生物系统中目标蛋白分子的分析与鉴定.

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1 生物系统中目标蛋白分子的分析与鉴定

2 生物系统中目标蛋白分子的分析与鉴定 三个关键问题: 目标蛋白分子病理条件下的序列变化（测序）
避免目标蛋白分子的技术性降解（-70C条件下保存，实验操作通常在冰浴下进行，与此同时要加全蛋白酶抑制剂） 结合实验目的，选择合适的分析方法（定性与定量，相对定量与绝对定量）

3 生物系统中总蛋白质的定量 凯式（Kjedahl）定氮法 光吸收法 双缩脲法 福林-酚法 考马氏亮兰G-250法 氨基酸分析法 BCA法

4 计算公式：蛋白质量=含氮量/16%=6.25×含氮量。 实验步骤如下：
凯式（Kjedahl）定氮法 最早的经典方法。 各种蛋白质的含氮量相对恒定，14％~16％。 计算公式：蛋白质量=含氮量/16%=6.25×含氮量。 实验步骤如下： 注意事项: 本法非常灵敏，务必避免外界氨的干扰。 一定量蛋白质 硫酸铵溶液 氨气 蛋白质含氮量 蛋白质含量 (NH4)3BO3 浓硫酸 NaOH 蒸馏 H3BO3 HCl, 滴定 指示剂

5 光吸收法 因为芳香族氨基酸Tryptophan和Tyrosine的存在，使得Proteins溶液在280nm呈现特征性吸收峰。以此来定量溶液中的Proteins。 一个经验公式：当Proteins溶液A280=1时， 溶液中Proteins的浓度=1mg/ml。 各种Protein所含芳香族Amino acid的含量是不同的，有时会有较大差异，因此光吸收法是一种较粗略的蛋白质定量方法。 有时Proteins样品中有Nucleic acids存在， Nucleic acids也有紫外吸收，因此会对Proteins的测定产生干扰。这时采取分别测定280nm和260nm光吸收值，并以下式计算。 蛋白质浓度（mg/ml）＝1.45A280－0.74A260。

6 光吸收法 (continue) 最准确的办法是，首先得到Target Protein在280nm的吸光系数，其次针对性地测定该Target Protein溶液的280nm吸光度值，最后再利用公式计算溶液中Target Protein的浓度（C=A280/L, L：比色杯内径cm ）。 测定Target Protein在280nm的吸光系数，必须首先得到干燥的该Target Protein纯品。在105ºC下恒重后，精确称量1~10mg，再定量溶于一定体积的蒸馏水中，通常浓度为1mg/ml，测定溶液280nm光吸收，计算得到吸光系数。

7 双缩脲法 基于蛋白质链肽键“－CO－NH－”有双缩脲反应特性即，Proteins在碱性溶液中与Cu2＋发生络合反应显蓝色。 受Proteins特异性影响较小。 适用于较大量Proteins（mg）的定量测定。 实验操作简便。

8 福林-酚法 灵敏度和准确度均较高。 实验操作较繁琐。 影响因素较多，如去垢剂等。

9 考马氏亮兰G-250法 实验操作简便。 适合于定量10~100g 的Proteins。 应用广泛。 测定Proteins的考马氏亮兰G-250溶液也叫作“home-made”试剂。

10 氨基酸分析法 通过把Proteins水解成Amino acid，然后再对Amino acid进行分析来定量Proteins。 很准确，最接近于真实值。 测定值比实际量有时会偏低。主要原因是Protein水解时，Trp被完全破坏，Cys也要遭受很大损失，Ser和Thr的回收也只有90％。 一种新的测定蛋白质的方法：BCA法

11 BCA法 一种新的测定Proteins的方法 灵敏度和重复性均佳。 干扰因素少。 试剂公司（Pierce）有试剂盒供应。

12 生物系统中某种Target Protein的定量
ELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Array） Western blotting Enzyme activity 测定

13 ELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Array）
夹心法（sandwich method） Antibody-2 Antigen Antibody-1

14 讨论题一： 某实验室欲建立一种双抗体夹心法，以检测人血清中蛋白A的含量。以往该实验室曾自己制备了一兔抗人蛋白A多克隆抗体，并从某公司购买了一鼠抗人蛋白A单克隆抗体。该实验室按如下方案进行预实验，结果失败了。请分析最可能的原因是……。 Antigen，人蛋白A monoclonal Antibody Polyclonal antibody

15 讨论题二： 上述实验室不甘心失败，仔细分析后找到了失败的原因。为了达到实验目的，他们调整实验方案如下，进行预实验，结果又失败了。请分析最可能的原因是……。 Antigen，人蛋白A Polyclonal antibody Monoclonal Antibody

16 讨论题三： ……………………………………………..。 ………… 讨论题X：

17 细胞培养上清液中MMP-9和MMP-2活性的检测结果
kD 212 170 116 76 53 600 ﹣ 500 ﹣ 400 ﹣ 300 ﹣ 200 ﹣ 100 ﹣ 542.6 25.0 250 ﹣ 150 ﹣ 50 ﹣ 251.4 3.8 0.0 100.0 相 对 密 度 单 位 M. 蛋白marker 1. 培养液空白对照，2. 食管癌细胞SHEEC对照 3. 有义促进NGAL基因表达的食管癌细胞SHHEC 4. 反义封闭NGAL基因表达的食管癌细胞SHHEC 细胞培养上清液中MMP-9和MMP-2活性的检测结果

18 Target Protein的鉴定 Protein测序：1）N-end测序，2）C-end测序，3）质谱测序。 pI测定 HPLC分析。 SDS-PAGE电泳分析。 CE分析。 肽谱分析（Fingerprinting）。 MALDI-TOF-MS。

19 Target Protein的鉴定 巯基的鉴定。 糖基修饰的鉴定。 磷酸基修饰的鉴定。 甲基修饰的鉴定。 酰基修饰的鉴定。 酰胺基的鉴定。 X-ray衍射分析Target Protein晶体结构。