高效液相色谱实验 刘焕蓉

色谱法的起源

色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。 他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今

石油醚 碳酸钙颗粒 色素 色谱 组分

色谱法的特点 高选择性 高效能 灵敏度高 分析速度快 应用范围广 色谱法的特点　 高选择性 高效能 灵敏度高 分析速度快 应用范围广 最大特点：能将一个复杂的混合物分离为各个有关的组成，然后一个个地检测出来，因此它是成分分析和结构测定的重要手段。

在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相称为固定相；自上而下运动的一相称为流动相；装有固定相的管子称为色谱柱。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。

液体为流动相的色谱称液相色谱（LC） 气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC）

高效液相色谱法是一种以液体为流动相的现代柱色谱分离分析方法。流动相与组分之间有一定亲和力，分离过程的实现是组分、流动相和固定相三者间相互作用的结果，分离不但取决于组分和固定相的性质，还与流动相的性质密切相关。高效液相色谱一般可在室温下进行。由于采用颗粒极细的固定相，柱内压降很大，加上流动相粘度高，必须采用高入口压，以维持一定的流动相线速。高效液相色谱仪主要由贮液瓶、高压输液泵、进样系统、色谱柱、检测系统、数据处理系统组成。

液相色谱流程图

一、贮液瓶 用来保证色谱分离的重现性 过滤器

高效液相色谱仪所用的洗脱液和注入系统的样品必须无固体微粒和纤维等，以免堵塞管道、色谱柱和影响泵单向阀的正常工作。因此，需选用不同材料的微孔滤膜过滤。 洗脱液进入高压泵前应脱气。因为如果流动相中所含有的空气不除，流动相通过柱子时其中的气泡受到压力而压缩，流出柱子后到检测器时因常压而将气泡释放出来，造成检测器噪声大，基线不稳，使仪器不能正常工作。这在梯度洗脱时尤其突出。 常用的脱气方法有： 加热法 减压法（抽真空） 惰性气体置换法（吹氦气等） 超声波法 在线脱气

二、高压输液泵 1. 对泵的要求 2. 高压输液泵

1. 对泵的要求 a. 输出高压 b. 流量稳定（流量精度要高±％1） c. 流量调节范围大 d. 输出恒定、压力波动小，无脉冲 e. 耐腐蚀和耐磨损 f. 密封性能好 g. 室体积小，便于清洗 h. 适合于梯度洗脱

二、高压泵 恒压泵 恒流泵 螺旋注射泵 往复泵 往复式 隔膜泵 往复式 柱塞泵 气动放大泵 ( 见附图）

附图1 双柱塞补偿泵（串联和并联）

三、进样系统 1、对进样系统装置的要求 2、进样系统 3、注射器进样装置 4、六通进样阀 5、自动进样器

1、对进样系统装置的要求 1. 密封性好 2. 死体积小 3. 重复性好 4. 保证中心进样 5. 进样时对色谱系统的压力、流量波动小 6. 便于实现自动化

2、进样方式 注射器进样装置 阀进样装置 六通进样阀 自动进样器

3、注射进样装置 优点 结构简单、造价低、操作方便、不以引起峰扩宽、柱效高 缺点 优点 结构简单、造价低、操作方便、不以引起峰扩宽、柱效高 缺点 进样量小、操作压力不能超于100kg/cm²、重复性差、难于自动化

4、六通进样阀 准备 工作 六通进样阀示意图

六通进样阀是一种高压进样阀，也是现代色谱仪的 一种优良的进样装置。 优点： a. 进样量可变范围大，进样量也较大，分析和制备通用，进样量由固定体积的定量管或者微量注射器控制 b. 重复性好　　一般可达0.5% c. 耐高压　可直接在高压下把样品 送入色谱柱，不需停留 d. 如果装上电动或者气动的驱动装置，可进行自动化进样 缺点： a. 阀的死体积大，容易引起色谱峰展宽 b. 柱效比注射器进样下降约10%，为使阀的高压密封性能好，因此制造工艺要求较高

5、自动进样器 自动进样器是由计算机自动控制定量阀，按预置的程序工作。取样、进样、复位、管路清洗和样品盘的转动全部按预定的程序自动进行。自动进样重复性高，适合大量样品分析，节省人力，可实现自动化操作。

四、色谱柱 色谱柱是高效液相色谱仪的核心部分，要求分离度高，柱容量大，分析速度快。高性能的色谱柱与固定相本身性能、柱结构、填装和使用技术等有关。 高效液相色谱柱大致分为三种类型：内径小于2mm称为细管径柱；内径在2～5mm范围的是常规高效液相色谱柱，作为一般分析用；内径大于5mm的一般称为半制备柱或制备柱。

1. 填料的特性决定色谱柱的性能 a. 填料的热力学特性影响色谱柱的选择性，决定色谱柱是否适合于所给定的分离。 b. 填料的动力学性质 影响色谱柱的效率 c. 现代色谱的发展主要是柱填料的发展 主要表现在填料动力学性质上的改进和提高装柱技术的革新，使柱效得到了新的突破，柱容量大为提高，从而提高了柱效 d. 从扩散和质量传递来考虑 填料粒度小，均有利于提高柱效高 粒度均匀、规则球形的颗粒易于填充均匀，也有利于柱效提高

2. 柱填料的类型 表面多孔型（薄壳）填料 全多孔微粒型填料 里面是一个惰性的玻璃硬核，表面包覆一层很薄的(1－2μm)多孔物质, 如硅胶、氧化铝、聚酰胺、离子交换树脂等。直径为30－40μm，比表面积为 1－15 m²/g ，孔径为100－500Å。在70年代后期已被全多孔微粒型填料取代。 全多孔微粒型填料 是现代色谱广泛使用的，一般分为大和小两种，也可分为球形和无定形两种。颗粒大小为5－10μm，比表面积为100－600 m²/g, 孔的体积为0.2－2ml/g。( 附图 3 and 4 ) 优点：包括(1)由于表面积大，故柱容量大 (2)填料程度小，微孔深度也减小，改善固定相和流动相的质量传递。

3、色谱柱的填充方法 柱填充质量的好坏对柱性能的好坏有重大的影响。柱填充的目的是要得到一个均匀、紧密的床层。不均匀的床层会产生较大的涡流扩散，使色谱峰明显展宽。另外柱填充不好需要更长的分析时间。因此，液相色谱柱的填充是一项技术性很强的工作，其装填方法有： 1. 干法 2. 湿法

干法：一般填料粒度大于20μm的可用干法，小于20μm的不宜用干法。这是因为细颗粒间相互聚集的倾向，微小颗粒表面存在着局部电荷，具有很高的表面性。因此，在干燥时倾向聚集，产生宽的颗粒范围，并粘附于管壁，这是一种有害想象，只能用湿法填充 。　 湿法：选择合适的液体(加压介质，又叫分散介质）将填充料制成匀浆液。分为非等比重法和等比重法两种，现在常用非等比重法。 ＜1＞非等比重法： 将填料悬浮在强度与以后分析时所使用的流动相的强度相当接近的溶剂中，从而使柱性能调整和溶剂活化时间大大缩短。则要求操作非常迅速，使颗粒沉降减至最小程度。 ＜2＞等比重法： 一般非极性键合相用四氯化碳和甲醇(9:1)作分散介质，用甲醇或乙醇作加压介质。匀浆法填充柱填充压力要高于实际使用时的最高压力。对于常规柱控制在300－600 kg/cm²，柱内径越细，填充压力越高。

五、检测系统 1、检测器的作用 2、检测器的性能指标 3、检测器的分类

1、检测器的作用 液相色谱的检测器是一种信号接收和能量转换装置。它的作用是连续地将色谱柱中流出的样品组分含量随时间的变化，转变成易于测量的电信号，以便在记录仪上记录下来，得到样品组分分离和组分含量的色谱图。

理想检测器应具备的特点： ＜1＞灵敏度高，对所有样品都有响应 ＜2＞对温度变化和流量波动不敏感 ＜3＞死体积小，不使峰额外地扩宽 ＜4＞线性范围宽，响应时间快 ＜5＞对样品无破坏性，对溶剂无响应 ＜6＞能给出定性信息，且重现性好 ＜7＞能用于梯度洗脱操作

2、检测器的性能指标 1. 噪声和漂移 2. 灵敏度 3. 检测限 4. 线性范围 5. 对色谱峰扩宽的影响

3、液相色谱中的检测器分两类 通用性检测器( 也称为总体性 ) 主要指总体特征 优点: 适用范围广； 缺点: 噪声浮动大，灵敏度低，不适于痕量分析，也不适于梯度洗脱。 选择性检测器( 也称为专用性 ) 主要指某一特征 优点: 灵敏度高，噪声浮动小； 缺点: 适用范围窄。

常用的液相色谱检测器有 1. 紫外吸收检测器 2. 紫外可见光检测器 3. 示差折光检测器 4. 光电二极管阵列检测器 5. 荧光检测器 6. 电化学检测器 7. 化学发光检测器 8. 蒸发光散射检测器

二极管阵列检测器 荧光检测器 蒸发光散射检测器 紫外双波长检测器

6、色谱数据处理系统 高效液相色谱的分析结果除可以用记录仪绘制谱图外，现已广泛使用微处理机和色谱数据处理工作站来记录和处理色谱分析的数据。 色谱数据工作站的出现，不仅大大提高了色谱分析工作的速度，也为色谱分析工作者进行理论研发、开拓新型分析方法创造了条件，可以预料随电子计算机技术的迅速发展，色谱工作站的功能也会日益完善。

实验目录 实验一 混合维生素E的正相HPLC分析条件的选择 实验二 维生素E胶丸中-VE的定量测定 实验三 果汁(苹果汁)中有机酸的分析

实验一 混合维生素E的正相HPLC分析 条件的选择 1、实验目的 (1)了解HPLC仪器的基本构造和工作原理，掌握HPLC仪器的基本操作； (2)学会选择HPLC最佳分析条件的方法。

2、实验原理 维生素E(VE)主要有α、β、γ、和δ4种异构体，其中又以α-异构体的生理作用为最强。其天然品为右旋体(d-α)，合成品为消旋体(d1-α)，一般药用为合成品。药典中收载为维生素E是维生素E，d1-生育酚及其醋酸酯与琥珀酸钙盐、d1-α-生育酚及其醋酸酯与琥珀酸酯的混和物。也就是说，通常所说的VE是一个混合物，除了游离的生育酚羧酸酯可能同时存在外，也可能共存多种结构异构体，甚至还可能有其他有机物共存。 VE的分离既可以用反相HPLC，也可以用正相HPLC。本实验采用正相HPLC。正相HPLC用的是极性填料分离柱(如硅胶柱)，流动相是弱极性或非极性溶剂(如正己烷)，样品因吸附作用在固定相中保留。在非极性溶剂中适当添加少量极性溶剂可以得到任意所需极性的流动相。色谱分析条件主要包括色谱柱、流动相组成与流速、色谱柱温度、检测波长等。通过实验主要了解流动相中添加极性溶剂对样品的保留和分离的影响，基本目标是要将α-VE与其他成分分离。

3、仪器与试剂 (1)仪器 PE200型高效液相色谱仪或其他型号液相色谱仪(普通配置，带紫外检测器)；TC4色谱数据工作站；色谱柱：硅胶柱MicropakSi-5(4µm，4.6mm×150mm)；100／µL平头微量注射器；超声波清洗器；流动相过滤器；无油真空泵；50mL烧杯2个；50mL容量瓶3个；250mL容量瓶1个； 500mL试剂瓶1只；5mL移液管2支；10mL，5mL，1mL移液管各一支。 (2)试剂 异丙醇、正己烷和无水乙醇纯度均为HPLC级；α-VE标准样品；混合维生素E；蒸馏水(本章所用蒸馏水均为二次蒸馏水，以下不另加说明)。

4、实验内容与操作步骤 (1)准备工作 ①流动相的预处理 取HPLC级异丙醇200mL，正己烷1000mL，用0.45µm的有机滤膜过滤后，装入流动相贮液器内,用超声波清洗器脱气10～20min。 注意!脱气时贮液器底部要用橡皮垫圈。 ②试样和标样的预处理 取HPLC级无水乙醇500mL，用0.45µm的有机滤膜过滤后，置于试剂瓶中备用。取市售蒸馏水1瓶，用水相滤膜过滤后，置于原瓶中，备用。 a.混合维生素E试样的配制 称取混合维生素E试样200～300mg(准确至0.1mg)于一洁净的50mL烧杯中，用处理过的无水乙醇溶液溶解并定容至50mL容量瓶中，此为试样的储备液。移取5mL试样储备液于另一50mL容量瓶中，用处理过的无水乙醇定容，配制成试样溶液。

a.按仪器说明书依次打开高压输液泵、紫外检测器、智能型接口的电源； b.α-VE标准溶液的配制 称取VE标准样品250mg(准确到0.1mg)于一洁净的50mL烧杯中，用处理过的无水乙醇溶液溶解并定容至250mL的容量瓶中，此为标样贮备液。移取5mL标样贮备液于另一50mL容量瓶中，用处理过的无水乙醇溶液定容，配制成VE标准溶液。 ③高效液相色谱仪的开机 a.按仪器说明书依次打开高压输液泵、紫外检测器、智能型接口的电源； b．打开色谱工作站，建立一个运行方法，运行时间设置为30min，纵坐标满量程设置为500mV，同时建立一个序列方法(序列数以当日要做实验的数目为准)； c．设定流动相流速为1.0mL·min-1，色谱柱柱温为30℃，检测波长为292nm；注意!弄清仪器前次实验所用的流动相，如果是用含水的流动相作过反相色谱，则应先将反相柱卸下(应用专门的柱塞封好柱两端)，依次用无水甲醇，正己烷作流动相运行15～20min，洗净流路中的水。进样器也要进行同样的清洗(以无水甲醇和正己烷为样品依次各进样3～5次)。

d. 装上本次实验所用的硅胶柱MicropakSi-5(4µm，4 d.装上本次实验所用的硅胶柱MicropakSi-5(4µm，4.6mm×150mm)，先用纯的正己烷作流动相，打开输液泵旁路开关，排出流路中的气泡。排气完毕后，按“stop”键将泵停止，确认流速设定值是否正确(1.0mL·min-1)，然后再按“start”按钮启动输液泵。 (2)流动相为100％正己烷时试样和标样的分析 ①混合VE试样溶液的测定 a．进样 待基线稳定后，用100mL平头微量注射器取试样溶液25mL，将进样阀柄置于“load'’位置时注入样品，在泵、检测器、接口、工作站均“Ready'”的状态下将阀柄转至“Inject'’位置，仪器自动采样。 注意!平头微量注射器用蒸馏水或溶剂清洗3次后再用样品溶液清洗3次，并注意不要吸入气泡。 b．数据采集 从计算机的显示屏上即可看到样品的流出过程和分离状况。待所有的色谱峰流出完毕后，按“stop'’键停止分析(运行时间结束后，仪器也会自动停止采样)，记录好样品名对应的文件名。

c．谱图优化 从工作站中调出原始谱图，对谱图进行优化处理后，打印出色谱图和分析结果。 ②VE标准溶液的测定 用100mL平头微量注射器吸取VE标准溶液25mL，按混合试样的测定方法进行分析测定，记录好样品名对应的文件名，并打印出色谱图和分析结果。 (3)流动相为正己烷／异丙醇(体积比99／1)混合溶剂时试样和标样的分析 将流动相换成正己烷／异丙醇(体积比99／1)混合溶剂，待基线稳定后，按混合试样的测定方法对混合VE试样和VE标样进行分析测定，并记录好样品名对应的文件名，同时打印出色谱图和分析结果。 (4)流动相为正己烷／异丙醇(体积比95／5)混合溶剂时试样和标样的分析 将流动相换成正己烷／异丙醇(体积比95／5)混合溶剂，待基线稳定后，按混合试样的测定方法对混合VE试样和VE标样进行分析测定，并记录好样品各对应的文件名，同时打印出色谱图和分析结果。

a．所有样品分析完毕后，让流动相继续流动10～20min，以免色谱柱上残留样品中的强吸附的杂质； b．关闭色谱数据工作站； (5)结束工作 ①关机 a．所有样品分析完毕后，让流动相继续流动10～20min，以免色谱柱上残留样品中的强吸附的杂质； b．关闭色谱数据工作站； c．关闭接口、检测器电源； d．从泵和系统中除去有害的流动相； e．根据色谱柱说明书上的指导清洗柱子； f．用水冲洗系统中缓冲液盐类，以免溶剂蒸发留下盐结晶等有害沉淀；

g．从系统中除去氯仿及其配成的溶液，以免在系统中分解，形成盐酸； h．除去有害流动相后，用异丙醇冲洗泵及系统； 注意!溶剂在环境中暴露24h以上，必须在使用前再过滤或弃去，以免污染泵； i．周末停用仪器，可用60／40的甲醇／水冲洗泵，柱子和流动池(柱子要和甲醇／水兼容)； j．关泵。 ②清理台面，填写仪器使用记录。

5、注意事项 (1)各实验室的仪器设备不可能完全一样，操作时一定要参照仪器的操作规程； (2)用平头微量注射器吸液时，防止气泡吸人的方法是：将擦干净并用样品清洗过的注射器插入样品液面以下，反复提拉数次，驱除气泡，然后缓慢提升针芯到刻度； (3)色谱柱的个体差异很大，即使是同一厂家的同种型号的色谱柱，性能也会有差异。因此，色谱条件(主要是指流动相的配比)应根据所用色谱柱的实际情况作适当的调整。 (4)如果仪器长期停用，完成实验后还应卸下色谱柱，将色谱柱两头的螺帽套紧，先用水再用异丙醇冲洗泵，确保泵头内灌满异丙醇；从系统中拆下泵的输出管，套上管套；从溶剂贮液器中取出溶剂入口过滤器放人干净袋中；妥善保存好泵。

6、数据处理 根据三次试验结果确定VE与其他成分分离的最佳环己烷／异丙醇配比。 7、思考题 (1)假设用硅胶柱和环己烷流动相分离几个组分时，分离度很高，但分析时间太长(后面的组分保留值太大)，用什么方法可以在保证相互分离的前提下，使分析时间缩短?说明理由。 (2)如果压力指示值突然降低或升高，主要原因和对策是什么?

实验二 维生素E胶丸中-VE的定量测定 1、实验目的 学会HPLC定量分析方法； 熟悉HPLC定量分析操作；

2、实验原理 正相和反相HPLC都可以用来定量VE，本实验采用反相HPLC。反相HPLC用的是非极性或弱极性填料分离柱(如ODS柱)，流动相是极性或比固定相极性强的溶剂(如甲醇、乙腈)，样品因在两相中的分配系数的差异而得到分离。极性强的物质在固定相中的保留值小，极性弱的物质在固定相中的保留值大，以此达到分离的目的。 VE胶丸中可能存在α、β、γ和δ四种异构体中的某几种，还可能含有工艺中产生的副产物以及添加剂，这些物质不一定能全部同时分离。实际分析过程中可以根据各类物质的紫外吸收特性，选择合适的检测波长以达到准确定量的目的。VE在220 nm附近和292 nm附近有两个最大吸收值，而且220nm的吸收比292 nm的吸收更强，但在220 nm附近很多溶剂和有机化合物都有吸收，对VE的定量有干扰。因此，通常选择干扰小的292 nm作为检测波长。 本实验的定量方法采用外标法。

3、仪器与试剂 (1)仪器 PE200型高效液相色谱仪或其他型号液相色谱仪(普通配置，带紫外检测器)；TC4色谱工作站或其他色谱工作站；色谱柱：PE Brownlee C18反相键合相色谱柱(5µm，4.6mm×150mm)；25 µL平头微量注射器；超声波清洗器；流动相过滤器；无油真空泵；50mL烧杯2个；50mL容量瓶4个；250mL容量瓶1个；1000mL容量瓶。 (2)试剂 HPLC级甲醇；蒸馏水；市售VE胶丸； VE标准溶液。

4、实验内容与操作步骤 (1)准备工作 ①流动相的预处理  取HPLC级无水甲醇2000mL，二次蒸馏水2000mL，按实验一中实验步骤4(1)中①的方法进行预处理。 ②试样和标样的预处理 a．试样的配制  取1粒市售VE胶丸，用干净小刀割破胶丸，挤出中间的VE溶液，于50mL干净的小烧杯中，准确称量后用处理过的无水甲醇定容至50mL的容量瓶中。 b．标样的配制  称取VE标准样品于一洁净50mL小烧杯250mg(称准至0.1mg)，用处理过的无水甲醇溶液溶解并定容至250mL容量瓶中，此为VE标准贮备液。分别移取1mL，5mL，l0mL VE标准贮备液于三个50mL的容量瓶中，定容，摇匀，配制成浓度分别为20、100和200 mg·L-1的VE标准溶液。

③色谱柱的安装和流动相的更换 将PE Browntee C18色谱柱(5µm，4 ③色谱柱的安装和流动相的更换  将PE Browntee C18色谱柱(5µm，4.6mm×150mm)安装在色谱仪上，将流动相更换成85％甲醇水溶液。 ④高效液相色谱仪的开机  开机，将仪器调试到正常工作状态，流动相流速设置1.0mL·min-1，柱温30℃；检测器波长设为292nm。 (2)流动相最佳配比的确定 ①待基线稳定后，注射VE胶丸样品溶液20µL； ②待样品中所有色谱峰都出完后，按“stop”键停止分析，然后进样50mg·L-1的VE标准溶液，按保留时间确认VE胶丸样品中VE的峰位置，如果VE与邻近峰分离不完全，则应调整流动相配比和流速，使VE与邻近峰完全分离，记录下此时的分析条件。

(3) VE标样的分析测定  在所选定的分析条件下，基线稳定后，依次进样20、100和200 mg·L-l的VE标准溶液20µL，记录下样品名对应的文件名，同时打印出经优化的色谱图和分析结果。 (4)VE胶丸样品溶液的分析测定  在上述分析条件下，基线稳定之后，重复进样VE胶丸样品溶液三次，记录下样品名对应的文件名，同时打印出经优化的色谱图和分析结果。 (5)结束工作 ①关机。待所有样品分析完毕后，按正常的步骤关机； ②清理台面，填写仪器使用记录。

5、注意事项 (1)如果检测器灵敏度较低，可以将VE标准溶液浓度变为50、100和500mg·L-1； (2)如果已知在初设定的色谱条件下，VE与其他成分能完全分离，则可省去实验步骤(2)； (3)各实验室的仪器不可能完全一样，操作时一定要参照仪器的操作规程； (4)色谱柱的个体差异大，即使是同一厂家的同型号色谱柱，性能也会有差异，因此色谱条件应根据所用色谱柱的实际情况作适当的调整。

6、数据处理 (1)    参照下表记录和整理出实验分析结果。

(2)分别根据20、100和200 mg·L-1的VE标准样品的峰面积和峰高绘制工作曲线，比较两条工作曲线的线性(用作图法或线性回归)； (3)分别用面积和峰高工作曲线法计算VE胶丸中VE的含量； (4)取试样VE胶丸三次测量结果的平均值作为测定的分析结果。 7、思考题 (1)如果将分离柱换成C8柱，其他条件不变，VE的保留时间是增加，还是减小，并说明原因。 (2)一般情况下，峰高工作曲线比面积工作曲线的线性范围要小，这是为什么?

实验三 果汁(苹果汁)中有机酸的分析 1、实验目的 学习果汁样品的预处理和分析方法； 熟悉HPLC定量分析操作；

2、实验原理 在食品中，主要的有机酸是乙酸、乳酸、丁二酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸等。这些有机酸在水溶液中都有较大的离解度。有机酸在波长210 nm附近有较强的吸收。苹果汁中的有机酸主要是苹果酸和柠檬酸，可以用反相高效液相色谱、离子交换色谱、离子排斥色谱等方法分析，本实验采用反相高效液相色谱法。在酸性(如pH 2～5)流动相条件下，上述有机酸的离解得到抑制，利用分子状态的有机酸的疏水性，使其在ODS色谱柱中保留。不同有机酸的疏水性不同，疏水性大的有机酸在固定相中保留强，疏水性小的有机酸在固定相中保留弱，以此得到分离。 本实验采用外标法定量苹果汁中的苹果酸和柠檬酸。

3、仪器与试剂 (1)仪器 PE200型高效液相色谱仪或其他型号液相色谱仪(普通配置，带紫外检测器)；TC4色谱工作站或其他色谱工作站；色谱柱：PEBrownleeCis反相键合相色谱柱(5µm，4.6mm×150mm)；25µL平头微量注射器；超声波清洗器；流动相过滤器；无油真空泵；50mL烧杯3个；250mL容量瓶2个；50mL容量瓶3个；50mL移液管2支。 (2)试剂 苹果酸和柠檬酸标准溶液；优级纯磷酸二氢铵；蒸馏水；市售苹果汁。

4、实验内容与操作步骤 (1)准备工作 ①流动相的预处理  称取优级纯磷酸二氢铵460mg(准确称至0.1 mg)于一洁净50mL小烧杯中，用蒸馏水溶解，定量移入1000mL容量瓶，并稀释至标线。用0.45µm水相滤膜减压过滤，脱气。取蒸馏水1000mL，按实验一步骤4(1)中的①方法进行预处理。 ②标准溶液的配制 a、标准贮备液的配制  称取优级纯苹果酸和柠檬酸250 mg于2个50 mL干净小烧杯中，用蒸馏水溶解，分别定量移入两个250 mL容量瓶，并稀释至刻度。此为苹果酸和柠檬酸的标准贮备液。 b、混合标准溶液的配制  分别移取苹果酸和柠檬酸的标准贮备液各5 mL于50 mL容量瓶，定容、摇匀，此为苹果酸和柠檬酸的混合标准溶液，其中苹果酸和柠檬酸的浓度均为100 mg·L-1。 ③试样的预处理  市售苹果汁用0.45µm水相滤膜减压过滤后，置于冰箱中冷藏保存。

④色谱柱的安装和流动相的更换 将PEBrownlee C18色谱柱(5µm，4 ④色谱柱的安装和流动相的更换  将PEBrownlee C18色谱柱(5µm，4.6mm×150mm)安装在色谱仪上，将流动相更换成已处理过的4 mmol·L-1磷酸二氢铵溶液。 ⑤高效液相色谱仪的开机  开机，将仪器调试到正常工作状态，流动相流速设为1.0mL·min-1；柱温30～40℃；紫外检测波长210nm。 (2)苹果酸、柠檬酸标准溶液的分析测定  基线稳定后，用25µL平头微量注射器分别进样苹果酸和柠檬酸标准溶液各20µL，记录下样品名对应的文件名，并打印出优化处理后的色谱图和分析结果。 (3)苹果汁样品的分析测定  重复注射苹果汁样品20µL三次，分析结束后记录下样品名对应的文件名，并打印出优化处理后的色谱图和分析结果。将苹果汁样品的分离谱图与苹果汁和柠檬酸标准溶液色谱图比较即可确认苹果汁中苹果酸和柠檬酸的峰位置。 注意!如果苹果酸和柠檬酸与邻近峰分离不完全，应适当调整流动相配比和流速，再重复(2)、(3)的步骤。

(4)混合标准溶液的分析测定  进样100 mg·L-1苹果酸和柠檬酸混合标准溶液20µL，分析完毕后，记录好样品名对应的文件名，并打印出优化后的色谱图和分析结果。 (5)结束工作 ①关机，所有样品分析完毕后，按正常的步骤关机； ②清理台面，填写仪器使用记录。 5、注意事项 （1）各实验室的仪器不可能完全一样，操作时一定要参照仪器的操作规程。 （2）色谱柱的个体差异大，即使是同一厂家的同型号色谱柱，性能也会有差异，因此色谱条件应根据所用色谱柱的条件适当调整。

6、数据处理 参照下表整理出苹果汁酸和柠檬酸的分析结果。

7、思考 (1)假设用50％的甲醇或乙醇作流动相，有机酸的保留值是变大还是变小，分离效果会变好还是变坏?说明理由。 (2)如果用酒石酸作内标定量苹果酸和柠檬酸，对酒石酸有什么要求?写出该内标法的操作步骤和分析结果的计算方法。