报告人：郭莹莹 导师：王靖飞副研究员 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 禽流感NS1与其抑制剂相互作用模式的分析 报告人：郭莹莹 导师：王靖飞副研究员 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

研究背景 禽流感是一种严重危害人类以及畜禽健康的致命性病毒，每隔十年左右就会流行一次 目前治疗禽流感药物主要作用靶点有神经氨酸酶和M2离子通道 。据报道以血凝素和RNA聚合酶为靶点也发现了一些活性化合物 获准上市的药品有神经氨酸酶抑制剂葛兰素史克公司（GlaxoSmithKline）生产的扎那米维（Zanamivir）和瑞士制药企业罗氏公司（Roche）生产的奥赛米韦（Oseltamivir）；以及M2离子通道阻断剂，包括金刚烷胺和金刚乙胺（Rimantadine）。目前市场上销售的达菲为罗氏制药独家生产的抗流感药物，其通用名称为磷酸奥司他韦（Oseltamivirphosphate），也就是前面所说的奥司他韦的磷酸盐

研究背景 NS1药物靶点： 优点：不易产生耐药性 NS1蛋白根据其功能被定义为两个区域：RNA结合域和效应区。RNA结合域（RNA-binding domain，RBD）在靠近dsRNA结合面有一个口袋，这个口袋已经被证明可以作为抗病毒药物设计的靶点 优点：不易产生耐药性 由于禽流感的抗原性以及M2蛋白变异致使耐药性的产生。NS1A中新活性位点的发现为我们提供了新的选择。由于NS1是一种非结构蛋白，以NS1蛋白为靶蛋白不易产生耐药性，对开发一种新的抗禽流感药物具有重要的意义 PDB ID：2zko

研究背景 NS1抑制剂的研究现状： Maroto等以这个结合口袋为靶点建立了一种高通量筛选方法用于寻找抗病毒药物，并成功筛选出3个有活性的抑制剂（结构未报导） Basu等也通过一种基于酵母的实验成功筛选出四个具有生物活性的抑制剂。但是由于缺乏三维结构数据资料，抑制剂的结合模式还不清楚 另外一些利用虚拟筛选方法寻找先导化合物的研究也已经开展 Maroto M, Fernandez Y, Ortin J, Pelaez F, Cabello MA. Development of an HTS assay for the search of anti-influenza agents targeting the interaction of viral RNA with the NS1 protein. J Biomol Screen. 2008; 13: 581-90. Basu D, Walkiewicz MP, Frieman M, Baric RS, Auble DT, Engel DA. Novel influenza virus NS1 antagonists block replication and restore innate immune function. J Virol. 2009; 83: 1881-91.

研究的目的意义 由于NS1抑制剂的作用模式并不清晰，阻碍了采用计算机辅助药物设计的手段发现新的先导化合物。本研究在分子结构水平对已知的NS1抑制剂作用模式进行研究，为设计、筛选新的药物提供了重要的参考

实验材料与方法 受体初始结构的准备 配体初始结构的准备 分子动力学模拟 能量最小化 分子对接 LibDock 对接后复合物进行动力学模拟 结果分析： 抑制剂结合能计算 抑制剂与关键氨基酸相互作用能计算

实验材料与方法 DS2.1构建 ，加电荷，加力场， 能量最小化（SD、CG） 抑制剂结构及其搭建 Basu D, Walkiewicz MP, Frieman M, Baric RS, Auble DT, Engel DA. Novel influenza virus NS1 antagonists block replication and restore innate immune function. J Virol. 2009; 83: 1881-91

实验材料与方法 禽流感毒株： A/PR/8/34（PR）（NS1晶体结构PDB ID：2zko） A/WSN/33（WSN） A/HK/19/68（HK） 序列比对结果：

实验材料与方法 受体结构的准备： 删除RNA 加入水分子 100ps 动力学模拟 模拟结果取其能量稳定后势能最低 时的构象作为对接时受体的初始结 构

实验材料与方法 分子对接： 1.活性位点的设定： Arg35 Arg38 Arg46 Ser42 2.结果选取： LibdockScore 构象合理性分析

实验材料与方法 复合物动力学模拟： 在水溶液中进行：TIP3P 20Å NaCl浓度：0.145 Simulation|Standard Dynamics Cascade protocol 首先优化整个体系，最陡下降法1000步，共轭梯度法1000步。优化完成后在2ps内体系温度从50K上升到300K，平衡态的模拟在300K的温度下进行160ps，每隔0.1ps进行一次取样，动力学40ps，采用PMF方法来计算体系的长程静电相互作用。分子动力学模拟在Dell PowerEdge 2900服务器上实现

实验材料与方法 1.结合自由能的计算 2.抑制剂与关键氨基酸相互作用能的计算 Discovery Studio2.1软件包中Receptor-Ligand Interaction|Calculate Binding Energy protocol计算配体与受体的结合能量 ΔGbinding = ΔGcomplex - ΔGprotein – ΔGligand 采用CHARMm力场隐性溶剂模型进行结合自由能的计算，首先分别计算复合物、受体以及配体的自由能，然后应用到公式（1）中。具体操作：受体加CHARMm力场，隐性溶剂模型选择PBSA（Poisson Boltzmann with non-polar Surface Area）模型，其他参数均为默认 2.抑制剂与关键氨基酸相互作用能的计算 Simulation| Calculate Interaction Energy protocol计算非键相互作用能，等于范德华相互作用能与静电相互作用能之和

实验结果 四个抑制剂与NS1RBD复合物经过200ps的动力学模拟过程达到了稳定，体系的动能、势能以及总能量均达到平衡。平衡后体系中总能量最低时构象即为抑制剂的结合模式 图1 依次为抑制剂NSC109834、NSC125044、NSC128164、NSC95676体系的分子动力学总能量变化图

实验结果 结合能计算结果： 分子动力学模拟平衡后的每个构象进行结合能计算后，每个抑制剂的能量最低值见表一，可以看出结合能的大小与抑制剂活性顺序有很好的吻合 表1 抑制剂与NS1 RBD结合能计算结果 Ligand Binding Energy Ligand Energy Protein Energy Complex Energy Name (kcal/mol) NSC109834 7.52481 9.52537 -6922.180176 -6905.13 NSC125044 15.2551 247.115 -6986.350098 -6723.98 NSC95676 43.62322 111.187 -6361.720215 -6206.91 NSC128164 53.048 80.7421 -6920.600098 -6786.81

实验结果 抑制剂与关键氨基酸相互作用能结算结果： 通过氨基酸相互作用能的计算发现抑制剂周围6Å内所有氨基酸相互作用能量值的范围是-72.061996(kcal/mol)到128.501999(kcal/mol)，其中大部分氨基酸的相互作用能在-9.35413(kcal/mol)与3.51374(kcal/mol)之间，并且在结合的过程中静电力起主要作用。表2和表3显示了NS1 RBD活性位点上几个关键氨基酸的相互作用能量值

实验结果 抑制剂与关键氨基酸相互作用能结算结果 表2 6Å内关键氨基酸残基与抑制剂NSC95676、NSC109834相互作用能量值 Ligand NSC95676 NSC109834 Residue Interaction Energy VDW Interaction Energy Electrostatic Interaction Energy (kcal/mol) A_ARG38 85.672798 -5.38927 91.062103 59.996601 -2.47204 62.468601 B_ARG38 128.50199 -4.01051 132.513 32.929901 -0.433746 33.363602 A_SER42 2.53018 -0.835962 3.36614 3.51374 -1.67238 5.18612 B_SER42 3.41912 -0.151249 3.57037 3.01978 -0.523707 3.54349 A_ASP39 -68.008202 -3.54429 -64.463898 -71.6054 -3.25482 -68.350601 B_ASP39 -46.772202 -3.21317 -43.558998 A_ASP12 -31.105101 -0.095429 -31.009701 -50.400799 -3.12239 -47.2784 B_ASP12 -0.958307 -0.075247 -0.88306 -26.8382 -1.97626 -24.8619 A_ARG35 -6.09017 -0.427784 -5.66239 B_ARG46 -1.65897 -1.23013 -0.428843 B_ASP34 -72.061996 -0.230823 -71.8312

实验结果 抑制剂与关键氨基酸相互作用能结算结果： 表3 6Å内关键氨基酸残基与抑制剂NSC125044、NSC128164相互作用能量值 Residue Interaction Energy VDW Interaction Energy Electrostatic Interaction Energy (kcal/mol) A_ARG38 -5.45867 -1.26865 -4.19002 -4.74229 -0.536399 -4.20589 B_ARG38 -1.9401 -0.18553 -1.75457 -2.3797 -1.38416 -0.995543 A_SER42 -4.37396 -0.607618 -3.76634 -0.652207 -0.291998 -0.360209 B_SER42 -0.318783 -0.442241 0.123458 -4.8579 -1.98278 -2.87512 A_ASP39 -1.97786 -2.30182 0.323964 -0.32795 -3.55333 3.22538 B_ASP39 -2.79768 -4.63966 1.84198 A_ASP12 -17.8207 -2.53202 -15.2887 -0.38189 -2.24131 1.85942 B_ASP12 -1.35336 -2.80018 1.44682 A_ARG35 -5.94808 -1.5997 -4.34838 -2.91325 -2.02404 -0.889211 B_ARG35 -0.6663 -2.12079 1.45449 -1.83942 -1.02273 -0.816695 B_ARG46 -9.35413 -5.06717 -4.28696 A_ARG19 -14.8776 -0.358218 -14.5194 -10.7474 -4.16254 -6.58482 B_ARG19 -34.093201 -4.43612 -29.657101 -6.30068 -3.389 -2.91168

图2 四个抑制剂与NS1 RBD结合口袋结合模式 讨论与结论 结合模式预测： 图2 四个抑制剂与NS1 RBD结合口袋结合模式 黑色：NSC95676 蓝色:NSC109834 紫色：NSC128164 绿色：NSC125044

讨论与结论 NSC109834：占位作用 排斥Arg38、Ser42 NSC109834与2zkoNS1 RBD 叠合，RMSD=1.46 NSC109834使得dsRNA上A5无法再与Ser42形成氢键

讨论与结论 NSC95676 占位作用，竞争性结合

讨论与结论 NSC125044 整个抑制剂分子呈现电负性， 对呈负电的RNA骨架产生强烈的排斥作用

讨论与结论 NSC128164 电中性 占位作用

讨论与结论 结论： 当抑制剂能够产生占位作用并且对NS1 RBD结合RNA的关键氨基酸Arg38、Ser42产生较强的排斥作用时抑制剂的活性较强 在药物设计中我们可以着重发展以此种模式结合的先导化合物，并且可以采用基于结构的虚拟筛选方法寻找新型、高效的抑制剂

谢谢！