第九章 蛋白质组学 的研究方法和进展 2019/10/24

前言—从基因组学到蛋白质组学 Life is based on proteins and their interactions 2019/10/24 One Genome – different Proteomes

20世纪生命科学的辉煌成就 1953年Watson & Crick，DNA双螺旋结构提出 1957年，“中心法则”的问世 20世纪90年代，人类基因组计划（HGP） 2019/10/24

基因组计划的局限 无法解决“基因精细调控”问题 “mRNA” 无法反映蛋白质的质与量。 2019/10/24

以往人类对于蛋白质的研究只是针对生命活动中某一种或某几种蛋白质，难以形成一种整体观，难以系统透彻地阐释生命活动的基本机制。 　　　以往人类对于蛋白质的研究只是针对生命活动中某一种或某几种蛋白质，难以形成一种整体观，难以系统透彻地阐释生命活动的基本机制。 大规模、全方位的蛋白质研究势在必行。 2019/10/24

第一节 蛋白质组学的概念及其发展史 2019/10/24

蛋白质组（proteome） 由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部蛋白质。 同一基因组在不同细胞、不同组织中蛋白质表达各不相同。 空间和时间上呈动态变化。 2019/10/24

蛋白质组学(proteomics) 从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 2019/10/24

主要研究内容 了解特定的细胞、组织或器官表达的 蛋白质种类； 明确各种蛋白质分子相互作用网络； 描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其 结构上的关键部位，如与药物结合 并且决定其活性的部位。 2019/10/24

功能蛋白质组学 (functional proteomics) 细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的全部蛋白质。 2019/10/24

国际研究进展 1996年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（APAF） 美国NCI —— 肺、直肠、乳腺和卵巢等肿瘤的蛋白质组数据库 NCI与FDA —— 有关癌症不同发病阶段和治疗阶段的蛋白质组数据库 英国、法国、德国、日本等国也分别投入巨资进行蛋白质组学的研究 2019/10/24

The HUPO World… The Human Proteome Organisation Sweden United Kingdom Russia Canada Germany France Italy USA Korea China Japan Asia Oceania There are over 15,000 researchers world-wide that are involved in proteomics. Since 2001, 19 regional and national proteomic associations from most of the leading countries in the field, have become affiliated with HUPO. Latin America Australia The Human Proteome Organisation 2019/10/24

1. Human Liver Proteome Project(HLPP) 2. Human Brain Proteome Project(HBPP) 3. Proteomic Standards Initiative(PSI) 4. Human Antibody Initiative(HAI) 5. Plasma proteome Project(PPP) 6. Mouse Models Human Disease(MMHD) 7. Human Disease Glycomics/Proteome Initiative (HGPI) 8. HUPO Cardiovascular Initiative(HUPO CVI) 2019/10/24

国内进展 国家自然科学基金委于1997年设立了重大项目“蛋白质组学技术体系的建立” 1998年启动了蛋白质组学研究 中国科学院生物化学研究所、军事医学科学院等单位启动蛋白质组研究 中国科学院上海生命科学研究院、军事医学科学院与复旦大学相继成立了专门的蛋白质组学研究中心 2019/10/24

科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。 我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大进展。 2019/10/24

第二节 蛋白质组学研究方法概述 2019/10/24

一、蛋白质组表达模式研究方法 研究蛋白质组的组成成分 主要技术有双向凝胶电泳、以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学技术。 2019/10/24

采用细胞或组织的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。 （一）蛋白质组研究中的样品制备 采用细胞或组织的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。 进行样品预分级，将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究，提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。 2019/10/24

样品预分级的主要依据 蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等 蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等 蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等 2019/10/24

组织水平蛋白质组样品制备 原因：临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤中癌变的上皮类细胞总是与血管、基质细胞等混杂。 2019/10/24

激光捕获显微切割(laser capture microdissection，LCM) 可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群。 2019/10/24

（二）蛋白质组研究中的样品分离 双向凝胶电泳 (two-dimensional electrophoresis, 2-DE) 利用蛋白质等电点和分子量差异，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。 2019/10/24

根据蛋白质等电点的不同进行第一向等电聚焦电泳分离 转移到第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，再根据相对分子质量大小不同进行分离 工作原理： 根据蛋白质等电点的不同进行第一向等电聚焦电泳分离 转移到第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，再根据相对分子质量大小不同进行分离 2019/10/24

第一向等电聚焦电泳（isoelectrophoresis focusing, IEF） （＋） （＋） 低pH 第一向等电聚焦电泳（isoelectrophoresis focusing, IEF） 聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下沿电场方向在凝胶内制造一个pH梯度。每种蛋白质都将迁移至与它的pI 相一致的pH处。 低pH 等电聚焦电泳进行过程中 等电聚焦电泳结束后 高pH 高pH 2019/10/24 （－） （－）

固相pH梯度等电聚焦的优点 克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。 可以精确设定pH梯度。 2019/10/24

第二向SDS-PAGE电泳 双向凝胶垂直电泳 双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维分布图：水平方向反映出蛋白在pI上的差异，垂直方向反映分子量上的差别。 2019/10/24

固相pH梯度等电聚焦电泳（第一向）示意图 3-4 mm 70 - 240 mm gel Plastic backing 固相pH梯度等电聚焦电泳（第一向）示意图 2019/10/24

SDS- PAGE SDS-PAGE电泳（第二向）示意图 2019/10/24

二维电泳的主要步骤： 1. 样品准备 2. 第一维：固相pH梯度等电聚焦 3. 第二维：SDS-PAGE电泳 4. 染 色：考马氏亮兰或银染 　4. 染 色：考马氏亮兰或银染 　5. 图像分析：肉眼或自动扫描 2019/10/24

2-DE流程图 1st dimension IEF 2nd dimension SDS-PAGE Imaging and data evaluation Spot excision and mass spectrometry Sample preparation Gel staining 2019/10/24

蛋白质二维电泳图谱 30 10 kDa pH 10 pH 3 pI 2019/10/24

低分化星形胶质细胞瘤中表达明显上调蛋白 Glial fibrillary acidic protein, astrocyte (L1) cAMP-dependent protein kinase (L4) 12 L4 Low-grade High-grade TCP-1- epsilon (L2) Protein disulfide isomerase A3 (L3) 66 59 L2 L3 Dihydropteridine reductase (L5) 36 L5 39 44 L1 2019/10/24

高分化星形胶质细胞瘤中表达明显上调蛋白 -Internexin (H1) Apoliprotein A-I (H4) H1 H4 H4 68 68 40 40 Low-grade High-grade Low-grade High-grade Actin, cytoplasmic 1 (H2) Peroxiredoxin 6 (H5) Fibrinogen fragment D (H3) H2 H2 13 13 68 68 48 48 H3 H3 H5 H5 Low-grade High-grade Low-grade High-grade 2019/10/24

二维电泳优点 可分离10～100 kD 范围内蛋白质 高灵敏度和高分辨率 便于计算机进行图像分析处理 与质谱分析匹配 2019/10/24

二维电泳缺点 极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。 胶内酶解过程费时、费力，难于与质 谱联用实现自动化。 2019/10/24

新型非凝胶技术 液相色谱法 分配色谱法 吸附色谱法 离子交换色谱法 排阻色谱法 毛细管电泳 LabAlliance Model 2000二元高压半制备梯度系统 2019/10/24

（三）蛋白质组研究的样品鉴定　 基本原理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比(m/z)的差异来分离并确定样品的分子量。 2019/10/24

Spot identification Spots of interest Spot cutter Spot Picking Digestion MS Analysis and Database search 2019/10/24

生物质谱技术(Mass Spectrometry) 通过测定样品离子的质荷（m/z）来进行成分和结构分析。 Moleculars Ions Detector Successful ion path Quadrupole Ion Analyzer Electron Impact Ionizer 2019/10/24

“软电离”的特点 分子电离时保留整个分子的完整性，不会形成碎片离子。 灵敏度高、快速、能同时提供样品的精确分子量和结构信息、既可定性又可定量、并能有效地与各种色谱联用来分析复杂体系。 2019/10/24

主要质谱类型 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS） 电喷雾质谱（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS） 2019/10/24

鉴定和注释蛋白质的路线 通过肽质谱指纹图(peptide mass finger-printing,PMF)和数据库搜寻匹配 通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配 2019/10/24

Sample MS Spectrum 2019/10/24

典型二级质谱图 2019/10/24

肽质谱指纹图在数据库中匹配不成功的可能原因 样品量太少，PMF图信噪比太低 2-DE胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质 角蛋白或其他蛋白质的污染 蛋白质发生较多的转译后修饰，数据库中未有记载 所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多 未知的新蛋白质 数据库规模太小 2019/10/24

联合技术精确鉴定蛋白质 组织切片或印片原位质谱分析技术 两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF） 傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS） 表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱 （SELDI-TOF-MS） 2019/10/24

液质联用技术（LC-MS/MS） 蛋白质混合物通过液相色谱分离以代替2-DE的分离,然后进入MS系统获得肽段分子量,再通过串联MS技术,得到部分序列信息,最后通过计算机联网查询、鉴定。 2019/10/24

根据蛋白质带电性及疏水性不同，用MS分离多肽复合物。 多维色谱技术（LC/LC-MS/MS） 根据蛋白质带电性及疏水性不同，用MS分离多肽复合物。 多维蛋白质鉴定技术 (multidimensional protein identification technology) 2019/10/24

生物信息学是蛋白质组学研究的一个不可缺少的部分。 （四）蛋白质组学研究的生物信息学 生物信息学是蛋白质组学研究的一个不可缺少的部分。 构建和分析双向凝胶电泳图谱 数据库的搜索与构建 2019/10/24

蛋白质组数据库 SWISS-PROT: http://www.expasy.ch/sprot/ 拥有目前世界上最大、种类最多的蛋白质组数据库。 NRDB:http://www.nrdb.co.uk/ dbEST:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ NCBI:http://www.ncbi.nih.gov/Genomes/ EMBL:http://www.embl.org/  Prosite：http://www.expasy.org/prosite/ PDB：http://www.rcsb.org/pdb/ 目前应用最普遍数据库 2019/10/24

二、蛋白质功能模式的研究方法 DRLEFIVTALLKPW primary structure – amino acid sequence N-terminus C-terminus secondary structure – local spatial arrangement a-helix b-sheet tertiary structure – protein folding quaternary structure – multimeric complexes 2019/10/24

结构蛋白质组学（Structural Proteomics） 2019/10/24

（一）蛋白质翻译后修饰的研究 糖基化、乙酰化、甲基化、羧基化 二硫键配对、焦谷氨酸化 蛋白质降解······ 2019/10/24

生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用 （二）蛋白质相互作用研究技术 生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用 新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作用实现 细胞信号转导及病原体感染和免疫反应 2019/10/24

（yeast two-hybrid system） 1.酵母双杂交系统 （yeast two-hybrid system） 1989年Field 和Song等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质相互作用的方法。 真核细胞转录激活因子(GAL4)的结构和活性特点为基础的。 N端含NLS和与酵母GAL1基因启动子上游激活序列(UASG)结合的结构域。 C端含GAL1转录激活结构域 2019/10/24

系统构建 分别构建含GAL4 BD 和AD 的两个酵母融合蛋白表达载体； 建立含特殊基因型、适用于双杂交体分析的酵母菌株。 2019/10/24

酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid） 2019/10/24

主要特点和优势 使蛋白质表现型和基因型相联系 筛选cDNA文库 真实反应体内蛋白质间相互作用情况 不需分离靶蛋白 敏感性高 2019/10/24

缺点 假阳性 假阴性 限于核内表达蛋白质 的相互作用 2019/10/24

2.生物传感器耦联质谱技术 Biacore基于表面等离子共振（SPR）进行生物大分子相互作用分析(BIA) 质谱（MALDI-TOF-MS或LC-ESI-MS/MS）鉴定Biacore芯片上配体所捕获的生物分子 2019/10/24

一个单抗与另一个单抗相比较 哪一个的结合能力更强? Biacore技术提供的数据 特异性 动力学 亲和力 浓度 有没有结合？ 结合的速度 有多快？ 结合的能力 有多强？ 结合的量有多少？ 抗体与抗原能结合 吗? 红色区域有很多其他技术也可以做到，但是用Biacore更加准确，举例与ELISA相比，假阴性比ELISA低，蓝色区域是Biacore的特色，实时观测，测定动力学，从而计算亲和力。下一张幻灯会介绍亲和力和动力学的区别。 Biacore’s 所提供的SPR 技术产生的数据回答了以下的问题： 两种分子结合的特异性 两种分子结合得有多快？ 两种分子结合以后形成的复合物有多稳定？ 在混合物中任意一种分子实际的结合量 这些问题的答案都是当我们需更深刻地了解生物系统时必须得到的。 在研究新药开发时，会自然而然的想到药物与受体结合得越快，结合以后维持的时间越长，则该药物的疗效会越好。Biacore技术具备提供精确计算这些结合的快慢和结合稳定性的能力，这些数据将极大的提高科学研究者对选择那些分子继续研究做出正确的判断的能力。 一个单抗与另一个单抗相比较 哪一个的结合能力更强? 有生物活性的蛋白 质浓度是多少? 2019/10/24

表面等离子共振技术检测原理 高折射率介质: 低折射率介质 62 SPR occurs under conditions of total internal reflection of plane-polarized light at an interface between two media of different refractive index, coated with an electrically conducting film. An evanescent wave created by total internal reflection interacts with free electron clouds in the metal causing a drop in the intensity of the reflected light. The angle (resonance angle) at which this reflectance minimum occurs is sensitive to the refractive index near the metal surface on the side of the interface opposite the incident and reflected light. In Biacore, the light source is a high efficiency light-emitting diode (LED) with a wavelength near the infrared region. A wedge of light is directed towards the sensor surface covering a range of incident angles, and the reflected light intensity is monitored with a two dimensional diode array detector. The media are the glass of the sensor chip (high RI) and the sample (low RI). The conducting film is a thin gold layer on the surface of the chip. In the illustration, position I shows the resonance angle with buffer in the flow cell. The upper inset is a plot of reflected light intensity as a function of incident (or reflected) light angle – the position of minimum intensity is the resonance angle. When material binds to the surface, the refractive index increases and the resonance angle moves to position II. The angle is monitored continuously as the SPR signal, and a plot of the signal against time (lower inset, called a sensorgram) shows the changes in refractive index as material binds to and dissociates from the surface. The next two slides give a more technical explanation of SPR. 入射光 全内反射 (TIR) TIR临界角 高折射率介质: 渐消失区域 金膜 低折射率介质 2019/10/24 62

Biacore应用领域包含癌症研究、信号传递、多分子复合物的结构和组装、分子识别、免疫调节、免疫测定、药物开发、疫苗开发、瞬时结合检测，药物免疫原性检测。 The objective of this lecture is to give the course participants a basic knowledge of Biacore assay development and give them the confidence to start working with their own molecules and to make it easier for them to develop and control their own assays. 2019/10/24 63

（三）蛋白质芯片 构建蛋白质表达谱； 抗原-抗体筛选； 药物靶点筛选； 蛋白质-蛋白质交互作用筛选。 疾病诊断和预警 2019/10/24

蛋白质芯片的类型 Antibody Array Antigen Array Ligand Array 2019/10/24

2019/10/24

谢谢！ 2019/10/24