high performance liquid chromatograph 高效液相色谱 high performance liquid chromatograph HPLC 2019/4/10

内容摘要 概述 特点 工作流程 主要部件 主要分离类型及原理 制备型液相色谱 2019/4/10

概述 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。 2019/4/10

特点 高效液相色谱采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备如下特点： 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏度：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测） 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。 2019/4/10

工作流程 2019/4/10

主要部件 高压输液泵 压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。 具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。 2019/4/10

梯度淋洗（洗脱）装置 外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。 内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。 2019/4/10

进样装置 流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示： 2019/4/10

高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 2019/4/10

液相色谱检测器 a. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm × 10mm ，容积 8μL）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。 2019/4/10

b. 光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。 2019/4/10

c. 示差折光检测器 除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比； 通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱； 偏转式、反射式和干涉型三种； 2019/4/10

d. 荧光检测器 高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应； 2019/4/10

主要分离类型及基本原理 液-固吸附色谱 液-液分配色谱 离子交换色谱 离子色谱 离子对色谱 排阻色谱 亲和色谱(AC) 2019/4/10

液-固吸附色谱 固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾； 2019/4/10

液-液分配色谱 固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。 2019/4/10

离子交换色谱 固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH- 应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。 2019/4/10

离子色谱 离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一种技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。 2019/4/10

离子对色谱 原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配； 阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子； 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子； 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配。 2019/4/10

排阻色谱 固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。 全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离 2019/4/10

亲和色谱(AC) 原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。 2019/4/10

HPLC的应用 HPLC适于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产物；合成的和天然的高分子化合物等。它们涉及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及环境污染物等，约占全部有机化合物的80%。 其余20%的有机化合物，包括永久性气体，易挥发低沸点及中等分子量的化合物，只能用气相色谱法进行分析。 2019/4/10

环境中有机氯农药残留量分析 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。 固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。 2019/4/10

稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 ～100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 ºC 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器 2019/4/10

制备型液相色谱 制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后配有馏分收集器。 2019/4/10

制备液相色谱的应用 制备液相色谱技术越来越广泛地应用于制药、化工和生物工程等领域中样品的分离和纯化。典型的应用如合成原料的纯化，标准物质的制备，最终产品的提纯等方面。 2019/4/10