多序列比对和系统进化分析 ——以镰刀形贫血症为例 浙江大学生物信息实验室
主要目的 了解分子进化及系统发育分析 掌握多序列比对方法 熟悉系统发育树建立方法 掌握用Mega软件进行构建系统发育树
多序列比对和系统进化
序列比对 序列比对是序列相似性分析的常用方法。通过将两个 或多个核酸序列或蛋白序列进行比对，显示其中相似 的结构域，这是进一步相似性分析的基础。通过比较 未知序列与已知序列的一致性或相似性，可以预测未 知序列功能。 根本任务： 发现序列之间的相似性，辨别序列之间的差异 目的： 相似序列，相似的结构，相似的功能 判别序列之间的同源性 推测序列之间的进化关系
两条序列比对 多序列比对 通过比较两条序列之间的相似区域和保守性位点，寻 找二者之间可能的进化关系。 局部比对算法（Blast） 全局比对的算法（多序列比对） 多序列比对 序列多重比对（Multiple Alignment）的目标是发现多条 序列的共性。 用于描述一组序列之间的相似性关系，以便了解一个 基因家族的基本特征，寻找motif，保守区域等。用于 描述一个同源基因之间的亲缘关系的远近，应用到分 子进化分析中。在比对过程 如果说序列两两比对比较主要用于建立两条序列的同源关系和推测它们的结构、功能，那么，同时比对一组序列对于研究分子结构、功能及进化关系更为有用。 某些在生物学上有重要意义的相似性只能通过将多个序列对比排列起来才能识别。同样，只有在多序列比对之后，才能发现与结构域或功能相关的保守序列片段。 对于一系列同源蛋白质，人们希望研究隐含在蛋白质序列中的系统发育的关系，以便更好地理解这些蛋白质的进化。在实际研究中，生物学家并不是仅仅分析单个蛋白质，而是更着重于研究蛋白质之间的关系，研究一个家族中的相关蛋白质，研究相关蛋白质序列中的保守区域，进而分析蛋白质的结构和功能。
分子进化及系统发育分析 分子进化研究目的 从物种的一些分子特性出发，构建系统发 育树，进化了解物种之间的生物系统发现 关系 通过序列同源性的比较进而了解基因的进 化以及生物系统发生的内在规律 系统发育树 是表明被认为具有共同祖先的物种演化关 系的树，是一种亲缘分支分类方法。
系统发育树的构建
使用工具 Blast Clustalx MEGA
Example-Sickle Cell Anemia 镰状细胞贫血是一种常染色体显性遗传血红蛋白(Hb)病。因β-肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸所代替，构成镰状血红蛋白(HbS),取代了正常Hb(HbA)。
实验流程 一段序列 同源序列 多序列比对 系统发育树 Blast MEGA
Part 1 Blast软件的使用 一段序列 同源序列 多序列比对 系统发育树 Blast MEGA Blast
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)即碱基局部对准检索工具，是一种序列类似性检索工具。它采用统计学记分系统，能将真正配对的序列同随机产生的干扰序列区别开来；同 时采用启发式算法系统，即采用的是局部对准算法(Local Alignment Algorithm)，而不是全序列对准算法(Global Alignment Algorithm)。 Blast是通过比对(alignment)在数据库中寻找和你的查询序列(query)相似度很高的序列。通俗地说就是在已知的序列数据库中找和你的序列差不多的序列。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Blast种类 blastp:将待查询的蛋白质序列及其互补序列一起对蛋白质序列数据库进行查询； blastn:将待查询的核酸序列及其互补序列一起对 核酸序列数据库进行查询； blastx:先将待查询的核酸序列按六种可读框架（逐个向前三个碱基和逐个向后三个碱基读码）翻译成蛋白质序列，然后将翻译结果对蛋白质序列数据库进行查询； tblastn：先将核酸序列数据库中的核酸序列按六种可读框架翻译成蛋白质序列，然后将待查询的蛋白质序列及其互补序列对其翻译结果进行查询； tblastx：先将待查询的核酸序列和核酸序列数据库中的核酸序列按六种可读框架翻译成蛋白质序列，然后再将两种翻译结果从蛋白质水平进行查询。
Blast种类选择
Blast种类 输入序列
图像总览
结果描述
比对信息
下载序列 Human sickle beta-hemoglobin mRNA 人镰刀型血红蛋白 Human messenger RNA for beta-globin 人信使RNAβ球蛋白 Gorilla gorilla 大猩猩血红蛋白 Synthetic construct HBB 人工合成血红蛋白 Ursus maritimus 北极熊血红蛋白 Balaenoptera omurai 角岛鲸血红蛋白 Pteropus alecto 狐蝠血红蛋白 Callithrix jacchus 普通狨血红蛋白 Canis lupus familiaris 家犬血红蛋白 Ceratotherium simum 白犀血红蛋白
下载序列
编辑序列-seqdump.txt
同源序列-seqdump2.txt 名字中不能有空格
Part 2 Clustalx软件的使用 一段序列 同源序列 多序列比对 系统发育树 Blast MEGA Clustalx
Clustalx－Clustal是一个单机版的基于渐进比对的多序列 比对工具，由Higgins D. G Clustalx－Clustal是一个单机版的基于渐进比对的多序列 比对工具，由Higgins D.G.等开发。 Clustalx是Clustal多 重序列比对程序的Windows版本。 序列将显示屏幕的窗口中。采用多色彩的模式可以在比 对中加亮保守区的特征。窗口上面的下拉菜单可让你选 择传统多重比对和轮廓比对需要的所有选项。 Clustalx比对结果是构建系统发育树的前提
Clustalx主界面 Clustalx界面
导入同源序列 Clustalx界面
导入同源序列 Clustalx界面
导入同源序列
多序列比对
多序列比对-seqdump2.aln
结果文件
Part 3 MEGA软件的使用 一段序列 同源序列 多序列比对 系统发育树 Blast MEGA MEGA
MEGA全称是molecular evolutionary genetics analysis(分子进化遗传分析)。可用于序列比对、进化树的推断、估计分子进化速度、验证进化假说。 http://www.megasoftware.net/
MEGA主界面 Clustalx界面
数据转格式 Clustalx界面
数据转格式 Clustalx界面 1.点击 2.点击
数据转格式 Clustalx界面
数据转格式-命名 Clustalx界面
数据转格式 Clustalx界面
删掉
数据转格式 Clustalx界面
导入数据 Clustalx界面
导入数据 Clustalx界面
导入数据 Clustalx界面
导入数据 Clustalx界面 点击打开文件窗口 显示保守位点 显示变异位点
系统发育树 Clustalx界面
系统发育树 Clustalx界面
系统发育树——构建方法 分化程度较大的远缘序列： 分化程度较小的近缘序列： 最大似然法（Maximum Likelihood，ML） Clustalx界面 分化程度较大的远缘序列： 最大似然法（Maximum Likelihood，ML） 邻接法 （Neighbor-joining，NJ） 最小进化法（Minimum-Evolution，ME） 分化程度较小的近缘序列： 最大简约法（Maximum Parsimony，MP） 除权配对法（UPGMA）
系统发育树——进化树可靠性 Bootstrap Method 从排列的多序列中随机有放回的抽取某一列，构成相同长度的新的排列序列 Clustalx界面 Bootstrap Method 从排列的多序列中随机有放回的抽取某一列，构成相同长度的新的排列序列 重复上面的过程，得到多组新的序列 对这些新的序列进行建树，再观察这些树与原始树是否有差异，以此评价建树的可靠性 至少进行100次重复取样
系统发育树——以最大似然法为例 Clustalx界面
系统发育树 Clustalx界面 当前打开文件
系统发育树 Clustalx界面
系统发育树 Original tree Bootstrap consensus tree 节点上的值为通过Bootstrap检验次数的百分数 Clustalx界面 Original tree Bootstrap consensus tree 节点上的值为通过Bootstrap检验次数的百分数
系统发育树 Tree:树型选择 Branch:分支信息修改 Label:分支名称修改 Scale:标尺设定 Cutoff:阈值设置 Clustalx界面 Tree:树型选择 Branch:分支信息修改 Label:分支名称修改 Scale:标尺设定 Cutoff:阈值设置
系统发育树 Clustalx界面 双击修改命名 子树操作符 搜索
系统发育树——多种树型 Clustalx界面
系统发育树——保存 Clustalx界面
系统发育树——保存 Clustalx界面
Part 4 MEGA软件做多序列比对
导入数据 Clustalx界面 注意：文件必须是fasta格式，且以.fasta为后缀
导入数据 Clustalx界面
导入数据 Clustalx界面
多序列比对
多序列比对
多序列比对
多序列比对 Clustalx界面
小 结 一段序列 同源序列 多序列比对 系统发育树 Blast MEGA Blast Clustalx MEGA
课后练习 在NCBI中找到P26374的蛋白序列，然后通过blastp，搜索nr库中相似的10个序列，多序列比对后，用Mega软件进行系统发育树构建（要求用两种以上方法）
谢谢