第二章 自动生物化学分析仪的应用与原理

自动生物化学分析仪的特点: 精密度高，功能齐全； 可进行吸光度、浓度和酶活力的测定，能使用终点法和连续监测法进行分析； 具有快速、简便、微量、标准化、样品和试剂用量低等优点。

第一节 自动生物化学分析仪的类型

①按反应装置的结构可分为连续流动式、离心式、分立式和干片式四类。 ②按自动化程度可分为全自动和半自动型。 ③按同时可测定项目可分为单通道和多通道两类。 ④按仪器的复杂程度及功能可分为小型、中型和大型三类。

一、连续流动式自动生物化学分析仪 连续流动式自动生物化学分析仪是第一代自动分析仪，在测定过程中各待测样品与试剂混合后的化学反应均在同一管道内流动的过程中完成。

（一）仪器结构 仪器主要构成部件有：样品盘、比例泵、混合器、透析器、恒温器及检测装置组成。

（二）工作原理 在微机控制下，通过比例泵将标本和试剂注入到连续的管道系统中，在一定的温度下，在管道内完成混合，去除干扰物，保温，比色测定，信号放大，运算处理，最后将结果显示并打印出来。

二、离心式自动生物化学分析仪 离心式生物化学分析仪是1969年发展起来的一种机型，它的全部检验过程是在一个类似离心机转头样的圆盘上完成的。

（一）仪器结构 离心式分析仪由加样和分析两个部分组成，加样部分：包括样品盘、试剂盘、吸样臂、试剂臂和电子控制部分等。分析部分：除安装有特殊的离心转盘外，还有温控和光学检测系统，以及微机信息处理和显示系统。

（二）工作原理 先将样品和试剂分别置于转盘相应的凹槽内，当离心机开动后，受离心力的作用，试剂和样品相互混合发生反应，经适当的时间后，各样品最后流入转盘外圈的比色凹槽内，通过比色计检测。

三、分立式自动生物化学分析仪 分立式自动生物化学分析仪是目前国内外多采用的设计模式，因具有结构简单、检测速度快的特点，新设计开发的仪器已少采用连续流动式和离心式。

（一）工作原理 分立式自动生物化学分析仪是按人工操作的方式编排程序，并以有序的机械动作代替人工，按程序依次完成各项操作的自动分析仪器。仪器操作过程中的各环节用传送带连接，按程序依次操作。

四、干化学式自动生物化学分析仪 分析仪是采用干化学(dry chemistry)方法，将发生在液相反应物中的反应，转移到一个固相载体上，利用分光检测系统进行检测的一类新型仪器。

（一）工作原理 干化学分析仪多采用多层薄膜的固相试剂技术，仅需将样品加在固相试剂上进行测定。

（二）仪器的类型及特点 一种是使用试条的反射光度法系统(reflotron system)；另一种是采用胶片涂层技术的化学分析系统(vitros chemistry system)，它与Reflotron系统的区别是前者使用试条，后者则使用试剂片或块状剂。

第二节 自动生物化学分析仪性能及评价

一、生物化学自动分析仪性能 （一）自动化程度 自动化程度是指仪器能够独立完成生物化学测定操作程序的能力。除此之外，自动化程度还包括其他许多内容，如单位时间处理标本的能力，可同步分析的项目数等。

（二）分析效率 分析效率是指在测定方法相同的情况下自动生物化学分析仪的分析速度。分析速度决定于一次测定中可测样品多少和可测项目的多少。

（三）应用范围 仪器的应用范围是仪器的一个综合性指标，包括仪器所能进行的分析方法以及可测定项目的种类，应用范围与仪器的设计原理及结构有关。

（四）精度与准确度 精度和准确度是自动生物化学分析仪提供实验分析结果的精密度和准确度的基础。自动生物化学分析仪的精度和准确度取决于仪器各部件的加工精度和精确的工作状态。

（五）其他性能 除上述指标外，仪器的取液量、最小反应液体积和测试速度也是我们评价仪器性能的指标。

二、自动生物化学分析仪性能评价指标 常用性能评价指标有精密度、波长准确性、线性以及与其他仪器的相关性等。

(一)精密度评价 批内重复性：测定批内重复性就是对样品的某一个或几个项目各重复测定20次，计算它的CV值即不精密度，然后与厂家的该项技术指标进行比较。 总精密度：选择某一常用的临床项目的两个浓度(有医学决定水平的正常和异常值)，每天做室内质量控制。然后计算总精密度(ST)。

与厂商估计的精密度或临床要求的精密度比较，将计算好的批内精密度和总精密度用χ2检验法进行比较，若所计算的χ2值小于表中的χ2，则说明所测精密度与厂商估计值无显著性差异。

(二)相关性 不同仪器的测定结果之间不可避免地存在着一定的差别，为了取得一致的结果，拥有两台仪器以上的实验室，应该进行仪器间的校正。在仅有一台仪器时，为了得到实验室之间的一致性，也可以用参考实验室的仪器进行校正。

(三)波长校正 波长校正包括线性和准确性的检查。线性检查方法是用系列标准溶液在最大吸收处读取吸光度，然后绘制标准曲线或用回归法计算线性相关。

准确性检查的方法有两种： ①用已知准确摩尔浓度和摩尔消光系数(ε)的溶液在其特定波长比色，计算ε=A值／摩尔浓度，然后与标准ε比较。 ②与已知准确波长的仪器比较，如有漂移，应进行适当的校正。

第三节 自动生物化学分析仪常用分析方法

一、分析方法的种类 (一)终点分析法(平衡法) 终点分析法是基于反应达到平衡时反应产物的吸收光谱特征及其对光吸收强度的大小，对物质进行定量分析的一类方法，它是实验室最常用的方法之一。

一点终点法：一点终点法的特点是使用一种或两种试剂。当样品和试剂混合后，待测物与试剂的物理化学反应达到终点时，测定吸光度,计算待测物的浓度。该法具有代表性的试验有：总蛋白、清蛋白、葡萄糖氧化酶法等。

两点终点法：两点终点法也称固定时间法，它可以用一种试剂，也可以用两种试剂。该方法的优点是可以消除样品、试剂的颜色、浊度，以及一些干扰物质对测定的干扰。

双波长法：其原理是检测计在对一待测物进行检测时，同时用两个波长检测，用主波长的吸光度减去副波长的吸光度，标准物与待测物同等对待，计算待测物的浓度。

(二)连续监测法 测定底物的消耗或产物生成速度的化学方法称为连续监测法。它是通过适当的仪器，连续测定酶促反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度。

具体方法有： 1．两点速率法 2．多点速率法 3．回归法 4．带速率时间法

(三)比浊测定法 通过检测物质对光的散射或透射强度来测定物质的方法称比浊法。免疫透射比浊法是自动生物化学分析仪常用方法。目前常用的免疫比浊法主要用于血清特种蛋白的检测，如载脂蛋白、微量蛋白、急性时相反应蛋白、免疫球蛋白以及某些药物监测等。

(四)均相酶免疫分析法 该类方法是以生物体内某种特异性很强的结合反应作为测定基础，在结合反应中可将某种参加反应的反应物用标记物加以标记。利用酶作标记物，以抗原抗体相互结合的免疫反应为基础的方法称酶免疫分析法。

二、自动生物化学分析仪实验参数的设置 主要包括样品量、试剂量、测定方法、校正方法、反应时间、测定波长和控制因素等。

(一)样品与试剂量 样品与试剂量的确定一般按照试剂说明书上的比例，并结合仪器的特性进行设置。仪器的特性有：样品和试剂的最小加样量及加量范围、最小反应液的体积等。

(二)试剂的选择 单试剂法：在反应过程中仅加一次试剂的方法称单试剂法。其常见的有： ①单试剂单波长法：指在选定的温度和某一特定的波长，读取反应一定时间时的吸光度的方法。这是单试剂法中最常见的方法。

②单试剂双波长法：单试剂双波长法主要是为了消除检测体系或标本的混浊而设置。自动生物化学分析仪大部分终点分析均用此法。 ③标本空白法：该法使用单波长或双波长均可，常用本法来做终点分析。

双试剂法:其常见的有: ①双试剂单波长一点法：检测试剂分成两部分加入，只读一次吸光度。 ②双试剂二点法：为了去掉标本色素、浊度的影响，也可用双试剂，在加入第一试剂后读取一次吸光度，再加第二试剂，反应一定时间后再读取一次吸光度，依两次吸光度之差计算结果。 ③双试剂双波长法

(三)测定方法的选择 半自动生物化学分析仪一般具备其中的一点终点、两点终点(单试剂)、连续监测法(只能是一种固定方法)。全自动生物化学分析仪的功能较全面，具有前述的各种方法，可根据需要进行选择。

(四)波长的选择 单波长：单波长是用一个波长检测物质的光吸收强度的方法。当测定体系中含有一种组分或在混合溶液中待测组分的吸收峰与其他共存物质的吸收波长无重叠时，可选用。

双波长：用两个不同波长检测。当被检溶液混浊或存在较大的干扰物质的光吸收时会出现光散射和非特异性光吸收，从而影响测定结果的准确性，此时可用双波长甚至多波长测定，以提高测定结果的准确性。

(五)分析时间的选择 生物化学反应的时间是某一项目所特有的，根据所采用的测定方法不同而异。反应时间应根据试剂说明书或自己试验观察，作合理的选择和设置。

(六)校正方法 仪器内设置的校正方法一般包含二点校正、多点校正、线性、非线性(对数、指数法、量程法)等。

三、实验用水质量及生物化学实验室条件 (一)实验用水的质量 生物化学自动分析仪对水质有严格的要求，水的质量直接影响到实验结果和仪器的使用期限。因此，每个实验室均应有完善的纯化水的来源及管理，才能获取良好的检验质量。纯化水制备常用方法可分三大类：①蒸馏法、②去离子法、③逆渗透法。

临床实验室用水一般选用二级，特殊实验如酶学测定或科研用水应选一级水。三级水则用作仪器、器血经自来水冲洗后的再冲洗，但使用一级水的实验，其器皿的最后冲选仍应用一级水。用一级水进行的实验不得用次级水稀释标本和配制标准液。

(二)仪器工作环境的要求 生物化学实验室的面积要求大于20平方米。 仪器要避开化学腐蚀物品，放置在无灰尘处，并且避免置于出现烟雾和蒸汽的区域。

生物化学实验室配套设施应齐全，要求有空调器和取暖设施。 生物化学实验室一般用电量较大，应根据仪器设备对电源的要求和总负载量设置专用电路，避免使用普通照明线路作为仪器室的电源。

小 结