第六章 细胞融合

主要内容 1、细胞融合的概念、意义 2、细胞融合的方法和基本程序 4、融合杂种细胞的选择与鉴定 5、植物细胞融合和体细胞杂交 第六章　体细胞杂交

植物细胞 动物细胞 第六章　体细胞杂交

一、体细胞杂交的概念、意义 1、细胞融合（cell fusion）概念： 细胞融合是20世纪60年代发展起来的一项细胞工程技术也称体细胞杂交（somatic hybridization） 、原生质体融合，是指将不同来源的原生质体相融合并使之分化再生,形成新物种或新品种的技术。 第六章　体细胞杂交

第六章　体细胞杂交

第六章　体细胞杂交

2、细胞融合的意义 1）有性杂交变无性杂交,加快育种速度 2）打破远缘杂交的不亲和性 3）创造新细胞质杂种 4）单克隆抗体制备 第六章　体细胞杂交

3、细胞融合的一些基本概念 同核体（homokaryon）： ——基因型相同的细胞融合成的杂交细胞； 异核体（heterokaryon）： ——来自不同基因型的杂交细胞 自发融合： ——同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并； 诱发融合： ——异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。 第六章　体细胞杂交

4、细胞融合的发展历史 1858年，菲尔绍夫报道了正常组织、发炎组织及肿瘤组织中出现多核细胞情况； 1875年，兰格第一个观察到脊椎动物(蛙类)的血液细胞合并现象； 1962年，日本冈田善雄发现HVJ病毒能引起艾氏腹水肿瘤细胞融合成多核的现象； 1965年，英国海利斯进一步证实灭活的病毒可诱发动物细胞融合； 70年代,华裔加籍科学家高国楠发现聚乙二醇PEG能促使植物原生质体的融合； 从这开始,始于动物的细胞融合也扩展到植物和微生物细胞. 第六章　体细胞杂交

二、体细胞杂交的原理与方法 1、原理（以植物细胞为例） 、去除细胞壁以获得大量的原生质体 、诱导细胞融合形成杂种细胞 细胞相互靠近 形成细胞桥 – 最关键的一步 胞质渗透 细胞核融合 、筛选,培养,促进细胞分裂,分化, 、从细胞团,愈伤组织到最后成株 细胞融合经历步骤 第六章　体细胞杂交

细胞融合经历的步骤 原生质体或细胞互相靠近 细胞桥形成 胞质渗透 细胞核融合 第六章　体细胞杂交

2、方法 生物法——仙台病毒法 化学法——PEG等 物理法——电融合法 第六章　体细胞杂交

1）生物法——仙台病毒法 原理：病毒被膜具有凝聚细胞的能力，它一边黏连一个细胞的表面，另一边黏连另一个细胞的表面，从而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结，诱导细胞的融合。 第六章　体细胞杂交

两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近； 病毒促使细胞融合的主要步骤： 两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近； 通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透； 两个原生质体的细胞核互相融合，融为一体； 进入正常的细胞分裂。 第六章　体细胞杂交

2）、化学法 主要包括： 盐类融合法（NaNO3） 高Ca2+和高pH值诱导法 聚乙二醇（PEG）融合法 PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法 第六章　体细胞杂交

盐（如NaNO3）能中和原生质体表面的电荷，促进原生质体的聚集，诱导细胞的融合。 盐类融合剂种类 硝酸盐类：NaNO3、KNO3、Ca(NO3) 2 氯化物类：NaCl、CaCl 2 、Mg Cl 2 、 BaCl 2 葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠 第六章　体细胞杂交

优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小； 盐类融合的优缺点 优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小； 缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发融合。 第六章　体细胞杂交

 、高Ca2+和高pH值融合 、Ca2+浓度 0.05 mol/L  、pH 9.5-10.5 第六章　体细胞杂交

具体做法(以烟草为例) a. 取分离、纯化好的两种亲本原生质体以1:1的比例混合; b. 加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇; c. 再用甘氨酸钠缓冲pH值到10.5，成为融合液，同时在37℃下保温0.5h; d. 用0.4mol/L甘露醇洗净高CaCl2和高pH值； 两种原生质体的融合率达到10%。 第六章　体细胞杂交

. 聚乙二醇（PEG）融合法 Polyethylene glycol(PEG)是一种多聚化合物,分子式H(OHCH2-CH2)nOH, 平均相对分子量200-20000之间。 第六章　体细胞杂交

 PEG分子具有轻微的负极性，与具有正极性基团的物质形成氢键，在原生质体之间形成分子桥，使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合； 第六章　体细胞杂交

PEG诱导原生质体融合过程 细胞融合示意图 第六章　体细胞杂交

细胞融合操作流程图 第六章　体细胞杂交

用培养液缓慢稀释PEG最后洗去PEG； 具体过程： 收集原生质体； 用PEG处理40-50 min； 用培养液缓慢稀释PEG最后洗去PEG； 细胞选择与培养 第六章　体细胞杂交

PEG诱导融合的优点与缺点 优点： 融合成本低，勿需特殊设备； 融合子产生的异核率较高； 融合过程不受物种限制。 缺点： 融合过程繁琐；  PEG可能对细胞有毒害。 第六章　体细胞杂交

 PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法 先用PEG处理30min；（PEG是相邻原生质体表面间的分子桥）； 第六章　体细胞杂交

改变原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。 3）物理法—电融合法 原理： 改变原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。 第六章　体细胞杂交

电融合操作基本过程 将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室，微电极型只有一个小室，平行电极型有4个小室，两电极间隔3mm，整个装置放在一个培养皿中 微电极型：用5-12微安的脉冲电流间断刺激1-5毫秒，原生质体在几秒到几十秒钟的时间内会发生暂时性的收缩，两层膜之间形成小孔，连接成桥，形成一个个泡囊，经点连接到面连接，最后形成融合体,整个过程约10-30分 或3 平行多电极融合装置法：经过1兆赫如150V/cm交流电场发生双向电脉冲，原生质体在电场力的作用下，极化产生偶极子，原生质体紧密排开成串珠状。在适当时间和强度的直流电脉冲(50ms,1.2-2KV/cm)作用下，质膜发生被击穿，进一步形成融合体 第六章　体细胞杂交

细胞电融合过程 第六章　体细胞杂交

细胞膜的接触：电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，使原生质体极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串； 融合过程： 细胞膜的接触：电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，使原生质体极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串； 膜的击穿：高频直流脉冲使原生质膜击穿，导致两个紧密接触的细胞融合在一起。 第六章　体细胞杂交

四、是可在显微镜下观察或录像融合过程，免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。 电融合优点： 一、是不存在对细胞的毒害问题； 二、是融合效率高，重复性强； 三、是融合技术装置精巧，操作简便。 四、是可在显微镜下观察或录像融合过程，免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。 第六章　体细胞杂交

3、原生质体融合类型 对称融合（symmetric fusion）： 即两个完整的细胞原生质体融合。 非对称融合（asymmetric fusion）： 利用物理或化学方法使某亲本的核或 细胞质失活后再进行融合。 第六章　体细胞杂交

常采用射线处理，如X射线、射线等，使细胞核失活； 核或细胞质失活的方法： 物理方法： 常采用射线处理，如X射线、射线等，使细胞核失活； 化学处理： 核失活－碘乙酰胺、碘乙酸； 细胞质失活－罗丹明（能抑制线粒体的氧化磷酸化过程）。 第六章　体细胞杂交

PEG诱导法：PEG规格、纯度，作用时间 4、影响原生质体融合的因素： ⊙首先，原生质体质量； ⊙其次，融合方法： PEG诱导法：PEG规格、纯度，作用时间 电诱导法：原生质体密度、交流电压 、交变 电场的振幅频率、交变电场的处理时间、直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数。 第六章　体细胞杂交

三、杂种细胞的发育、选择与鉴定 1、杂种细胞的发育动态： 核质重组 细胞器重组 部分核物质或细胞器丢失 核分裂的非同步性 第六章　体细胞杂交

2、体细胞杂种的特点： 形态上的趋中性 变异幅度大 非整倍性 双亲性状的共显性 偏亲现象 第六章　体细胞杂交

3、杂种细胞的选择系统： 外观选择 互补选择 荧光标记选择 其它方法 第六章　体细胞杂交

根据融合后异核体和亲本原生质体的形态特征之区别； 外观选择 根据融合后异核体和亲本原生质体的形态特征之区别； 利用亲本原生质体大小、颜色、漂浮密度及电脉差异率等差异选择杂种。 第六章　体细胞杂交

如采用显微操作技术也能把单个异核体分离出来进行培养。 互补选择（遗传或抗性） 例如：选择一个叶绿体缺失突变体，这一突变体在限定培养基上，能分裂、分化形成植株。具有正常叶绿素的植株，在上述限定培养基上，则不能分裂形成大细胞团（愈伤组织）； 其他方法： 如采用显微操作技术也能把单个异核体分离出来进行培养。 第六章　体细胞杂交

4、体细胞杂种的鉴定 ? 形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。 细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定（如核型）。 4、体细胞杂种的鉴定 ? 形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。 细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定（如核型）。 生化鉴定：同功酶鉴定。 分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。 第六章　体细胞杂交

5、体细胞杂种的应用： 1、植物育种中的核质替换 2、细胞质杂种的获得 3、远缘杂交创造新物种 4、细胞器的互作研究 第六章　体细胞杂交

6、体细胞杂交面临的困难： 融合特性的高效性； 杂种细胞的培养和选择； 杂种的遗传稳定性控制。 第六章　体细胞杂交

四、植物细胞融合 1、定义： 离体条件下用人工的方法把不同的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术 第六章　体细胞杂交

1960年，Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功； 植物细胞杂交的几个重要进展 1960年，Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功； 1970年，Power首次用硝酸钠为诱导剂进行了较大规模的原生质体诱导融合； 1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这也是第一个植物细胞杂种； 1974年，Kao将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术； 1978年，Melchers获得了第一个属间细胞杂种（番茄＋马铃薯）； 1981年，Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念； 1987年，Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序 第六章　体细胞杂交

2、植物细胞融合的程序 植物原生质体分离 原生质体纯化 原生质体融合 细胞杂种的选择 愈伤组织形成器官分化植株再生 杂种植物鉴定 第六章　体细胞杂交

3、植物细胞杂种的选择和鉴定 1）融合体的类型 2）细胞杂种选择的方法 3）细胞杂种的鉴定 第六章　体细胞杂交

融合体的类型： 自体融合：发生在亲本原生质体自身 异体融合：发生在双亲原生质体之间 第六章　体细胞杂交

异体融合：  谐和的细胞杂种：具有双亲全套染色体组的异源两倍体；  部分谐和的细胞杂种：双亲的染色体经逐步排斥，便发生少数染色体的重组，然后进入同步分裂，最后形成带有部分重组染色体的植株；  异胞质体细胞杂种：亲本的染色体全部被排斥，但胞质是双亲的；  嵌合细胞杂种：不同种的双亲原生质体，发生了膜融合和胞质融合，尚未发生核融合。双亲的细胞核各自发生核分裂，接着形成细胞壁，最终形成嵌合体植物 第六章　体细胞杂交

五、动物细胞融合 六、微生物细胞融合 第六章　体细胞杂交

几种细胞融合成功的例子 融合生物种类 细胞来源 成功年代 烟草两个种间 叶——叶 1972 甘蓝——青菜 叶——根 1972 融合生物种类 细胞来源 成功年代 烟草两个种间 叶——叶 1972 甘蓝——青菜 叶——根 1972 大豆——马唐草 愈伤组织——叶 1972 矮牵牛——龙面花 叶——花瓣 1973 大麦——花生 种子——种子 1974 大麦——大豆 叶——悬浮细胞 1974 小麦——矮牵牛 叶——花瓣 1974 玉米——大豆 叶——悬浮细胞 1974 大豆——野碗豆 悬浮细胞 ——悬浮细胞 1974 大麦——蚕豆 叶——根 1975 大豆——草香木犀 悬浮细胞 ——叶 1976 酵母菌——鸡 原生质体——血红细胞 1976 大豆——烟草 悬浮细胞 ——叶 1976 人——胡萝卜 腹水癌细胞——原生质体 1976 番茄——马铃薯 叶——根尖 1978 人——小鼠 纤维肉瘤细胞——畸胎瘤细胞 1978 第六章　体细胞杂交

1978年德国科学家梅歇尔斯等人把马铃薯(potato)和番茄(tomato)的原生质体融合获得了体细胞杂种“泡马豆”（pomato) 第六章　体细胞杂交

小结 细胞融合的定义,基本概念和意义； 细胞融合基本原理和过程； 细胞融合的方法和细胞杂种的鉴定； 植物细胞融合。 第六章　体细胞杂交