信号序列(signal sequence) ◆研究过程 ●1960s ,George Palade 示踪技术研究培养细胞中蛋白质的分泌 ●Redman和Sabatini用分离的RER小泡研究膜结合核糖体合成的蛋白质去向 ●1971年美国洛克菲勒大学的Blobel等提出了信号序列(signal sequence)的概念。
同位素示踪:分泌途径研究
蛋白质进入核糖体实验
◆信号序列的间接证据 1972年, Milstein 和他的同事发现: ●从细胞质分离的IgG轻链: 多20个氨基酸残基 ●释放到细胞外的IgG轻链: 少20个氨基酸残基
◆信号肽的证实 G.Blobel等用离体实验证实了信号肽的存在: ●RER对产物的影响 ●蛋白水解酶实验 ●多聚核糖体的离体翻译
体外合成实验
多聚核糖体实验
信号肽的特性 ◆序列特征 15-35个氨基酸残基，其中含有4-12个疏水残基 ◆特异性: ◆位置: ●N-端突出的一段肽 ●内含信号肽。
早期信号假说(signal hypothesis) 1975年，Blobel等正式提出了信号假说,要点是: ◆合成始于游离核糖体; ◆N端信号序列靠自由碰撞与内质网膜接触,然后插入内质网的膜; ◆蛋白质以袢环形式穿过内质网的膜; ◆蛋白的存在方式: ●若信号序列被信号肽酶切除:完全进入腔 ●若是停止转移信号: 膜蛋白
信号识别颗粒与停靠蛋白 ◆signal recognition partical, SRP ●SRP is a cytosolic ribonucleoprotein particle ● Six discrete polypeptides ● A 300-nucleotide RNA ●三个功能域: ▲翻译暂停结构域(P9/P14) ▲信号肽识别结合位点(P54) ▲SRP受体蛋白结合位点(P68/P72)。
Signal recognition partical
◆Docking protein, DP ◆易位子( translocon) ●是SRP在内质网膜上的受体蛋白 ●两个亚基:亲水的α亚基, 疏水的β亚基 ◆易位子( translocon) ●Multiple copies of the Sec61 complex assemble to form a cylinder translocon channel ●5～6 nm high and 8.5 nm in diameter, with a central pore, roughly 2 nm in diameter ●哺乳动物细胞中有三种类型的Sec61, 即α、β和γ ●Sec61α有10个跨膜α螺旋
Signal hypothesis
Signal hypothesis
体外实验证明SRP颗粒、SRP受体的作用
SRP-DP识别的GDP-GTP交换循环
内质网转运游离核糖体合成的蛋白质
Orientation of menbrane proteins ?
跨膜信号与膜蛋白的定向 ◆单次跨膜蛋白 ? ●起始转移信号(start transfer signal) ◆单次跨膜蛋白 ? ●起始转移信号(start transfer signal) ●终止转移序列(stop transfer sequence) ●可切割的信号序列(Cleavable signal sequence) (N-端) ●内部信号序列(internal signal sequence) (internal noncleavable signal sequences )
信号肽与起始跨膜序列 ?
Stop transfer sequence ?
内部信号序列 ?
◆单次跨膜蛋白的定向 ●Cleavable signal sequence ●Internal signal sequence amino terminus exposed to the cytosol ●Internal signal sequence ▲Amino terminus exposed to the cytosol ▲Carboxy terminus exposed to the cytosol
单次跨膜蛋白的定向I ?
单次跨膜蛋白的定向II
◆停止转运信号与多次跨膜蛋白的定向 ●产生: Proteins that span the membrane multiple times are thought to be inserted as a result of an alternating series of internal signal sequences and transmembrane stop-transfer sequences. ●定向:?
二次与多次跨膜蛋白
多个起始与终止跨膜信号
Major topological classes of integral membrane proteins synthesized on the rough ER.
信号序列与膜蛋白定向 ?
Protein Folding and Processing in the ER ◆Protein folding in the ER ●Bip蛋白∶ Bip是一类分子伴侣是重链结合蛋白的简称(heavy-chain binding protein) ●BiP is thought to bind to the unfolded polypeptide chain as it crosses the membrane and then mediates protein folding and the assembly of multisubunit proteins within the ER
BiP蛋白在ER中的作用
◆蛋白质在内质网中的加工与修饰 ●The formation of disulfide bonds between the side chains of cysteine residues:protein disulfide isomerase ●N-linked glycosylation ●Addition of glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchors ●Export of Proteins from the ER
The formation of disulfide bonds
N-linked glycosylation
Addition of GPI anchors
Export of Proteins from the ER
9.3 Golgi complex ◆高尔基器(Golgi apparatus)或高尔基复合体(Golgi complex) ◆意大利科学家Camillo Golgi在 1898年发现的。
9.3.1 高尔基体的结构和极性 形态结构 连续的整体膜结构。 ◆扁平囊泡(sacuules) ◆小囊泡(vesicle) ◆大囊泡(vacuoles)
高尔基体的形态结构
高尔基体的极性 ◆高尔基内侧网络 (cis-Golgi network, CGN) 顺面、形成面 ◆中间潴泡 (medial cisternae) ◆高尔基外侧网络 (trans Golji network,TGN) 外侧面、成熟面
Regions of the Golgi apparatus
数量与化学组成 ◆数量 分泌功能越旺盛的细胞,越多。 ◆蛋白质和脂 高尔基复合体高于内质网和质膜: 质 膜: 蛋白质 40%, 脂 60%; 内质网: 蛋白质 20%, 脂 50-60%; 高尔基体: 蛋白质 60%, 脂 40%; ◆高尔基复合体的标志酶是糖基转移酶。
9.3.2 高尔基体的功能 蛋白质运输 ◆ER到高尔基体内侧的运输 ◆ER蛋白的逆向运输 ◆高尔基体内侧到高尔基体外侧运输
高尔基体的蛋白运输作用
◆ER驻守蛋白的驻守机制 ●内质网驻守信号(ER retention signal): Lys-Asp-Glu-Leu-COO-，即KDEL信号序列 ●KDEL信号受体 ▲内质网膜 ▲高尔基体膜
ER保留蛋白的运输
内质网蛋白的运输
Protein Glycosylation within the Golgi
Processing of N-linked oligosaccharides in the Golgi
◆高尔基体进行蛋白质糖基化和转运的实验证明: ●中国仓鼠卵巢细胞突变体: N-乙酰葡萄糖胺转移酶缺陷 ●水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV), 它能够编码一种膜整合的糖蛋白(VSV-G) ●感染实验 ●分离、检测分析
高尔基体膜囊中进行的蛋白质糖基化和转运
Protein Sorting and Export from the Golgi Apparatus ◆分选的概念 ●广义 ●狭义: ▲内膜系统中的蛋白质分选作用 ▲高尔基体外侧网络的分选作用 ●分选作用主要是由信号序列和受体之间的相互作用决定的
Protein Sorting
高尔基体进行的蛋白质的分选
某些类型的信号肽特征
9.4 溶酶体(lysosome) ◆动物细胞内的一种细胞器 ◆小球状,外面由一层单位膜包被 ◆溶酶体含有50多种水解酶类,在细胞内起消化和保护作用 ◆当细胞被损伤时,溶酶体可释放出水解酶类,使细胞自溶
电子显微镜下的溶酶体
9.4.1 溶酶体的形态结构 溶酶体的形态发现 溶酶体是一种异质性(heterogenous)的细胞器,呈小球状。大小变化很大，直径一般0.25～0.8μm，最大的可超过1μm,最小的直径只有25-50nm。 溶酶体的发现
溶酶体的发现