肿瘤遗传标记-DNA修复与 肿瘤发病风险的研究

MD Anderson Cancer Center 美国休斯顿德州医学中心 MD Anderson Cancer Center

肿瘤死亡病因 Tobacco 30% 成年人膳食和肥胖症 30% 产前因素和生长因素 5% 病毒感染 5% 其他 7% 免疫因素 5% 遗传因素 5% 成年人膳食和肥胖症 30% 酗酒 5% 电离辐射 3% 病毒感染 5% 缺乏运动 5% Harvard School of Public Health, 1998

吸烟与肿瘤 基本数据: 百万 美国人口: 300.0 吸烟者: 46.5 每年癌症患者 1.3 每年肺癌患者 0.5 基本数据: 百万 美国人口: 300.0 吸烟者: 46.5 每年癌症患者 1.3 每年肺癌患者 0.5 每年头颈部癌患者 0.04 遗传因素一定在起作用! ACS, 2009

吸烟在不同人群中有不同危害 中国 美国 Peto J, Nature, 2001

Transcription Dependent Apoptosis Transcription Independent DNA损伤-修复与肿瘤发生的机制 Cell Cycle Arrest DNA Repair Cancer Apoptosis Transcription Dependent Apoptosis Transcription Independent DNA DAMAGE Altered Expression BAX, Fas, Bcl2 PIG3 Binding to Transcription Replication-Repair Factors TFIIH (XPB, XPD) and p62 binds to p53 PCNA (p21WAF1 and GADD45) Increased Expression p21WAF1, MDM2, cyclin G, and GADD45 p53 Protein Accumulation Modified from Harris, 1994

DNA 修复基因和肿瘤发生 基因 肿瘤 XP(A) 皮肤癌 XP(B) 皮肤癌 XP(C) 皮肤癌 XP(D) 皮肤癌 基因 肿瘤 XP(A) 皮肤癌 XP(B) 皮肤癌 XP(C) 皮肤癌 XP(D) 皮肤癌 XP(E-G) 皮肤癌 hMLH1 结肠癌 hPSM1/2 结肠癌 hMSH2 结肠癌 hMSH3 结肠癌 hMSH6 结肠癌 pRB 视网膜母细胞瘤 P53, hCHK2 Li-Fraumeni综合症 P16 黑色素瘤 ATM 乳腺癌 BRCA1/2 乳腺癌 …

正常修复功能 修复功能缺陷

DNA修复的特定通路 氧化 损伤 重组（HR）和 非重组修复 （NHEJ） 多碱基剪切修复 (NER) 多碱基剪切修复 (BER) 断裂 重组（HR）和 非重组修复 （NHEJ） DNA 加成物 多碱基剪切修复 (NER) 氧化 损伤 多碱基剪切修复 (BER) 铰链物 NER, HR & NHEJ 的综合修复

人类 DNA修复通路 修复类型 基因种类 损伤种类 碱基错配修复 MSH2, MHS3, MSH6, MSH4, 碱基错配 修复类型 基因种类 损伤种类 单碱基剪切修复 DNA ligase (LIG3), 单碱基损伤 DNA glycosylase (MBD4, MPG, MYH, NTH1, OGG1, SMUG1, TDG, UNG), APE1, APE2, XRCC1, ADPRT, ADPRTL2, ADPRTL3 ... 多碱基剪切修复 XPA, XPC, XPE, XPF/ERCC4, 多碱基损伤 XPG/ERCC5, ERCC1, LIG1, （紫外线、吸烟） CSB/ERCC6,CSA/CKN1, XAB2, TFIIH (XPB/ERCC3 XPD/ERCC2, GTF2H1, GTF2H2\1, GTF2H3, GTF2H4, CDK7, CCNH, MNAT), DDB1, DDB2, MMS19, CENN2, AD23A, RAD23B, RPA1, RPA2, RPA3 ... 碱基错配修复 MSH2, MHS3, MSH6, MSH4, 碱基错配 MSH5, MLH1, MLH3, PMS1, PMS2, PMS2L3, PMS2L4 ... 重组修复 RAD50, RAD51, RAD51B, RAD51C, DNA双链断裂 RAD51D, RAD54L, RAD54B, V(D)J重组 RAD52, DMC1, MRE11A, NBS1, ERCC1, XPF/ERCC4, XRCC2 XRCC3, XRCC4, XRCC5, XRCC6 XRCC7, XRCC8, BRCA1, BRCA2 ... Wood et al, Science, 2001

XP病人和正常人中皮肤癌发生的年龄分布 XP = xeroderma pigmentosum Skin cancers in XP population Skin cancers in normal population Kraemer, PNAS, 1997 XP = xeroderma pigmentosum

头颈部肿瘤病例-对照研究中部分变量的频数分布 2000-2006 变量 病例 对照 OR (95% CI) P value No. (%) No. (%) 总数 895 898 年龄 0.493 ≤ 55 439 (49.1) 455 (50.7) > 55 456 (50.9) 443 (49.3) 性别 0.231 男 674 (75.3) 654 (72.8) 女 221 (24.7) 244 (27.2) 种族 0.859 白人 767 (85.7) 763 (85.0) 西裔 69 (7.7) 70 (7.8) 非裔 59 (6.6) 65 (7.2) 吸烟 <0.0001 从 无 291 (32.5) 310 (34.5) 1.39 (1.09–1.78) 曾经 239 (26.7) 441 (49.1) 1.00 未间断 365 (40.8) 147 (16.4) 3.97 (3.08–5.13) 喝酒 <0.0001 从无 235 (26.3) 398 (44.3) 1.00 曾经 206 (23.0) 149 (16.6) 2.12 (1.60–2.81) 未间断 454 (50.7) 351 (39.1) 2.10 (1.68–2.63) 家族史 0.748 有 516 (57.7) 511 (56.9) 1.00 无‡ 379 (42.3) 387 (43.1) 1.01 (0.83-1.23) *Differences between cases and controls were analyzed by two-sided 2 and Student’s t tests

实验室血样处理流程 Heparinized, 10-30 ml Sample collection (cases and controls) Lymphocyte isolation (frozen) CAT/Luc assays DNA repair capacity 2 ml each Transfection 1ml Plasma Serum PHA Spin Whole blood short-term culture 1ml Mutagen sensitivity assay BPDE Control Gamma BPDE- Induce DNA adducts DNA extraction 1ml RT- PCR for gene expression Long-term storage cDNA RNA Genotyping

烟草致癌物诱导的DNA损伤与修复机制 Benzo[a]pyrene BPDE 吸烟 O DNA恢复正常 HO OH DNA加成物 连接 过氧化酶 OH BPDE O HO DNA加成物 ERCC1 XPA XPB/ERCC3 XPC XPD/ERCC2 XPE/DDB1/2 XPE/ERCC4 XPG/ERCC5 吸烟 修复复合体 NER Core Proteins 连接 POL/, ligase PCNA, RFC RPA DNA恢复正常 Neumann et al., Mol Carcino, 2005

BPDE-诱导DNA加成物的检测 Li et al., Int J Cancer. 2001 头颈部肿瘤研究

变量 病例 (n = 803) 对照 (n = 839) P or OR (95% CI)* n (%) n (%) 总数 Cancer Res 2007; 67: (12). June 15, 2007 变量 病例 (n = 803) 对照 (n = 839) P or OR (95% CI)* n (%) n (%) 总数 加成物中位数 <0.0001 ≤ 29.22 / 107 295 (36.7) 420 (50.0) 1.00 > 29.22 / 107 508 (63.3) 419 (50.0) 1.71 (1.39–2.10) 白人 ≤ 29.22 / 107 235 (35.3) 355 (48.8) 1.00 > 29.22 / 107 431 (64.7) 338 (51.2) 1.81 (1.45–2.27) *Adjusted for the matching variables: age (in years), sex, ethnicity, smoking and alcohol use.

染色体对DNA损伤剂的敏感性测定

变量 病例 (n = 895) 对照 (n = 898) P or OR (95% CI)* n (%) n (%) 总数 Cancer Res 2008; 68: (11). June 1, 2008 变量 病例 (n = 895) 对照 (n = 898) P or OR (95% CI)* n (%) n (%) 总数 中位数 <0.0001 ≤ 0.43 347 (38.8) 441 (49.1) 1.00 > 0.43 548 (61.2) 457 (50.9) 1.57 (1.29–1.90) 白人 ≤ 0.43 302 (39.4) 382 (50.1) 1.00 > 0.43 465 (60.6) 381 (49.9) 1.56 (1.27–1.91) *Adjusted for the matching variables: age (in years), sex, ethnicity, smoking and alcohol use.

宿主报告基因的DNA损伤修复测定 pCMVluc pCMVcat 4863 bp 5000 bp BPDE BPDE BamH I Enh P Luc Bgl II Xbal I Pvu I BamH I Nar I pCMVluc pCMVcat 5000 bp cat Hind III EcoR I BPDE BPDE Qiao et al., Mutat Res, 2002

个体DNA修复功能与头颈部肿瘤发病分险 调整相对比数 DRC (%) 四分位数 修复功能 High Low 染色体敏感性 DNA加成物 趋势检验: P < 0.0001 病例 = 721 对照 = 721 Wang et al., CCR, 2009 趋势检验: P = 0.0001 染色体敏感性 Cases = 767 Controls = 763 Wang et al., Cancer Res, 2007 调整相对比数 Cases = 803 Controls = 839 趋势检验 : P < 0.001 DNA加成物 Li et al., Can Res, 2007 High Low DRC (%) 四分位数

反式蛋白质芯片测定修复蛋白水平 57病例，63对照 Wei et al., CEBP, 2005

NER修复蛋白水平与头颈部肿瘤发病风险 相对表达水平: 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 相对比数 ERCC1 XPA XPC XPD/ERCC2 XPF/ERCC4 XPG/ERCC5 (compared to beta-actin) 病例 = 57 对照 = 63 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 相对比数 Wei et al., CEBP, 2005

多碱基剪切修复基因多态位点及对其功能的影响 (nsSNPs in NER genes) Gene rs no. Allele 1 Allele 2 Codon Wt Variant Var fre ERCC1 None ERCC2 1799793 G A 312 ASP(D) ASN(N) 0.24 1052559 A C 751 LYS(K) GLN(Q) 0.22 ERCC3 None ERCC4 2020955 T C 662 SER(S) PRO(P) 0.06 ERCC5 17655 G C 1104 ASP(D) HIS(H) 0.38 ERCC6 2228528 G A 399 GLY(G) ASP(D) 0.22 2228526 A G 1097 MET(M) VAL(V) 0.18 2228527 A G 1213 ARG(R) GLY(G) 0.19 4253211 G C 1230 ARG(R) PRO(P) 0.08 2228529 A G 1413 GLN(Q) ARG(R) 0.19 XPA None XPC 2228000 C T 499 ALA(A) VAL(V) 0.24 2228001 A C 939 LYS(K) GLN(Q) 0.34

多碱基剪切修复基因多态位点与头颈部肿瘤发病风险 Gene Comparison Cases/Controls Risk* NER - SNPs 829 / 854 OR (95% CI) ERCC1 C8092A AA vs CC+CA 0.9 (0.6-1.4) XPA G23A AA vs GG+AG 0.9 (0.7-1.2) XPC Ala499Val Val/Val vs Ala/Ala+Ala/Val 1.7 (1.2-2.4) Lys939Gln Gln/Gln vs Lys/Lys+Lys/Gln 1.1 (0.8-1.4) ERCC2/XPD Asp312Asn Asn/Asn vs Asp/Asp+Asp/Asn 1.2 (0.9-1.7) Lys751Gln Gln/Gln vs Lys/Lys+Gln/Gln 1.1 (0.8-1.4) XPG/ERCC5 His1104Asp Asp/Asp vs His/His+His/Asp 0.8 (0.5-1.3) All SNPs combined as No. of variant homozygotes no. (%) no. (%) OR (95% CI) 0-2 114 (13.8) 140 (16.3) 1.0 3 453 (54.6) 477 (55.9) 1.2 (0.9-1.6) 4 194 (23.4) 177 (20.7) 1.4 (1.0-1.9) 5 53 (6.4) 55 (6.4) 1.2 (0.8-2.0) 6 15 (1.8) 5 (0.6) 4.1 (1.4-12.0) P for trend 0.017 * Adjusted for age, sex, smoking and alcohol use (An et al., CEBP, 2007)

结论 个体DNA修复功能低下增加头颈部肿瘤的发病风险 个体DNA修复功能低下可能有遗传因素决定 需要有大规模的病例-对照研究来揭示基因-基因和基因-环境的交互影响 需要有高通量基因型检测的平台，乃至个体全基因遗传变异的测定和建立多元回归预警数学模型