2 色層分析法 Chromatography 2.1 色層分析原理 Basic principles 極性不同的分子在兩相中有不同的分佈比例 2.2 膠体過濾法 Gel filtration 依樣本分子量之差異來做分離純化 2.3 離子交換法 Ion exchange 利用樣本分子的表面帶電性質差異來進行分離 2.4 親和層析法 Affinity chromatography 利用分子間的親和性大小不同來進行分離 2.5 HPLC 及 FPLC 改善介質的材質及吸附容量可增加速度及解析力 說明文字

■ 層析法演進 Historical review Martin & Synge (1952) 2 ■ 層析法演進 Historical review Paper partition chromatography (PPC) Column Round filter paper Thin layer (TLC) sample Development sample 說明文字 Larger capacity Sample capacity increased Long rectangle paper Adapted from Scope RK (1987) Protein Purification – Principles and Practice p.9

Like Dissolves 極性相似的兩分子間，其親和力較強。 Polar → Polar Non-polar → Non-polar 3 ■ 色層分析法的基本機制 Essential mechanism lp +d -d Like Dissolves 永 久 的 偶 極 性 O 極性相似的兩分子間，其親和力較強。 Polar → Polar Non-polar → Non-polar 近朱者赤、近墨者黑，物以類聚，不論人類或是分子皆同：   若要分類自然界中的所有分子，可以大略分成 極性 及 非極性 兩大類。 極性分子上的電子分佈不均勻，常常造成分子上某些部份的電子密度較大，因而產生偶極性，偶極會有暫時性的正負電荷產生；因此兩個極性分子相遇，可利用其偶極性的正負電荷互相吸引，會有較大的親和力。 反之，非極性的分子上，其電子密度分佈較為均勻，因此不會有偶極產生，事實上非極性分子上不會帶有電荷。非極性的分子，比較喜歡與非極性的分子接近，可以看作因為無法與極性分子接近，被極性分子排斥所造成的非極性間的相互吸引力量。也可以說是分子上電子的短暫分配不均，所形成的 凡得瓦爾 吸引力。 為何極性分子上的電子密度分佈會較不均勻？ 若分子內的任何兩個原子之間，其間的 陰電性 相差太大，例如氫 (陰電性 2.1) 與氧 (3.5)，則氫原子上的電子會被氧原子所吸引，使得氫氧附近的電子分佈不均勻。反之，碳 (2.5) 與氫 (2.1) 之間的陰電性相差較小，因此飽和碳氫化合物都是屬於極性較小的分子。 陰電性是描述一個原子搶電子的能力，陰電性大者容易搶奪其相鄰原子的電子。這是與其原子構造有關，在週期表右方的原子，因為其原子核內的質子數越來越多，正電荷較大，因此吸引電子的能力也較大。因此，分子的化學性質，幾乎都可用電子的爭奪來解釋；而分子或基團的極性大小，也可解釋大半的生物化學現象。

2.1 色層分析法原理 Principle of chromatography 4 2.1 色層分析法原理 Principle of chromatography Two-phase A B C Sample Sample Non- polar Polar 每次分離樣本 都要做一次選擇 S Non- Polar One Plate of Separation Polar L L L Theoretical plate number 流動相 Mobile phase 固定相 Stationary phase 圖 3.1 色層分析方法的基本原理圖解： ADSORPTION PARTITION 樣本分子依其分子極性 選擇親和兩相之一 Liquid - Solid Liquid - Liquid Two-phase separation system 圖 2.1

■ 層析法的板數概念 One separation, one plate 5 ■ 層析法的板數概念 One separation, one plate 100A + 100B One plate B A 64 16 1 9 51 13 1 80 20 10 90 16 4 9 81 3 1 8 73 A B Polar 說明文字 A B Non- polar

■ 常用層析法 Common chromatographic methods Partition Adsorption 6 ■ 常用層析法 Common chromatographic methods Partition Adsorption 小分子 Paper partition chromatography (PPC) Thin-layer chromatography (TLC) a) Gas chromatography (GC) b) Reverse phase Ion exchange TLC a) GC b) 大分子 Gel filtration Affinity chromatography Hydrophobic interaction Hydroxyapatite 2.2 2.3 2.4 2.4.4 2.3.2 表 3.1  各種大小分子的色析法應用： a, b) 這兩種層析法均可進行 partition 或 adsorption，取決於所用展開液的成分與比例 表 2.1

■ 薄層層析法操作 Thin-layer chromatography 7 ■ 薄層層析法操作 Thin-layer chromatography Thin-layer plate (Adsorption) Activated Not-activated (Partition) 說明文字 Add developer Developing Sample spotting

2.2.5 問題及解決 Problem and solution 8 2.2 膠体過濾法 Gel filtration 2.2.1 原理概述 Basic principles 是一種 partition 層析法 2.2.2 膠体介質 Gel materials 是一種長鏈的大分子糖類聚合物 2.2.3 膠体管柱 Gel and column 管柱性質、影響因素及管柱系統 2.2.4 管柱操作 Column operation 裝填並操作一支膠体過濾管柱 2.2.5 問題及解決 Problem and solution 常見的錯誤要預先避免 說明文字

Sample ■ 膠体過濾法是一種 Partition 層析法 Stokes radius Larger molecules 9 ■ 膠体過濾法是一種 Partition 層析法 Stokes radius Molecular size and shape Small molecules Sample Mobile phase (liquid) Stationary phase (liquid) Smaller molecules are retarded 圖 3.2 膠体過濾法的原理： Larger molecules Elute out faster Gel filtration is a partition type chromatography (liquid-liquid) 圖 2.2

Pharmacia Bio-Rad ■ 各 種 色 析 膠 体 Sephadex Sepharose Sephacryl Sephacel 10 ■ 各 種 色 析 膠 体 Pharmacia Sephadex Sepharose Sephacryl Sephacel glucose (dextrose) agarose glucose + acrylamide cellulose Superose, Superdex Mono Q, Mono S FPLC Fast Performance Liquid Chromatography Bio-Rad 說明文字 BioGel P BioGel A acrylamide agarose Gel material is a polymer of carbohydrate or acrylamide

Pharmacia (1991) Gil Filtration – Principles and Methods p.35 11 ■ 膠 体 的 構 成 Space for filtration Pharmacia (1991) Gil Filtration – Principles and Methods p.35 glucose unit 說明文字 Sephadex Sephadex is the polymer of glucose with chemical cross-linking

■ 膠体的使用範圍 Sephadex G ● MW ranged from ten to several hundred thousands 12 ■ 膠体的使用範圍 Sephadex G ● MW ranged from ten to several hundred thousands G-200 could be smashed flat easily (its backbone support is too weak) G-50 G-25 G-10 From powder to gel form 1 g → 20 mL gel 1 g → 7.5 mL 說明文字 Small proteins Pharmacia (1991) Gil Filtration – Principles and Methods p.37

Sephacryl ■ 膠 体 的 構 成 Acrylamide Cross-linking Larger space, 13 ■ 膠 体 的 構 成 Larger space, Stronger support for backbone Acrylamide Cross-linking Pharmacia (1991) Gil Filtration – Principles and Methods p.22 說明文字 Sephacryl

洋菜、寒天、瓊脂 ■ 洋菜膠体的成膠反應 Agar gel formation Even stronger backbone 14 ■ 洋菜膠体的成膠反應 Agar gel formation Even stronger backbone Much larger space 說明文字 洋菜、寒天、瓊脂 Pharmacia (1991) Gil Filtration – Principles and Methods p.38, 39

Pharmacia (1991) Gil Filtration – Principles and Methods p.40 15 ■ 膠体的使用範圍 Sepharose ● MW ranged from ten thousands to several millions Cross-linking Sepharose is rigid 6% gel 2% gel 說明文字 Sephadex Large proteins Sephacry Pharmacia (1991) Gil Filtration – Principles and Methods p.40

■ 膠体過濾法的膠球 Gel filtration beads 16 ■ 膠体過濾法的膠球 Gel filtration beads 說明文字

■ 管柱內膠体的組成區隔 Spaces in a column 17 ■ 管柱內膠体的組成區隔 Spaces in a column Vt Vo Vt - Vo (total volume) (void volume) 膠 体 外 積 膠 体 內 積 管 柱 總 体 積 h 說明文字 Mobile phase (L) Stationary phase (L) 底面積 Adapted from Pharmacia (1991) Gil Filtration – Principles and Methods p.11

A ■ 膠体過濾的溶離圖譜 A typical chromatogram Elution Volume (mL) Y X E Z Vo Ve 18 ■ 膠体過濾的溶離圖譜 A typical chromatogram A 目標酵素 (E) 最好不要落在 主要蛋白質峰 (Y) 的範圍內 Y Vt 之後不 應有物質 溶離出來 Blue Dextran X Ve E Vo Vo 之前不應有 物質溶離出來 Vit. B12 Z Enzyme activity Vt 圖 3.4  膠体過濾法的典型溶離圖譜： Elution Volume (mL) 圖 2.4

■ 介 質 的 粗 細 影 響 解 析 力 Relative amount Poor separation Peak flattened 19 ■ 介 質 的 粗 細 影 響 解 析 力 50 100 Poor separation Peak flattened Corse 50 100 Fine Relative amount 50 100 Best separation Superfine Adapted from Pharmacia: Gil Filtration – Principles and Methods 介質粒子越細，色析法的解析力就越佳，但流動相的流速也就越慢。 介質粒子的大小，好像電視銀幕的解析度，粒子越小，解析力越好。粒子小可以降低粒子之間的空間，這些空間太大是降低解析力的原因之一 (見下圖)。 但因為粒子塞滿了所有空間，使得溶離液流過的速度變慢；流速太慢反而會導致解析力變差。 0.5 1.0 1.5 Ve/Vt Bead size is critical to the resolution of gel chromatography

■ 溶離液擴散進出膠球 Diffuse in and out bead 20 ■ 溶離液擴散進出膠球 Diffuse in and out bead 溶離液或樣本分子，由膠体粒子外圍均勻向內或向外擴散。 Sample or buffer is diffusing in and then out of the gel particle 圖 3.3  溶離液是以擴散方式進出膠体： Diffusion Dispersion 擴散 瀰散 圖 2.3A

■ 溶離液對膠球的擴散或瀰散 Two types of gel 21 ■ 溶離液對膠球的擴散或瀰散 Two types of gel 若膠体粒子較大，則由外圍擴散 到內部的距離長，通過粒子所需 要的時間拉長，降低分離效果。 Dispersion (瀰散) 方式的膠体 因通透性佳，溶離液可直接流 入膠体，不再靠擴散作用。 圖 3.3  瀰散式膠体有較好的通透性： Small particle size reduces the diffusion time and enhances its resolution Dispersion type gels let the sample molecules flow directly through the gel body, and have better resolution 圖 2.3B

■ 粒子粗細影響溶離液流動 Bead size vs flow rate 22 ■ 粒子粗細影響溶離液流動 Bead size vs flow rate 膠体的顆粒越小 其解析力越大 但流速變慢 上圖誇張管柱內粒子的大小，以說明對解析力或流速的影響。 粒子之間的空間，是造成解析力不好的原因之一；將粒子變小，可降低此空間，也因此可增加解析力。 Smaller particles reduce the space between the beads, and prevent the turbulence as the buffer flows, but the flow rate might be retarded Adapted from Scope RK (1987) Protein Purification – Principles and Practice p.192

■ 不 同 介 質 的 運 用 選 擇 Elution volume Absorbance (10~1,500 kDa) 23 (10~1,500 kDa) ■ 不 同 介 質 的 運 用 選 擇 Sephacryl S-300 50 100 高分子量 分離較好 色帶較慢 溶離出來 Absorbance (5~250 kDa) Sephacryl S-200 50 100 低分子量 分離較好 色帶較快 溶離出來 Adapted from Pharmacia: Gil Filtration – Principles and Methods 若解析力差不多，儘快讓你要的蛋白質早點出來： 通常你都可以選擇多種膠体，但經常都是優劣互見。但若無特別考量，請選擇可讓你的蛋白質早一點流出來的膠体介質。當你要分別純化上圖紅色或青色兩個色帶時，你的選擇如何？實際去試試看，可能是最簡便的方法。 Elution volume Choose the gel which brings your target protein out of the column earlier

■ 樣本体積的影響 Sample volume at 1% of Vt 24 ■ 樣本体積的影響 Sample volume at 1% of Vt 1 2 3 4 5 0.5 1.0 1.5 Resolution ● Sample volume at 1~2% of total gel volume R = a (b+c)/2 a b c a Superdex 200 Transferrin (81 kD) & IgG (160 kD) b c 說明文字 a 越大分離越開 b, c 越小越好 R = 1 表示剛好分開 Sample volume (% of Vt) Adapted from Pharmacia (1991) Gil Filtration – Principles and Methods p.46

■ 膠 体 管 柱 的 最 佳 化 調 整 A B C Concentration A B C AB C Elution time (h) 25 ■ 膠 体 管 柱 的 最 佳 化 調 整 標準分離條件 都可分得很好 A B C Bed height (cm) 85 管柱 長度 Flow rate (mL/cm2/h) Concentration 2 溶離 速度 85 25 0 10 20 30 Increase flow rate 若加快流速 時間省十倍 解析力下降 A B C Adapted from Pharmacia (1991) Gil Filtration – Principles and Methods p.59 20 25 Reduce column height AB C 流速已加快 再縮短管柱 時間再縮短 效果則更差 但 C 沒問題 說明文字 Elution time (h) 0 1 2 3

■ 色 析 管 柱 的 形 狀 300 cm3 矮胖型 細長型 ● 矮胖型管柱不能容忍分離不佳 但其流速及容量均較大 30 cm2 26 ■ 色 析 管 柱 的 形 狀 30 cm2 10 cm2 300 cm3 10 cm 30 cm 矮胖型 Short and fat 細長型 Long and slim 色帶有點歪斜 就會影響分離 色帶有點歪斜 但不影響結果 ● 矮胖型管柱不能容忍分離不佳 Fat column cannot tolerate poor separation 但其流速及容量均較大 But it has better flow rate and higher capacity 說明文字 Adapted from Scope RK (1987) Protein Purification – Principles and Practice p.195

■ 液 相 層 析 管 柱 系 統 梯度製造器 幫浦 記錄器 緩衝液 管柱 膠体 監視器 分劃收集器 27 Gradient mixer (2) 轉接器 Connector 幫浦 Pump (1) adapter 記錄器 Recorder 緩衝液 Buffer (3) (4) 管柱 Column 膠体 Gel 監視器 Monitor (5) 分劃收集器 Fraction collector reservoir Buffer starts here 膠 体 裝 填 圖 3.5  液相層析管柱系統： The whole family of liquid chromatography apparatus 圖 2.5

■ 膠柱裝填方法 Packing column step by step 28 ■ 膠柱裝填方法 Packing column step by step 清洗膠体 Wash gel well Put on reservoir D Put on adaptor C 上清 Supernatant E 預估体積 Estimate gel volume 檢查管柱 是否暢通 裝填膠体 Pouring gel smoothly A 沈積中 In progressing Check flow rate of empty column Gel 緊 密 堆 積 已堆積 Sedimentation 靜置膠体 Gel stands o/n 溫度平衡 Temperature equilibrated 緩衝液 平衡 Equilibrated in buffer 多練習膠柱的裝填，並注意所有預先設定的條件。 預先算準所需要的膠体，好好平衡在指定的緩衝液，並且把該膠体及管柱，事先保存在操作的溫度下；這樣的預備工作，幾乎已經成功一半了。 加壓流洗 Elute under High pressure Gel 暫停流洗 Stop elution 繼續流洗 Keep eluting 1 2 X B Pack gel tightly 圖 2.6

■ 色析膠体的裝填 Packing column 29 ■ 色析膠体的裝填 Packing column Pharmacia (1991) Gil Filtration – Principles and Methods 說明文字 一口氣倒入膠体，勿陷入氣泡。 Pour gel slurry smoothly (non-stop), avoid trapping any bubble

■ General principle for column chromatography 30 ■ General principle for column chromatography Gel selection Bead size Column size Flow rate Sample volume Column shape Pack tightly Let target protein eluted out the column earlier Finer bead has better resolution, but slower flow Use larger column size yet consider practical need Slim column for gel filtration, fat column for others Pack the gel tightly for better resolution Fast flow reduces resolution, slow brings diffusion 實驗之前請仔細檢討並且把握住這些條件。 雖然理論的文字論述不能替代實際操作，但若能在操作之前後都有以上的考慮，則將會使成功機率大增。 其中，膠体『緊密裝填』可能是最重要的考慮因素。 Apply 1% of the total gel volume for sample