DNA 重组与转座

DNA重组 Holliday模型 DNA重组有关的酶 位点特异性重组 细菌的基因转移与重组

一、DNA重组 1、概念：是指由于不同DNA链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换和重新组合，形成新的DNA分子的过程。 2、意义：重组是遗传学的灵魂，没有重组就没有生物的进化；没有重组也就没有现代的分子克隆技术。

3、DNA重组的类型 同源重组（Homologous Recombination） 位点特异性重组（Site-specific Recombination） DNA的转座（transposition）

染色体配对时形成的联会复合体结构电镜照片

细菌同源重组的机制--- Holiday重组模型 1964年Holliday提出，很好地解释了高等的真核的重组和真菌中发现的基因转变的现象。 近代Potter.H和Dressler,D.在噬菌体中的拍摄到Hollidy结构的电镜照片，为Holliday模型提供了一个有力的证据。

2. 酶切。通过核酸酶和RecBCD蛋白复合体的作用在一对同源DNA上产生切口； 1. 同源序列排列在一起； 2. 酶切。通过核酸酶和RecBCD蛋白复合体的作用在一对同源DNA上产生切口； 3.入侵。含有3’端切口的ssDNA被recA蛋白包裹形成recA蛋白-ssDNA细丝；RecA-ssDNA 细丝寻找相对的DNA双螺旋上的相应序列。 3. 含有3’端切口的ssDNA被recA蛋白包裹形成recA蛋白-ssDNA细丝；

4. 游离端交叉连接，形成Holliday 结构 5.通过分支迁移产生异源双链DNA。 十字形结构

6. 空间重排。十字型两臂旋转180度 7. 解离(两种不同方式) 8. 修补连接

二、与DNA重组有关的酶 在遗传重组过程中，尤其在同源重组中需要recA蛋白和recBCD蛋白。 recA蛋白由E.coli自身编码，此蛋白有353个氨基酸组成，分子量38000 Da

（一）RecA 1、作用：可促进单链同化或单链吸收 RecA具有使DNA单链置换双链中同源链的能力

2、单链同化发生的三个条件 （1）其中一个DNA必须存在单链区 （2）其中一个DNA必须有一个自由3’末端 （3）此单链区和3’末端必须位于两分子之间互补的区域内 王莲哲 制作

任何部位的ssDNA都可以借助RecA与同源dsDNA进行链的交换 王莲哲 制作

Chi位点---RecBCD识别的靶位点 5' GCTGGTGG 3' 3' CGACCACC 5' 1、酶的活性： （1）核酸外切酶 （2）核酸内切酶 （3）解旋酶 2、作用： 在Chi位点处产生含3ˊ游离未端单链 Chi位点---RecBCD识别的靶位点 5' GCTGGTGG 3' 3' CGACCACC 5' 是重组频率较高的部位，E.coli中每隔约5~11 kb有一个拷贝 RecBC酶是由recB和recC基因编码的

三、位点特异性重组： （site-specific recombination ） 概念：是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。 位点特异性重组不依赖于DNA序列的同源性，而依赖于能与某些酶结合的特异DNA序列的存在。

位点特异性重组与同源重组的区别： ① 同源重组中DNA链的切断是完全随机的； 位点特异性重组是在某些特异的DNA序列处发生重组。 原来的顺序排列； 位点特异性重组中DNA片段的相对位置发生了移动，即DNA序列发生重排，从而得到不同的结果。

λ噬菌体DNA对E.coli 的整合 1、λ噬菌体DNA的整合作用： λ噬菌体感染大肠杆菌后，有两种生活方式： ① 裂解生长途径（溶菌生长）：lysis pathway ② 溶源菌生长途径：lysogenic pathway

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λ噬菌体在溶源周期和裂解周期中，其DNA状态不同，两种状态的相互转变（整合与切离）是通过位点特异性重组实现的。 这些特异位点叫附着点（attachment site），简称为 att位点。

λ噬菌体的整合作用有两个特点： ① λDNA和宿主DNA的交换是可逆的，原先存在的DNA序列全部被保存下来，并无丢失。

2、λ噬菌体整合的分子机制 催化重组的酶 整合酶 Int (integrase)：有拓扑异构酶活性 整合宿主因子（IHF，integration host factor ） 切除酶（excisionase）/ 终止重组

重组位点： 重组过程： attP（ POP’）和attB（ BOB’）有15bp核心序列配对 附着位点（attachment site） attP（ POP’）和attB（ BOB’）有15bp核心序列配对 重组过程： 整合： POP’ + BOB’ →BOP’—POB 切离：BOP’—POB’ → POP’ + BOB’

attP attB 王莲哲 制作

整合的过程 （1）具有对特异性DNA强烈亲和力的Int与attP和attB位点结合。 （3）同时在另两条单链之间发生同样的断裂重 接，从而完成双链间的重组。

四、细菌的转移与重组 1、接合 2、转化 3、转导 4、细胞融合

1、接合作用（conjugation) 　当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用。 王莲哲 制作

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2、转化作用（transformation) 　　　通过自动获取或人为地供给外源DNA， 使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。

3、转导作用（transduction) 当病毒从被感染的细胞（供体）释放出来，再次感染另一细胞（受体）时，发生在供体细胞与受体细胞之间DNA转移及基因重组。

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4、细胞融合

小结 DNA重组 Holliday模型 DNA重组有关的酶 位点特异性重组 细菌的基因转移与重组

11.2 DNA转座 转座子的概念 转座子的分类 转座过程发生的机制 转座子转座特征 转座引起的遗传学效应 真核生物转座因子 反转录转座子

一、转座子概念 转座子（transponsn）, 又称易位子，是指存 在于染色体DNA上可以自主复制和位移的一 段DNA顺序。 转座子可以在不同复制子之间转移，以非正 常重组方式从一个位点插入到另外一个位 点，对新位点基因的结构与表达产生多种遗 传效应。

转座因子的发现和检出 McClintock 1938年，提出转座基因概念 1944-1950，阐明“Ds-Ac调控系统” 1983年，获诺贝尔生理医学奖 J.Shapiro等 1980年，证实了可移位的遗传基因存在

Nobel Prize for Physiology or Medicine 1983 Barbara McClintock (1902-1992) Nobel Prize for Physiology or Medicine 1983

二、转座子的类型 两种类型： A 简单转座子（simple transposon）或（插入序列 insertion sequence IS ） B 复合转座子（composite transposon）

1、IS （插入序列, insertion sequences） 特点（1）比较小，0.75~1.5kb; （2）只有转座酶基因 （3）两端有反向重复序列; IR（inverted repeat） IR 转座酶识别IR(inverted repeat),与之结合. 在Tn中,有功能的IS可以转移其本身或内部基因. 当两端IS组件(module)相同时,转移可由任意一个完成( Tn903). 当两端不相同时.其功能可能有差异(Tn11,2.5%差异,左IS无功能). Tn的整体转座多于其两端的IS主要是对抗性基因的选择的结果. Mu转座酶-TnpA; 解离酶-TnpR;拆分点-Res site Transposase IS

ATGCA TACGT ATGCA 12345678 TACGT 12345678 87654321 ATGCA Inverted repeat Target repeat IS1 9 bp 23 bp 768 bp IS2 5 bp 41 bp 1327 bp IS4 11-13 bp 18 bp 1428 bp IS5 4 bp 16 bp 1195 bp IS11R 9 bp 22 bp 1329 bp IS50R 9 bp 9 bp 1531 bp IS903 9 bp 18 bp 1157 bp

IS的插入位点随机，转座是罕见的，与自发突变率同一个数量级，精确切离使IS诱发的突变回复为野生型，不精确切离可导致附近基因的缺失。 插入序列在插入靶位点上都会生成短正向重复序列。

2、Tn （复合转座子, composite transposons） 特点： （1） 2-11kb; （2）两端有两个相同或高度同源IS序列 （3）含转座酶基因 / 抗生素基因 IS IS Tn Transposon makers

IRL IRR Transposon makers Tn9 IS1 camR IS moduls identical both functional Transposon makers Tn903 IS903 kanR both IS functional Tn10 IS10L tetR IS10R nonfunctional functional Tn5 IS50L kanR IS50R The IS elements code for transposase activities that are responsible both for creatiing a target site and for recognizing the ends of the transposon. only the ends are needed for a transposon to serve as a substrate for transposition.

3、TnA （TnA family） 特点： （1）5~25kb; （2）两端IR（30~40bp）相似或相同；两端无IS组件; （3）转座酶基因 / 解离酶基因 / 抗生素基因 （4）Res位点：与共整合体的解离有关 TnA Res Transposase Resolvase Ampr IR IR

三、转座过程发生机制 1、转座的一般模式 转座子插到新的位点上，靶DNA上产生交错切口，所形成的单链末端与转座子两端的反向重复序列相连，由DNA聚合酶填补缺口，DNA连接酶封闭切口。 转座结束后，靶DNA发生一个整向重复序列。

2、复制型转座模式(replicative transposition) 转座子作为可移动的元件被复制，一个拷贝保留在供体原来的部位不变；另一个拷贝则插入到受体的位点上，结果供体和受体都有一个转座子的拷贝。 需两种酶： 转座酶(transposase)：作用于靶位点和原来转座子两端。 解离酶(resolvase)：作用于复制后的拷贝。

过程: a) 共合体形成 切口－连接－复制

b) 拆分 靶位点的DR形成 王莲哲 制作

3、 非复制型转座（nonreplicative transposition) 转座子从供体一个位点转移到受体新位点处，供体位点留下缺口，受到损伤（严重时致死）或宿主修复系统识别修复。 只需转座酶

四、转座子转座特征 不依赖供体序列与靶位点间序列的同源性，不依赖recA 转座后靶序列重复 转座插入专一型 某些转座因子（Tn3）对同类转座因子的插入具有排他性 转座有极性效应 活化临近的沉默基因 区域性优先 王莲哲 制作

五、转座子的某些遗传学效应 1、可引起基因突变——插入或切离； 2、可以产生新基因； 如携带抗药性基因的转座子，既可引起插 入突变，也使该位点产生抗药性。 在转座子中,除Tn3家族完全复制转座,Mu噬菌体等兼用复制转座外,一般以剪贴方式的转座为主. 复制转座时,转座子基因组两股DNA各在5'端切断,受体DNA则两股交错切断.以其ssDNA尾连接转座子的交错切口.此时,在转座子两端各形成一个假复制叉,通过复制合成,添补单链缺口和合成新链.位置特异性重组后,靶DNA上正向重复序列形成. cointegrate-亦称共整合体.

3、转座产生染色体畸变（缺失、倒位等）

转座直接或间接促进基因组的重排，使相距较 远的基因组合到一起，构建成一个操纵子或表达单元，可能产生一些具有新的生物学功能的基因。 4、产生新的变异，有利于进化 转座直接或间接促进基因组的重排，使相距较 远的基因组合到一起，构建成一个操纵子或表达单元，可能产生一些具有新的生物学功能的基因。 转座是产生变异的主要因素之一。 基因组具有流动性

六、真核生物转座子 1、特点： （2）内部有转座酶等基因； 2、举例： 玉米转座子Ac/Ds ，Spm/dSpm ； 果蝇 P因子 （1）两端有IR， （2）内部有转座酶等基因； 2、举例： 玉米转座子Ac/Ds ，Spm/dSpm ； 果蝇 P因子

玉米的Ac-Ds系统 玉米中发现控制籽粒色素斑点的激活因子—解离系统（activator-dissociation system，Ac-Ds系统） 激活因子—Ac： 能合成转座酶的自主移动的调节因子，并能支配受体因子移动。 解离因子—Ds： 不能产生有效转座酶的非自主移动的受体因子。

Ac和Ds位于玉米第9染色体短臂上的色素基因C附近;有Ac而没有Ds时，C基因正常表达，籽粒有色； 当Ac和Ds都存在时，部分细胞中Ds会引起染色体断裂而去除色素基因C的作用，同时由于Ac因子转座酶的作用在另一些细胞中Ds会切离转座，因而色素基因C仍能正常表达，籽粒表现为无色斑点（色底白斑）； 当Ac和Ds都存在，Ds插入到色素基因C时，由于Ac的影响Ds很不稳定，经常切离转座，从而籽粒表现为色素斑点（白底色班）； 只有Ds时，由于没有了Ac，也就没有了转座酶，Ds不能移动，根据其插入的位点不同表现为均色。

Ac和Ds的序列具有很高的同源性,表明Ds是Ac缺失后形成： 王莲哲 制作

Ds Ac Ds Color gene 自主性因子：能自主转座，如Ac 非自主性因子：不能自主转座，当基因组中存在与其同

七、反转录转座子（retrotransposon） 转座经过RNA阶段。 DNA元件转录成RNA，再逆转录为DNA，然后插入基因组中某一新位点。 类似反转录病毒感染 果蝇 copia，酵母 Ty1，拟南芥菜 Ta1 In late 1940s and early 1950s，Barbara McClintock， of the Carnegie Dept of genetics at Cold Spring Harbor： 1。Hypothesis-movement of genetic “controlling elements”from one chromosomal location to another results in unstable mutation in color-forming genes。 2。suggestion-induction of gene instability by transposable elements may provide a machanism to reorganize the genome rapidly in response to stress and thus may play an important role in generating diversity。

小 结 转座子的概念 转座子的分类 转座过程发生的机制 转座子转座特征 转座引起的遗传学效应 真核生物转座因子 反转录转座子