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高效液相色谱法测定咖啡因
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一、实验目的 1.掌握高效液相色谱法的基本原理。 2.了解高效液相色谱仪的使用及日常维护。 3.掌握标准曲线法定量实验技术。
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二、实验原理 咖啡因，化学名为1，3，7—三甲基黄嘌呤。它是一种中枢神经兴奋剂，能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋，目前可由茶叶及咖啡中提取，咖啡因的甲醇溶液在270nm波长下有最大吸收，其吸收值的大小与咖啡因浓度成正比，从而进行定量。
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三、仪器与试剂 1. 仪器 液相色谱LC—10AVP，紫外检测器，超声波发生器 2.试剂 氯仿（GR）甲醇（GR）乙睛（GR）咖啡因标品
咖啡因标准储备液（1.0mg/ml）：准确称取50 mg咖啡因于50mL比色管中，用色谱纯甲醇定容至刻度，摇匀。 咖啡因标准应用液（0.2mg/ml）：移取咖啡因标准储备液10.0ml于50ml比色管中，用色谱纯甲醇定容至刻度，摇匀。
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四、实验步骤 1. 样品处理 （1）可乐型饮料 ①脱气：样品用超声波清洗器在40℃下超声至没气泡。
②过滤：取脱气试样通过混纤微孔滤膜过滤后备用。 （2）咖啡、茶叶及其制成品 称取0.2g已经粉碎且小于30目的均匀样品或液体样品放入150mL烧杯中，先加2~3 mL超纯水，再加25 mL三氯甲烷，摇匀，在超声处理机上萃取1min（30s两次），静置30 min，分层。将萃取液倾入另一150mL烧杯。在样品中再加25mL三氯甲烷，重复上述萃取操作步骤，弃去样品，合并二次萃取液，加入少许无水硫酸钠和2.5mL饱和氯化钠，过滤，滤入50mL比色管中，用三氯甲烷定容至刻度。最后经混纤微孔滤膜过滤后备用。
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四、实验步骤 2. 标准曲线的绘制 准确移取咖啡因标准应用液（0.2 mg/mL）0、5.0、10.0、15.0、20.0μL分别注入色谱仪中，得到相应的峰高或峰面积，以质量为横坐标，峰高或峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。 3. 测定 流动相： 甲醇∶水∶乙睛 = 40∶50∶10（V/V） 流速：0.6ml/min 色谱柱：ODSC18 （4.6mm×150mm） 紫外检测器（270nm） 柱温：40℃
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五、数据处理及结果 可乐型饮料中咖啡因含量（mg/L）= C/ 20 ×1000 咖啡、茶叶及其制成品中咖啡因含量（μg/g）
= C/ m ×稀释倍数（50×1000/20） C— 由标准曲线查得相当于咖啡因的含量，μ g ； m—样品的质量，g
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