要通过较长时间的PFE才能分离出YAC. 这主要表现在 3 个方面：首先，在 YAC 载体的插入片段会出现缺失 （deletion） 和基因重排 （rearrangement） 的现象。其次，容易形成嵌合体。嵌合就是在单个 YAC 中的插入片段由 2 个或多个的独立基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的 5%～50% 。最后， YAC 染色体与宿主细胞的染色体大小相近，影响了 YAC 载体的广泛应用。 YAC 染色体一旦进入酿酒酵母细胞，由于其大小与内源的染色体的大小相近，就很难从中分离出来，不利于进一步分析

（二）细菌人工染色体（BAC） 在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的， 在大肠杆菌受体菌维持单一拷贝，装载量范围 在50-300kb之间。 用于：克隆大型基因簇结构 构建动植物基因文库 缺点：会出现插入片段在 结构上的不稳定，导致克隆 DNA部分的缺失或重排。

(三)P1派生人工染色体 结合了 P1 载体和 BAC 载体的最佳特性，包括阳性选择标记 sacB 及噬菌体 P1 的质粒复制子和裂解性复制子。 (四)哺乳动物人工染色体

（五）人工染色体克隆载体的应用 1、构建基因组文库 2、基因治疗 3、基因功能鉴定 b) YAC载体的使用 　　一些哺乳动物的基因大于100kb（如人类膀胱纤维基因有250kb），超过了大肠杆菌载体系统的承受范围，但正好在YAC载体的范围之内。最近的研究发现，在某些情况下，YACs可以在哺乳动物中表达，因此可以在基因存在的生物中研究基因的功能。 　　YACs在构建基因文库中非常重要，要知道，最高容量的大肠杆菌质粒可以插入300kb的片断，对于人的基因文库需要30000个克隆，而YACs可以克隆600kb的片段，一些特殊的类型可以携带1400kb片段，可以是人类基因文库的克隆是降至6500个。但不幸的是，这样的”mega-YACs”存在着不稳定性，克隆的DNA片段可以被重新排列。不管怎样，YACs在大规模的测序中例如人类基因组计划是非常有用的。 有的遗传病是多基因所致，称为连续多基因缺失综合症（Contiguous Gene Deletion Syndrome), MAC有能力容纳 整簇的基因，因而MAC能同时纠正多个位点不同基因缺失所致的遗传病。 由于高等真核生物的基因大多数是多外显子结构并且有长长的内含子，大型基因组片段可通过 YAC 载体转移到动物或动物细胞系中，进行功能研究。