液相色谱分析法模块之 任务5 高效液相色谱法 分离原理.

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液相色谱 庞然: 桑灵子: 分离原理 溶于流动相中的各组分经过固定相时, 由于与固定相发生作用(吸附、分配、 离子吸引、排阻、亲和)的大小、强 弱不同,在固定相中滞留时间不同, 从而先后从固定相中流出。又称为色 层法、层析法。
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液相色谱分析法模块之 任务5 高效液相色谱法 分离原理

能力目标 理解已知分析方法中采用的色谱类型 能够正确解释色谱分离过程 能够根据组分性质选择合适的色谱类型

课程引入 归一化法测定分析纯甲苯试剂的纯度 色谱柱: 4.6mm×150mm 固定相: 十八烷基硅烷键合相(ODS) 流动相: 水:甲醇=15:85 外标法测定叶酸片中叶酸的含量 色谱柱: 4.6mm×250mm 流动相: 磷酸二氢钠缓冲液:甲醇=80:20

课程引入 液相色谱是如何完成混合物的分离? 混合物中各组分在固定相和流动相之间会发生吸附、溶解或其他亲和作用,这种作用存在差异,从而使各组分在色谱柱中的迁移速度不同得到分离 石油醚 碳酸钙颗粒 色素 玻璃柱

液液分配色谱 液液分配色谱法 实例:归一化法测定分析纯甲苯试剂的纯度 色谱柱: 4.6mm×150mm 固定相: 十八烷基硅烷键合相(ODS) 流动相: 水:甲醇=15:85

液液分配色谱 液液分配色谱法 固定相 将特定的液态物质涂于担体表面 化学键合于担体表面而形成的有机键合层 如C18(十八烷基硅烷)、 C8(辛烷基)、氨基键合硅胶 固定相类型 极性固定相:正相色谱 以极性有机基团如胺基(-NH2)、腈基(-CN)、醚基(-O-)等键合在硅胶表面制成的 非极性固定相:反相色谱 反相色谱法最常用的固定相是C18、C8和苯基键合相的填料,在分离极性很大的化合物时,也可以采用氨基、氰基等极性基团键合固定相。

键合相色谱—固定相 使用条件 为控制样品在分析过程的解离,常用缓冲液控制流动相的pH值,但需要注意的是,C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5(2~8)。 太高的pH值会使硅胶溶解,太低的pH值会使键合的烷基脱落。 特点 使用过程中不流失 均一性和化学稳定性好 重现性好分离效率高 适于梯度洗脱 传质阻抗小

键合相色谱—流动相 反相色谱 常见流动相 流动相洗脱强度顺序:水<甲醇<乙腈<乙醇<四氢呋喃<丙醇<二氯甲烷(与水不混溶) 若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流动相,可用于分离极性化合物 若采用水和无机盐的缓冲液为流动相,则可分离一些易离解的样品,如有机酸、有机碱、酚类等 常见固定相 反相色谱法最常用的固定相是C18、C8和苯基键合相的填料,在分离极性很大的化合物时,也可以采用氨基、氰基等极性基团键合固定相。

反相色谱法的分离机理1 疏溶剂理论: 当溶质分子进入极性流动相后,即占据流动相中相应的空间,而排挤一部分溶剂分子; 当溶质分子被流动相推动和固定相接触时,溶质分子的非极性部分或非极性分子)会将非极性固定相上附着的溶剂膜排挤开,直接和非极性固定相上的烷基官能团相结合(吸附)形成缔合物,构成单分子吸附层; 当流动相极性减小时,这种疏溶剂斥力下降,会发生解缔,并把溶质分子释放而被洗脱下来

反相键合相色谱法的分离机理2 影响溶质保留的三个主要因素: 溶质分子中非极性部分的总表面积 溶质和固定相接触的总表面积愈大,保留值愈大,所以溶质的极性愈弱,疏水性越强,保留值越大。 键合相上的烷基总面积 烷基键合固定相的作用在于提供非极性的作用表面。随着碳链的加长,烷基的疏水特性增强,溶质的保留值也随烷基碳链长度的增加而增大。 流动相的表面张力 流动相的表面张力愈大,介电常数愈大,极性亦愈强;溶质和烷基键合相的缔合作用愈强,流动相的洗脱强度弱,导致溶质的保留值大。

1-尿嘧啶;2-苯酚;3-乙酰苯;4-硝基苯;5-苯甲酸甲酯;6-甲苯 分离机理实例 例:反相键合色谱中,键合相碳链越长,分离效果越好。 时间,min 固定相:C1 固定相:C8 固定相:C18 1-尿嘧啶;2-苯酚;3-乙酰苯;4-硝基苯;5-苯甲酸甲酯;6-甲苯

液液分配色谱 正相色谱法 反相色谱法 1.极性固定相 聚乙二醇、氨基与腈基键合相 2.相对非极性流动相 正已烷、环已烷 3.极性调节剂 3.极性调节剂    乙醇、四氢呋喃、三氯甲烷 4.分离中等极性和极性较强化合物.    酚类、胺类、羰基类及氨基酸类 5.组分流出顺序 极性小先洗出 1.非极性固定相 C18(简称ODS) 、C8 2.极性流动相 水或缓冲液 甲醇、乙腈、四氢呋喃 4.分离非极性和极性较弱化合物 占整个HPLC应用的80%左右 极性大先洗出

其他类型色谱法 其他类型色谱法 按分离机制分类: 液固吸附色谱法 离子色谱法 凝胶色谱法(分子排阻色谱法) (空间排阻色谱法)

液固吸附色谱实例 氯化噻吩嗪四种异构体的分离 异构体具有不同的空间排列方式,因此吸附剂对它们的吸附能力有所不同,从而得到了分离。 四种异构体的分离色谱图

液固吸附色谱 液固吸附色谱法 固定相:吸附剂为硅胶或氧化铝,粒度5-10μm 流动相:有机溶剂 适用于分离分子量200-1000的组分,大多数用于 非离子型化合物的分离,常用于分离同分异构体。 各组分的出峰顺序 极性较小组分,吸附力较弱,容易解吸,先流出。 极性较大组分滞留作用大,后流出。 饱和烃 < 烯 < 芳烃 < 醚 < 醛酮 < 酸

液固吸附色谱分离机理 液固吸附色谱法分离机理 吸附 脱附 再吸附 再脱附 … 分离过程是一个吸附 -脱附的平衡过程。

离子色谱法实例 离子交换色谱法 油田水质中的阴离子分析 固定相:薄壳型阴离子交换树脂 (3×250mm) 流动相:0.003mol·L-1 NaHCO3 / 0.0024 mol·L-1 Na2CO3

离子交换色谱法 离子交换色谱法 固定相:离子交换树脂,常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架, 在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基 阳离子交换树脂 在表面未端芳环上接上季胺基 阴离子交换树脂 流动相:电解质溶液、有机弱酸或有机弱酸盐溶液 CO32- SO42- CO32- HCO3- Cl- + CO32- CO32- SO42- CO32- HCO3- + CO32- SO42- HCO3- HCO3- HCO3- Cl-

离子交换色谱法分离机理 离子交换色谱法 分离原理 树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的 离子进行可逆交换而分离。 应用 离子交换色谱法主要用于分析阴,阳离子,凡是在溶剂中能够电离 的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。 分析物质 有机酸、氨基酸、多肽及核酸。

凝胶色谱法实例 凝胶色谱(分子排阻色谱法) 油田用驱油剂聚丙烯酰胺损失量的测定? 色谱柱:150mm×46mm 固定相:二醇基键合相,孔径200A,粒径5um 流动相:甲醇/0.05mol/LNaH2PO4 1-聚丙烯酰胺 2-原油+石油磺酸盐+氯化钠

凝胶色谱分离机理 凝胶色谱:(分子排阻色谱法) 分离机理 以凝胶 (gel) 为固定相。它类似于分子筛,但凝胶的孔径比分子筛要大得多。 小分子量的化合物可以进入孔中,滞留时间长;大分子量的化合物不能进入孔中,直接随流动相流出。 常用于分离高分子化合物,如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。 凝胶色谱分离示意图

色谱类型选择 正确地选择色谱类型 尽可能多的了解样品性质 化学结构 极性和稳定程度 水中和有机溶剂中溶解度 相对分子质量的大小 熟悉各种色谱类型主要特点应用范围

色谱类型选择

液相色谱法实例 按固定相与流动相相对极性的不同,液液分配色谱可分为哪两类方法?现在有A、B两物质,极性A>B,问在两种液液分配色谱上的出峰顺序如何? 分离下述化合物,宜选用何种色谱方法? (A)聚苯乙烯相对分子量分布 (B)多环芳烃 (C)氨基酸 (D)Ca2+,Ba2+,Mg2+

下次课程问题 三种组分苯、萘、联苯,如何选择一个最佳的色谱分离条件,既能达到良好的分离度,又能在短时间内完成分析任务?