動態培養實驗平台設置及動態培養條件下細胞增生體外實驗 組織支架表面改質 與動態培養軟骨細胞增生實驗 Surface Modification of Scaffold and Dynamic Culture for Cartilage Proliferation Experiments 研究背景、動機與目的 小耳症是顱顏整形外科臉部畸形之其中一種常見，目前臨床上小耳症患者耳朵重建手術包括自體移植及人工義耳之植入，但採用自體移植之可移植軟骨有限以及採用人工義耳植入術易因植入骨釘位置、角度或深度不準確發生免疫排斥問題而造成病人術後之感染。近年來，組織工程技術已可利用具生物相容性之生醫材料製作人體耳朶外型之支架，再加入自體軟骨細胞培養成耳朵植入物，以解決前述問題；但是如何在生物相容性材料所製作之支架上快速培養出適質、適量之軟骨細胞，便成為組織工程臨床應用成功之重要關鍵。爰此，本研究利用電腦輔助工程技術將混合生物相容材料聚乳酸和聚甘醇酸(poly-lactic-co-glycolic acid, PLGA)及第二型膠原蛋白(Type II Collagen)，透過快速成形(Rapid Prototyping)技術及鹽析法製作軟骨孔洞支架，並進行體外細胞增生及動物實驗驗證以及在動態培養條件下之細胞生長情形。 本研究經由支架物性分析結果得知，首先在親水性實驗方面，PLGA對於PLGA添加明膠表面改質後接觸角降低了19.37度(16.53 %)，所改變之親水性有顯著差異(p < 0.05 ) 但仍為疏水性表面；而PLGA對於添加第二型膠原蛋白表面改質之後降低接觸角41.98度 (35.83 %)，親水性也有顯著差異(p < 0.05 ) 並改善支架表面為親水性；在都有改善親水性之PLGA添加明膠與PLGA添加第二型膠原蛋白表面改質兩者之比較接觸角降低了22.61度 (23.12 %)且也具有顯著差異(p < 0.05 )，各項結果顯示添加第二型膠原蛋白表面改質改善之親水性效果最好；在支架強度分析方面，PLGA對於PLGA添加明膠表面改質後支架強度提升了0.9539 (0.55 %)且有顯著差異(p < 0.05 )；而PLGA對於添加第二型膠原蛋白表面改質之後支架強度提升了1.3734 (0.79 %)且也具有顯著差異(p < 0.05 )；但在都有改善支架強度之PLGA添加明膠與PLGA添加第二型膠原蛋白表面改質兩者之比較支架強度提升了0.4195 (0.16 %)但卻沒有顯著差異(p > 0.05 )。 本研究實驗所採用之細胞來源為豬膝蓋軟骨細胞，經由萃取培養後植入本實驗所製作之孔洞支架進行體外實驗及動物實驗，在細胞植入支架後24小時進行細胞貼附率分析結果為84 %，定性分析之細胞存活螢光染色confocal圖如圖五所示，而細胞外基質含量如圖六、圖七所示，皆能證明在八周內之細胞存活且增生分化成效良好，而動物實驗結果如圖八及圖九所示也證明八周內細胞能正常增生分化。 表一、細胞貼附率實驗結果 剛植入 植入24小時後 Optical Density 1.1212 1.0468 細胞量(cells ) 1x106 0.84x106 圖五、兩周及四周之confocal圖 研究架構圖 軟骨組織支架製作 體外實驗及動物實驗驗證 本研究用於製作耳朵孔洞支架所使用之材料為PLGA(比例85: 15)，PLGA(Poly-Lactide-co-Glycolide)是聚乳酸(polylactide, PLA)與聚甘醇酸(polyglycolide, PGA)之共聚物，PLGA是一種具有生物相容性以及生物可降解之特性並且對生物無毒性之高分子合成材料，利用工研院所改良之鹽析法，其製造流程，先將PLGA材料與粒徑大小約為300 μm之氯化鈉(NaCl)粉末加入以PLGA: NaCl =1 : 7之比例攪拌混合，由於PLGA與氯化鈉粉末重量以及顆粒大小不同難以均勻混合，所以我們使用乙醇將氯化鈉溶解成溶液輔助混合，混合完畢後加入二氯甲烷將PLGA材料溶解使氯化鈉能與PLGA材料結合，之後倒入圓盤狀模具裡，冷卻成型之後用去離子水(Deionized water, DI water)將殘留之氯化鈉顆粒析出清潔洗淨，完成支架之製作如圖一所示，其微觀結構如圖二所示。 本研究為了改善支架表面之親水性，分為添加第二型膠原蛋白(Type II collagen )與添加明膠(Gelatin )進行表面改質，以改善PLGA支架表面親水性，並增加細胞增生和貼附能力，利用接觸角量測儀進行支架親水性分析結果如圖三所示以及利用材料試驗機進行支架強度分析結果如圖四所示。 圖六、體外實驗GAG含量比較圖 圖七、體外實驗第二型膠原蛋白含量比較圖 圖八、動物實驗取出支架圖 圖九、Safranin O、Alcine blue、H&E染色切片圖 動態培養實驗平台設置及動態培養條件下細胞增生體外實驗 本實驗所使用動態培養平台為電磁攪拌方式之動態培養實驗如圖十所示，電磁攪拌器會透過磁力效應吸引磁力攪拌棒，磁力攪拌棒會因此被帶動而旋轉造成組織培養液之流動，使得組織支架受到流動的力量影響而產生力學刺激，其實驗結果細胞含量如圖十所示，而GAG含量如圖十一所示，實驗結果顯示在21天內細胞含量以及細胞外基質有逐步成長之趨勢。 圖一、PLGA支架圖 圖三、支架親水性實驗結果 圖十、動態培養細胞含量圖 圖十一、動態培養GAG含量圖 圖十、動態培養平台圖 圖二、支架SEM圖 圖四、支架強度分析實驗結果 指導教授： 李明義 博士 研究生：盧偉傑