实验一 总结 第一、要求； 实验现象和现象产生的原因需要对应写； 实验中遇到的问题和处理方法对应着写； 第二、希望； 希望能够多提出问题； 实验一 总结 第一、要求； 实验现象和现象产生的原因需要对应写； 实验中遇到的问题和处理方法对应着写； 第二、希望； 希望能够多提出问题； 每周二的理论课中进行讨论，希望大家积极思考。

组织总RNA抽提

一、RNA简介 A-U G-C RNA 腺嘌呤（A） 尿嘧啶（U） 胞嘧啶（C） 鸟嘌呤（G） 四种核苷酸串联组成的单链。 DNA 胸腺嘧啶(T) A-U G-C

信使RNA（mRNA） 转录DNA上的遗传信息 核糖体RNA（rRNA） 与蛋白质结合形成核糖体，形成细胞内蛋白质合成的场所 转运RNA（tRNA） 运输被激活的氨基酸，翻译mRNA上的氨基酸序列 真核细胞中还存在 不均一RNA (hnRNA) 小核RNA (snRNA) 小RNA (microRNA) 非编码RNA (ncRNA)

rRNA(80-85%)5S,5.8S,18S,28S（主要提的是rRNA） 120,160, 1874,4718个核苷酸组成 tRNA(15-20%) 70~90个核苷酸组成 mRNA(1-5%)1.5-2.5 kb

tRNA

控制生物性状的基本单位是基因，而生物性状的表达则主要通过蛋白质。 mRNA与蛋白质的表达具有关联性。 控制生物性状的基本单位是基因，而生物性状的表达则主要通过蛋白质。 研究发现，所有基因均先转录成mRNA，再翻译成蛋白质。 生物遗传中心法则

细胞内RNA转录过程

RNA酶广泛存在而稳定，反应一般不需要辅助因子； 耐受多种处理（如煮沸、高压灭菌等 ）而不被灭活。 内源性：核内 外源性：外界

常用的RNA酶抑制剂 焦磷酸二乙酯（DEPC） 抑制强烈 异硫氰酸胍 有效抑制、分解核蛋白 氧钒核糖核苷复合物 有效抑制 异硫氰酸胍 有效抑制、分解核蛋白 氧钒核糖核苷复合物 有效抑制 RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin） 有效抑制 其它：SDS、尿素、硅藻土等 有效抑制 上述大部分试剂有致癌之嫌，应谨慎操作！

3. 取材 动物新鲜组织、细胞 -80C冷冻组织 液氮冷冻组织（-196 ℃） RNA 储存液保存 其它

二、与RNA有关的研究方法 RT-PCR RNA序列分析 Northern 杂交 RNA干扰技术（RNAi） mRNA通过RT-PCR（逆转录-PCR），可建立相应cDNA文库 RNA序列分析 潜在基因分析 Northern 杂交 用于真核细胞中RNA表达和大小的检测分析（RNA-DNA探针） RNA干扰技术（RNAi） 通过双链小干扰RNA（siRNA）的形成，诱导同源mRNA降解

三、组织RNA的抽提和纯化 RNA质量的标准 完整性 — 避免外源性及内源性RNase对RNA的降解 均一性 — 有效去除抽提过程中残留的DNA、蛋白质和有机溶剂

组织RNA抽提纯化方法 TRIzol试剂抽提法 利用含异硫氰酸胍成分的TRIzol破碎组织细胞，并抑制细胞释放的核酸酶。 硅胶膜纯化柱抽提法 硅胶膜纯化柱能迅速特异地吸附样品裂解液中的RNA，无需酚氯仿抽提，不用乙醇等沉淀，只须不断洗脱即可得到高纯度的RNA。

实验的主要操作步骤 组织（50mg）+ Trizol（1ml），制成匀浆，冰浴10分钟 加入氯仿（200μl），颠倒（震荡）混匀，静置片刻 START 高速离心 12000rpm 4℃ 15min 取上清液，加入等体积异丙醇（4 ℃），混匀，沉淀5 分钟 高速离心 12000rpm 4℃ 10min 弃上清液，加入1 ml的75%乙醇-DEPC H2O洗涤一次 离心12000rpm，5min 弃上清液，37 ℃干燥后，加入50 ul的DEPC-H2O溶解（55 ℃水浴，10分钟），定量测定，-80 ℃保存

TRIzol试剂 常用总RNA抽提试剂 组织+ Trizol，制成匀浆 组织应先用生理盐水冲洗，去除残留的血液，用剪刀等切成小块 苯酚：裂解细胞，有效变性蛋白质。 异硫氰酸胍： 解偶剂，强力蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。同时，异硫氰酸胍也是常用RNA抑制剂，可使RNase失活。 8 -羟基喹啉：抑制RNase。 β-巯基乙醇：破坏RNase蛋白质中的二硫键。

氯仿 加入氯仿（200μl），颠倒混匀，静置片刻 学名：三氯甲烷 英文名：Chloroform 作用： ① 蛋白变性剂 ② 溶解、去除前一步操作中残留的苯酚

离心之后，样本一般分为水样层、中间层和有机层。 RNA存在于水样层中。 高速离心 12000rpm 4℃ 10min 离心之后，样本一般分为水样层、中间层和有机层。 RNA存在于水样层中。 ** 在除去水样层后，亦可用沉淀法来逐步分离样品中的DNA和蛋白质。如：乙醇沉淀中间层的DNA；在有机层中加入异丙醇，沉淀蛋白。

水相 中间层

异丙醇 取上清液，加入等体积异丙醇，静置 俗称IPA，是正丙醇（CH3CH2CH2OH）的同分异构体。 在抽提过程中进一步溶解样本中的蛋白质，沉淀RNA，起到纯化作用。 静置主要为了提高沉淀效率。 ** 吸取上清液时，尽量不要混入任何中间层 物质，否则会出现染色体DNA污染。

再次离心后，样本中的RNA将会沉积于管壁或管底部。 高速离心 12000rpm 4℃ 10min 离心前RNA沉淀通常不可见。 再次离心后，样本中的RNA将会沉积于管壁或管底部。 上清液中为异丙醇、残余蛋白质。所以尽可能去除上清液。 上清液 RNA

主要用于RNA的洗涤，去除实验前的金属盐，而RNA自身不溶于乙醇。 混匀时，应尽量使沉淀悬浮于溶液中。 加入75%乙醇-DEPC H2O 主要用于RNA的洗涤，去除实验前的金属盐，而RNA自身不溶于乙醇。 混匀时，应尽量使沉淀悬浮于溶液中。 DEPC-H2O DEPC即diethypyrocarbonate，中文名为焦碳酸二乙酯。分子式为C6H10O5，分子量为162.14。是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

弃上清液，自然干燥后，加入DEPC-H2O溶解，定量测定 离心 12000rpm 3min 弃上清液，自然干燥后，加入DEPC-H2O溶解，定量测定 通过离心，RNA再次沉淀。弃去洗涤液（乙醇-DEPC H2O ），并利用乙醇挥发性，去除残留的有机试剂。避免外源性RNase污染，自然干燥。 ** 最后定量测定时，先将溶解的RNA原液吸取1μl至新EP管，加入99μl DEPC H2O进行稀释。

RNA纯度 A260nm RNA含量 A280nm 1.8-2.0， 表明样本纯度相对较高 RNA(μg/ml ) = A260nm×40×1/光径×稀释倍数 光径 – 测定时分光光度计的参数。 40 – 在单位条件下，RNA在260nm波长下吸光度为1时，浓度为每毫升40μg。 稀释倍数 – 直接检测时，稀释倍数为1；常用的稀释倍数为1：50、1：100等。

实验的主要操作步骤 提取部分 纯化部分 组织 + Trizol ，制成匀浆 加入氯仿, 颠倒混匀，静置片刻 高速离心 12000rpm 4℃ 10min 取上清液，加入异丙醇，静置 纯化部分 高速离心 12000rpm 4℃ 10min 弃上清液，加入75%乙醇-DEPC H2O 离心 12000rpm 3min 弃上清液，自然干燥 加入DEPC-H2O溶解， 1:100稀释定量测定

注意事项 样本选择 * 血液样本，应为新鲜血液，不得超过4小时的放置。如需过后处理，应先加入TRIzol试剂，置于-80℃保存。 ** 组织样本，应取动植物生长旺盛的部分，如：动物的肝组织，植物的幼芽。 *** 细胞样本，应选择处于生长旺盛期的细胞。

注意事项 DEPC是RNase的化学修饰剂，可与RNase的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。所以DEPC是活性很强的剧毒物，须在通风柜中小心使用。 DEPC能与腺嘌呤作用，从而破坏mRNA活性。 配制含DEPC成分的试剂时，应在加入DEPC后剧烈振荡10min，再高压灭菌以消除残存的DEPC。 DEPC能与胺、巯基反应，故含Tris及DTT的试剂不可加入DEPC。

注意事项 RNase污染的主要来源 实验操作者手指、唾液 Tip 头 水/缓冲液 阳离子（Ca+、Mg2+） 其他实验（eg:质粒抽提）影响 后续实验所用酶 ……

注意事项 杜绝RNase污染 （1）避免外源性RNase的污染 （2）消除内源性RNase * 实验中佩戴口罩和手套； ** 涉及的实验器具设备应彻底处理； *** 试剂及使用的溶液必须为RNase-Free，其中，水必须处理，多用0.1%DEPC-H2O。 （2）消除内源性RNase 选择合适的匀浆方法和裂解液，合理控制样本量。

常见问题分析 提取RNA量较少 ► 样本裂解或匀浆处理不彻底，RNA没有被完全释放出来 ► 定量检测时RNA沉淀未完全溶解

常见问题分析 RNA样品的A260/A280值小于1.6 ► 检测吸光度时，RNA应用DEPC-H2O溶解，不用TE。低离子浓度和低pH条件下，A280值会偏高。 ► 制备匀浆时，Trizol试剂量过少。 ► 匀浆液未室温静置5min，RNA未与核蛋白完全分离。 ► 吸入有机相，带入蛋白质和DNA的污染。 ► 检测吸光度时，RNA沉淀未完全溶解。

分离的总RNA可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特点,当RNA流经oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。 思考： 如何从总RNA中分离mRNA?

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