酶工程 Enzyme Engineering

一切生物的生命活动都是由新陈代谢的正常运转来维持的，而代谢中的各种化学反应是由各种酶的催化来实现的。个别酶的缺乏或者酶活性受到抑制 就会使代谢受阻或紊乱，从而引起疾病。 例如：某些儿童由于缺少苯丙氨酸羟化酶而产生严重的苯基酮尿症。原因:苯丙氨酸的降解途径改变，即苯丙氨酸与α-酮戊二酸发生转氨反应，产生苯丙酮酸。此物质积累在血液中，最后由尿排出体外。后果：血液中过量的苯丙酮酸妨碍儿童大脑的正常发育．造成严重的智力迟钝。 研究酶的结构与功能以及动力学，对于阐明生命的本质和活动规律，对于阐明发病机理以及诊断治疗，具有极其重要的作用。

酶技术在工农业生产上已有日益广泛的应用，产生了较大的经济效益和社会效益。其作用有两个方面： （1）运用酶技术生产有重要价值的产品 例如：利用固定化氨基酰化酶拆分DL—酰化氨基酸，自动连续地生产L—氨基酸；利用固定化青霉素酰化酶半合成青霉素；利用固定化木瓜蛋白酶合成高甜度低热量的甜味二肽。 （2）利用酶制剂改进生产工艺，提高产品质量和产率，降低生产成本 例如：用新的酶法代替老的石灰硫化钠法，使动物皮脱毛、软化，提高皮革的质量；在洗衣粉中加入碱性蛋白酶，加强了洗衣粉的去污能力；用乳糖酶从牛奶中除去乳糖，提高了牛奶的质量；在水果加工过程中加入果胶酶，使果汁易于过滤，果汁澄清并提高果汁产率。

酶技术在医疗卫生和环保方面，亦发挥着极其重要的作用。 在治疗疾病方面，不少酶制剂可以作为治疗疾病的药用酶，有很好的疗效。例如：天冬酰胺酶能治疗白血病，抗肿瘤；人尿胰蛋白酶抑制剂能使急性胰腺炎患者转危为安；猪、牛凝血酶在外科手术过程中用于止血，效果很好。 酶法分析具有灵敏、准确、快速、简便等优点，在临床化验和化学分析方面，已发挥了越来越大的作用。例如：测定血液中谷丙转氨酶活性，可以为诊断肝炎活动期及病情严重程度提供重要的依据；利用葡萄糖氧化酶电极测定血液和尿中的葡萄糖浓度，以为糖尿病的诊断，提供重要的依据；用辣根过氧化物酶标记乙肝病毒表面抗原或抗体然后用酶标免疫测定法测定人体血液中乙肝病毒的含量，为诊断乙肝及病情提供重要的依据。

生物技术的四大支柱

基因工程：用“剪刀+糨糊”创造新物种的工程。 细胞工程：微观水平的嫁接技术。 酶工程：让工厂高效、安静、美丽如画的工程。 发酵工程：把微生物或细胞造就成无数微型工厂，将神话变为现实的桥梁。

第一章 绪论 一、酶与酶工程发展简史 （一）酶学研究简史 1. 酶的原始利用 第一章 绪论 一、酶与酶工程发展简史 （一）酶学研究简史 1. 酶的原始利用 4000多年前，酿酒盛行（淀粉酶系和酒化酶系）；3000年前，豆类制豆酱（霉菌产生的蛋白酶）；麦芽制饴糖（β-淀粉酶）；2500年前，酒曲治肠胃病（纤维素和淀粉酶）。

2. 酶学的产生: 消化与发酵现象 （1）消化 1777年，意大利物理学家 Spallanzani 的 山鹰实验。 1822年，美国外科医生 Beaumont 研究食物 在胃里的消化。 19世纪30年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。

（2）发酵 1684年，比利时医生Helment提出 ferment—引起酿酒过程中物质变化的因素（酵素）。 1833年，法国化学家Payen和Person 用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶（diastase）。 1876年，德国科学家Kűhne提出 enzyme—从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”（希腊文）。

小插曲 19世纪，Pasteur和Liebig学术长期争论: 1857年，法国化学家和微生物学家Pasteur认为没有生物则没有发酵。 此争议由德国学者Buchner兄弟于1896年解决。

Buchner兄弟的试验： 用细砂研磨酵母细胞，压取汁液，汁液不含活细胞，但仍能使糖发酵生成酒精和二氧化碳。 证明：发酵与细胞的活动无关。

酶——活细胞产生的，能在细胞内外起作用的（催化）生理活性物质。 enzyme—organic chemical substance (a catalyst) formed in living cells, able to cause changes in other substance without being changed itself. 酶的化学本质？

3.酶学的迅速发展（理论研究） （1） 酶的化学本质 1926年,美国康乃尔大学的“独臂学者” Sumner（萨姆纳）博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质。 1930年，美国的生物化学家Northrop分离得到了胃蛋白酶（pepsin）、胰蛋白酶（trypsin）、胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）结晶，确立了酶的化学本质。

（2） 酶学理论研究 1890年，Fisher——锁钥学说。 1902年，Henri——中间产物学说。 1913年， Michaelis 和 Menten——米氏学说。 1958年， Koshland——诱导契合学说。 1960年，Jacob 和 Monod——操纵子学说。

Characteristics of enzyme active sites Lock and key model (锁钥) 1890 picture by Emil fisher. This model assumed that only a substrate of the proper shape could fit with the enzyme. Induced –fit model (诱导契合) proposed by Daniel Koshland in 1958. This model assumes continuous changes in active site structure as a substrate binds.

ES 中间产物学说 S P E

Steps in an enzymatic reaction Enzyme and substrate combine to form a Complex. Complex goes through a transition state ---not quite substrate or product A complex of the enzyme and the product is produced Finally the enzyme and product separate All of these steps are equilibria. Lets review each step.

Michaelis-Menten equation

酶——是一类由活性细胞产生的具有催化作用和高度专一性的特殊蛋白质。 是否所有的酶都是蛋白质？

（3）核酶的发现 1982年，Thomas R.Cech等人发现四膜虫细胞的26S rRNA前体具有自我剪接功能，将这种具有催化活性的天然RNA称为核酶—Ribozyme。 1983年，Altman等人发现核糖核酸酶P的RNA组分具有加工tRNA前体的催化功能。而RNase P中的蛋白组分没有催化功能，只是起稳定构象的作用。

酶分两大类： 主要由蛋白质组成——蛋白类酶（P酶） 主要由核糖核酸组成——核酸类酶（R酶） 核酶的发现，改变了有关酶的概念，即“酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白质或RNA）。 酶分两大类： 主要由蛋白质组成——蛋白类酶（P酶） 主要由核糖核酸组成——核酸类酶（R酶）

（二) 酶工程研究简史（应用研究） 1891年，高峰让吉申请了Taka酒曲专利，利用霉菌表面培养的发酵方法来生产淀粉酶使得酶制剂工业取得突破，其方法至今仍被采用。 1908年，德国的Rohm用动物胰脏制得胰蛋白酶，用于皮革的软化及洗涤。 1908年，法国的Boidin制备得到细菌淀粉酶，用于纺织品的褪浆。 1911年，Wallerstein从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清。

1960年，法国科学家Jacob和Monod提出的操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量。 1949年，用微生物液体深层培养法进行－淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕。 1960年，法国科学家Jacob和Monod提出的操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量。

在酶的应用过程中，人们注意到酶的一些不足之处，如：稳定性差，对强酸碱敏感，只能使用一次，分离纯化困难等。 解决的方法之一是固定化。

固定化技术的发展经历 1916年，Nelson和Griffin发现蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性。 1969年，日本千佃一郎首次在工业规模上用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L－氨基酸。 1971年，第一届国际酶工程会议在美国召开，会议的主题是固定化酶。

二 . 酶工程简介 分为：化学酶工程与生物酶工程。 由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新的技术科学。它从应用目的出发，研究酶的产生、酶的制备与改造、酶反应器以及酶的各方面应用。 分为：化学酶工程与生物酶工程。

化学酶工程（初级酶工程） 2. 生物酶工程（高级酶工程） 酶化学与化学工程技术相结合的产物。 主要研究内容：酶的制备、酶的分离纯化、酶与细胞的固定化技术、酶分子修饰、酶反应器和酶的应用。 2. 生物酶工程（高级酶工程） 在化学酶工程基础上发展起来的、酶学与现代分子生物学技术相结合的产物。

生物酶工程主要研究内容 （1） 用基因工程技术大量生产酶（克隆酶） 如：尿激酶原和尿激酶是治疗血栓病的有效药物。用DNA重组技术将人尿激酶原的结构基因转移到大肠杆菌中，可使大肠杆菌细胞生产人尿激酶原，从而取代从大量的人尿中提取尿激酶。 （2）用蛋白质工程技术定点改变酶结构基因（突变酶） 如：酪氨酰－tRNA合成酶，用Pro（脯氨酸）取代Thr51（第51位的苏氨酸），使该酶对底物ATP的亲和力提高了100倍，而且最大反应速度亦大幅度提高。 （3）设计新的酶结构基因，生产自然界从未有过的性能稳定、活性更高的新酶。

生物酶工程示意图

酶工程原理和基本过程 菌种 → 扩大培养→ 发酵→ 发酵酶液 →酶的提取 → 酶成品 原料→ 前处理→ 杀菌→ 酶反应器 ← ↓ 菌种 → 扩大培养→ 发酵→ 发酵酶液 →酶的提取 → 酶成品 原料→ 前处理→ 杀菌→ 酶反应器 ← ↓ 反应液→ 产品提取→ 产品 酶的固定化

第二节 酶的催化特点以及影响因素 NH2 C＝O＋H2O CO2+2NH3 脲酶 Fe粉 一、酶的催化特点 1.极高的催化效率 第二节 酶的催化特点以及影响因素 一、酶的催化特点 1.极高的催化效率 反应速度与不加催化剂相比可提高108～1020倍，与加普通催化剂相比可提高107～1013倍. NH2 C＝O＋H2O CO2+2NH3 脲酶 Fe粉 脲酶的催化效率比Fe粉高1015倍。

活化能：在一定温度下，1mol底物全部进入活化状态所需的自由能，单位J/mol。

一种酶只能作用于某一类或某种特定的物质，这种性质称为酶的专一性。 2.高度的专一性 （1） 结构专一性 概念：酶对所催化的分子化学结构的特殊要求和选择。 类别：绝对专一性和相对专一性 （2） 立体异构专一性 概念：酶除了对底物分子的化学结构有要求外，对其立体异构也有一定的要求 类别：旋光异构专一性和几何异构专一性 一种酶只能作用于某一类或某种特定的物质，这种性质称为酶的专一性。

绝对专一性：有些酶只作用于一种底物，催化一个反应， 而不作用于任何其它物质。 如：过氧化氢酶底物：过氧化氢 琥珀酸脱氢酶底物：琥珀酸 相对专一性：这类酶对结构相近的一类底物都有作用。包括键专一性和基团专一性。

旋光异构专一性：当底物具有旋光异构体时一酶只能作用于其中的一种。 如：L-AA氧化酶只能催化L-AA氧化，而对D-AA无作用。 顺反异构专一性：对具有顺式和反式异构的底物具严格的选择性。 消化道内几种蛋白酶的专一性

3、活性的可调节性（化学修饰、激活剂和抑制剂的调节、反馈调节、别构调节等） 4、活性的不稳定性，易失活。

补充： 酶的组成 按化学成分酶分为：单纯酶和结合酶 单纯酶：只由蛋白质组成，如脲酶、淀粉酶、蛋白酶。 结合酶：除蛋白质外，还有对热稳定的非蛋白小分子物质，称辅因子。

补充： 酶 结合酶 单纯酶 蛋白质部分 + 非蛋白质部分 酶蛋白 辅助因子 + = 全酶（有活性） 小分子有机化合物（B族维生素） 无机金属离子 辅酶 辅基

酶的存在形式 补充： 单体酶 : 酶蛋白是一条具有三级结构的多肽链 寡聚酶 : 两个以上亚基以非共价键结合形成的酶 多酶体系 :几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物 多功能酶：进化过程中由于基因的融合，一条多肽链有多种催化功能

酶的活性中心 补充： 活性中心： 酶分子与底物结合并将底物转化 为产物的空间结构区域 结合基团：与底物结合，形成酶底物复合物 催化基团：把底物转化为产物 必需基团： 酶分子中与酶活性相关的基团 （羟基、巯基、咪唑基和羧基） 活性中心内必需基团——结合和催化 活性中心外必需基团——维持酶构象

活性中心的重要化学基团 补充： 7种氨基酸出现的频率最高 Lys Asp Glu Cys His Tyr Ser （兰天果拌猪肉丝） 某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基 和咪唑基）是酶的必需基团。 赖氨酸的氨基 天冬氨酸和谷氨酸的羧基 半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基 酪氨酸和丝氨酸的羟基

活性中心

活性中心

补充： 维持酶活性中心应有空间构象所必需的基团 与底物相结合，使底物与酶的一定构象形成复合物 影响底物中某些化学键的稳定，催化底物发生化学反应并将其转化成产物 维持酶活性中心应有空间构象所必需的基团 与底物相结合，使底物与酶的一定构象形成复合物

溶菌酶的活性中心 补充： * 谷氨酸35和天冬氨酸52是催化基团； * 色氨酸62和63、天冬氨酸101和色氨酸108是结合基团； * A~F为底物多糖链的糖基，位于酶的活性中心形成的裂隙中。

活性中心的共性 补充： (1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。 (2)活性部位是一个三维实体。 (3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 (4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。 (5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。

活性中心

活性中心

活性中心

研究酶活性中心的方法 用X射线衍射法直接检测底物或其类似物与酶形成的中间复合物（包括酶和底物）的相对位置。 补充： 1.物理学方法：

2.化学修饰法：根据所用修饰试剂不同，分为 补充： 1)非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。 若某基团被修饰后： 活性中心 2.化学修饰法：根据所用修饰试剂不同，分为 1)非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。 若某基团被修饰后： 酶活性不变——该基团可能不是酶的必需基团 酶活性降低或丧失——该基团可能是酶的必需基团 但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。

活性中心基团的鉴定标准 补充： ①失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。 ②S或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。 先加S或竞Ⅰ 加共价修饰剂 透析除去S或竞Ⅰ 活性不丧失

差别标记： 补充： 可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。 底物或抑制剂存在 活性基团不与修饰剂作用 活性中心 差别标记： 底物或抑制剂存在 活性基团不与修饰剂作用 去除底物或抑制剂 原来被保护的基团带同位素标记 可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。 化学修饰 含同位素标记 的同样试剂

补充： 2)专一性化学修饰（基团专一性修饰） 3)亲和标记（位点专一性修饰） 用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团。 采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物。 作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。

补充： 活性中心 化学修饰的专一性

补充： 活性中心 Y Y X Y Y X-Y

亲和修饰剂： 补充： 亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸 残基亲和力小。 ②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性 ①与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基 亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸 残基亲和力小。 ②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性 中心的基团形成稳定的共价键。

酶分子 结合部位 补充： 活性中心 催化部位 必需基团 维持活性中心的必需基团 其它部分（非必需基团） 调控部位 酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用

补充： 酶的分类与命名 （一） 习惯命名法 1.依据底物来命名（绝大多数酶）：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。 2.依据催化反应的性质命名：水解酶、转氨酶、脱氢酶等。 3.结合上述两个原则命名：琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶等。 4.在上述命名基础上有时加上酶的来源或酶的其它特点：胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性磷酸酯酶等。

补充： （二）国际系统命名法 原则：每一种酶有一个系统名称和习惯名称。 系统名称应该明确的标明酶的底物及催化反应的性质。 例：草酸氧化酶的系统名称是： 草酸：氧氧化酶

补充： （三）  国际系统分类法 每一个酶的分类编号由四个数字组成，数字间用“.”隔开，第一个数字表示酶所属的大类，第二、三个数字分别表示酶所属的亚类和亚亚类，第四个数字表示酶的顺序号。编号前冠以EC.

国际系统分类法 氧化还原酶类 Oxidoreductases 转移酶类 Transgerases 水解酶类 Hydrolases 补充： 国际系统分类法 氧化还原酶类 Oxidoreductases 转移酶类 Transgerases 水解酶类 Hydrolases 裂合酶类 Lyases 异构酶类 Isomerases 合成酶类 Synthetases Synthases

二、影响酶催化作用的因素 1、底物浓度对酶反应速度的影响 pH、T、[E]固定时，V对[S]作下图：

2、产物浓度对酶反应速度的影响 许多生物代谢途径的中间产物或终产物是酶的变构剂，使酶变构从而影响其反应速度，称为反馈调节作用。 反馈调节可分为正反馈调节作用和负反馈调节作用两种。

3、酶浓度对酶促反应速度的影响 条件：底物浓度足够大 酶浓度 反应速度 E2 E1 [S]>>[E] 反应速度与酶浓度成正比

4、温度对酶促反应速度的影响 温度对酶促反应有双重影响：一方面温度升高加速了酶反应的进行；另一方面温度升高也加速了酶蛋白的变性。 v 最适温度

5、pH对酶促反应速度的影响 最适pH一般4～8 动物酶5.5～6.5； 植物酶6.5～8.0； 反应速度/相对活力 胰蛋白酶 酶有最适pH的原因： 酶分子的解离状态；底物的解离状态；〔ES〕的形成。

6、抑制剂对酶促反应速度的影响 有些物质能与酶分子上某些必须基团结合（作用),使酶的活性中心的结构和性质发生改变，导致酶活力下降或丧失，这种现象称为酶的抑制作用。 抑制作用的类型：根据抑制剂与酶的作用方式及抑制作用是否可逆，分为两大类： 不可逆性抑制作用 可逆性抑制作用

不可逆抑制作用 概念：抑制剂与酶活性中心必需基团共价结合，不能用透析、超滤等物理方法将其除去 常见抑制剂：巯基酶抑制剂 羟基酶抑制剂

可逆性抑制作用 概念：抑制剂与酶非共价结合，可用透析、超滤等方法除去 类型：竞争性抑制作用 非竞争性抑制作用 反竞争性抑制作用

7、激活剂对酶反应速度的影响 凡能提高酶活性的物质,都称为激活剂,其中大部分是离子或简单有机化合物。 2.有机分子 按其分子大小可分为： 1、无机离子 （1） 金属离子：K+ 、Na+ 、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+ 等；形成酶－金属离子－底物三元复合物，更有利于底物和酶活性中心部位的结合。 （2）阴离子, α-淀粉酶受Cl-激活； （3）H+，胃蛋白酶受H+激活； 2.有机分子 （1）某些还原剂谷胱甘肽、半胱氨酸等，保护巯基酶分子中的巯基不被氧化。 （2）EDTA、金属螯合剂，能除去酶中的重金属杂质，解除抑制。 3.具有蛋白质性质的大分子物质 酶原 酶 蛋白酶（激酶）

第三节 酶的活力测定 一、酶的活力单位 检测酶含量及存在，很难直接用酶的“量”（质量、体积、浓度）来表示，而常用酶催化某一特定反应的能力来表示酶量。 酶活力（酶活性），指酶催化一定化学反应的能力。 酶活力是用在一定条件下，它所催化某一反应的反应初速度来表示。即在酶促反应过程中，底物浓度消耗不超过5％时的速度。酶反应速度(指初速度) 可以用单位时间内反应底物的减少或产物的增加表示。

1961年国际生物化学学会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”（U）来表示酶的活力。 在特定条件下，每分钟内能转化1μmol底物或催化1μmol产物形成所需要的酶量为1个酶活力单位。特定条件是指：温度选定为25℃，其他条件（比如底物浓度、缓冲液离子强度、pH值等）均采用最适条件。 1972年国际酶学委员会为了使酶的活力单位与国际单位制中的反应速率表达方式相一致，推荐使用一种新的酶活单位催量（kat）。 在最适条件下，每秒钟能使1mol底物转化为产物所需的酶量定为1Kat。 1 Kat = 1mol/s = 60 mol/min = 6×107U

习惯单位： 在实际使用中，结果测定和应用都比较方便、直观，规定的酶活力单位，不同酶有各自的规定，如： ①α-淀粉酶活力单位：每小时分解1g可溶性淀粉的酶量为一个酶单位。（QB546-80），也有规定每小时分解1mL2%可溶性淀粉溶液为无色糊精的酶量为一个酶单位。显然后者比前一个单位小。 ②糖化酶活力单位：在规定条件下，每小时转化可溶性淀粉产生1mg还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为一个酶单位。 ③蛋白酶：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量。 ④DNA限制性内切酶：推荐反应条件下，一小时内可完全消化1μg纯化的DNA所需的酶量。

总活力单位 比活力 = = U mg蛋白 总蛋白mg数 二、酶的比活力 酶的比活力又称比活性：指在特定条件下，单位质量蛋白质或RNA所拥有的酶活力单位数。 比活力 = 总活力单位 总蛋白mg数 = U mg蛋白 实际应用中也用每单位制剂中含有的酶活力数表示（如：酶单位/mL（液体制剂），酶单位/g（固体制剂）），对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度越高（含杂质越少）。 在评价纯化酶的纯化操作中，还有一个概念就是回收率。 回收率=某纯化操作后的总活力/某纯化操作前的总活力 ［总活力=比活力×总体积（总重量）］

三、酶的转换数和催化周期 转换数（kcat）又称分子活性，或摩尔催化活性定义为: 当酶被底物饱和时，在单位时间内，酶分子中每个活性中心或每个分子酶所能转化的底物分子数，是酶催化效率的一个指标。 如果每一个酶分子只有一个催化中心，那么催化中心活性等于摩尔催化活性。如果一个酶分子有几个催化中心，那么催化中心活性等于摩尔催化活性除以n。 转换数的倒数称为酶的催化周期。催化周期是指酶进行一次催化所需的时间。即T = 1 / kcat。

过氧化氢酶有很高的转换数。溶菌酶需要2s才能使底物的糖苷键裂解。

四、酶活力的测定方法 酶活力与底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂、抑制剂的浓度以及缓冲液的种类和浓度都密切相关。酶活性测定可用终止反应法或连续反应法。 （一）终止法 终止法是在恒温系统中进行酶促反应，间隔一段时间之后，终止酶反应然后测定反应物的消耗量或产物的生成量，算出酶活性。 终止酶反应常用加热使酶变性、强酸、强碱、三氯乙酸或过氯酸，也可用SDS）、乙醇等方法使酶失活。 产物的测定方法可用化学法、放射化学法或酶偶联法等。

1.化学法 化学法是利用化学反应将底物或产物转变成一个可用某种物理方法测定的化合物。 例如：脲酶催化尿素水解，得到产物NH3和CO2，然后用比色法、滴定法、气体体积量度法等方法测出酶活性。 2.放射性化学法 用同位素标记底物元素，终止反应后将底物与产物分离，然后测定底物或产物的放射性，从而确定酶的活性。

有些酶促反应的产物不易直接测定，需加入指示酶转变成可测定的产物。 3.酶偶联法 有些酶促反应的产物不易直接测定，需加入指示酶转变成可测定的产物。 例如：葡萄糖氧化酶催化的下列反应： 葡萄糖 + O2 → 葡萄糖内脂 + H2O2 欲测定葡萄糖内脂和H2O2均较困难，可在该反应中加入过氧化物酶和木酚，使发生下列反应: 由于4—甲氧联酚在435nm波长处有光吸收峰，因此只要测定A435，就可知4—甲氧联酚的量，可得H2O2的量，从而可推知酶活力。

（二）连续反应法 连续反应法无需终止反应，而是基于酶反应过程中的光谱吸收、气体体积、酸碱度、温度、黏度等的变化，用仪器跟踪检测反应进行的过程，记录结果，算出酶活性。 连续法使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动力学研究，但很多酶还不能用该法测定。 （1）一般的连续法：包括光谱吸收、电化学、量气、量热、旋光法等，其中以光谱吸收较为准确。 光谱吸收主要指分光光度法和荧光法。该法适用于一些反应速度较快的酶，自动记录仪的普遍使用使该法更容易被人们所接受。

（2）偶联的连续法 是将指示酶直接加到待测酶反应系统中，将待测酶的反应产物直接或间接转变成可用光谱吸收仪检测的化合物。 连续的偶联反应必须在酶反应相同条件（pH、温度等）下进行，且加入的指示酶以及其他各种物质不能干扰待测酶的活力。

例：醛缩酶催化1，6-二磷酸果糖生成3-P-甘油醛和磷酸二羟丙酮的反应，这些产物都无法直接测出。用磷酸丙糖异构酶来作偶联酶, 甘油-1-P-脱氢酶来作指示酶，依据NADH变成NAD+的光谱变化来算出醛缩酶活性。

（三）酶活力测定中应注意的问题 1、测定的酶反应速度必须是初速度，只有初速度才与底物浓度成正比。初速度的确定一般指：底物消耗量在5％以内，或产物形成量占总产物量的15％以下时的速度。 2、底物浓度、辅因子的浓度必须大于酶浓度(即过饱和)，否则，底物浓度本身是一个限制因子，此时的反应速度是两个因素的复变函数。 3、反应必须在酶的最适条件(如最适温度、PH和离子强度等)下进行。 4、测定酶活性所用试剂中不应含有酶的激活剂、抑制剂；同时底物本身不要有裂解。 5、用反应速度(v)对酶浓度( E)作图，应得一条通过原点的直线，即v为（E）的线性函数。

酶反应动力学是研究酶反应速度规律以及各种因素对酶反应速度影响的科学。 第四节 酶反应动力学 酶反应动力学是研究酶反应速度规律以及各种因素对酶反应速度影响的科学。 影响酶反应速度的因素有：浓度因素（酶浓度、底物浓度、效应物浓度）、外部因素（温度、pH、离子强度、溶液的介电常数、压力等）、内部因素（酶的结构、底物和效应物的结构、载体等）等。对于固定化酶反应等非均相反应体系中的物质扩散等因素。

一、米氏方程 “快速平衡”假设的M-M方程 “拟稳态”假设的B-H方程 E 反应 S P 反应机理 假 设 假 设 1 [E0] = [E] ＋ [ES] [S]>>[E] [S]=[S0] 3 忽略 P+E ES

“快速平衡”假设的M-M方程 “拟稳态”假设的B-H方程 假设 4 产物生成速率 动力学方程 Ks与Km

关于Km： 1. Km的物理意义是：当酶促反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度。 单位：mol/L或mmol/L 2. Km是酶的特征常数之一。一般只与酶的性质、底物种类及反应条件有关，与酶的浓度无关。 Km值范围一般在10-6 ~10-2 mol/L。 3. Km最小的底物称为该酶的最适底物或天然底物。 4. Km 的大小，可近似地说明酶与底物亲和力的大小。

关于kcat： 对于在简单的米氏方程情形下（只有一种ES复合物），假定反应混合物中的酶浓度([E0])是已知的, 且[S]远大于[E0]，则： v ＝ Vmax ＝ k2[E0] k2称为转换数 k2 ＝ Vmax/[E0] ＝ kcat kcat代表了酶的动力学效应。 同时， 在上述条件下， v与[E0]成线性关系，可用于酶活力的测定。

关于反应速度v与底物浓度[S]之间的关系：

二、酶催化反应动力学参数求取 1、Lineweaver－Burk（双导数作图法） 一般所选底物浓度需在Km附近。 缺点：1.要选择适当 [S] ，使1/[S]为等距离的增值； 2.在测定v时产生的小误差，当取倒数时会放大

2、Hanes-Woolf法

3、Eadie-Hofstee法