第三章 高效液相色谱分析法 HPLC §2-1 高效液相色谱法的特点 （High Pertormance Liquid Chromatography，） §2-1 高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法： 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）

一、HPLC与GC差别 1．分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较 低的样品；但对高沸点、挥发性差、 热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的20% HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括 有机介质溶液），不受样品挥发性和 热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%

2．流动相差别的区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。 3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）

二、高效液相色谱仪流程图 1．贮液罐（滤棒，可滤 去颗粒状物质） 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置

三、HPLC的特点和实际应用 1、利用其高柱效（n=104片/米），有效分离极复杂 体系中的痕量组分。 正相色谱分离有机溶剂中的物质 反相色谱分离水溶液中的物质----生化物质。 2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对 色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨 基酸、常见阴阳离子等） 3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分 离高分子化合物。 4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化 合物。

§2-2 基本理论和条件选择 基础 理论 热力学理论：塔板理论——平衡理论 动力学理论：速率理论——Vander方程 一、塔板理论

二、速率理论（与GC对比） 1.

2. 讨论： 1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比） 2）涡流扩散项及其影响

3）传质阻抗项及其影响

三、 影响分离的因素 1．

四、HPLC法中分离条件的选择 1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （dp≤10μm） 首选化学键合相，匀浆法装柱 2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇， 约1ml/min 3. 柱温的选择： 选室温250C左右

§2-3 各类高效液相色谱法简介 一、液固吸附色谱法（LSC） (liquid-solid adsorption chromatography) 二、液液分配色谱法（LLC） (liquid-liquid partition chromatography, chemical bonded phase chromatography 三、离子色谱法（IC） （ion-exchange chromatography and ion pair chromatography) 四、空间排阻色谱法（SEC） （ steric exclusion chromatography

一、液固吸附色谱法（LSC） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂 1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异 分离前提：K不等或k不等

2．固定相：与LC比，固定相粒径不同（<10μm） （1）硅胶 表孔硅胶（薄壳硅胶） 全多孔硅胶 无定形 YWG 5~6μm 5×104 球形 YQG 3~4μm 8×108 堆积硅珠 YQG 3~4 μm 8×108 理想 原理：吸附 特点：峰易拖尾 适用：分离极性化合物 （2）高分子多孔小球：YSG 原理：吸附+分配 蒹小孔凝胶作用 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物

3．流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂 例： 正己烷或庚烷 + 氯仿- - - 4．影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑ 溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓， tR↓ 注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间 5．出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱 6．硅胶吸水量↑，LSC→LLC 硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大 硅胶含水量>17% 分配色谱 硅胶失活→载体 吸附的水→固定液

二、液液分配色谱法（LLC） 1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异 2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液——极性→NLLC 固定液——非极性→RLLC 3．正相色谱——固定液极性 > 流动相极性（NLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分 反相色谱——固定液极性 < 流动相极性（RLLC） 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分

4、化学键合固定相 （一）常规化学键合相 利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面 1．分离机制：分配 + 吸附（以LLC为基础） 2．特点： 不易流失 热稳定性好 化学性能好 载样量大 适于梯度洗脱

（二）反相键合相固定相 1．分离机制：疏溶剂理论 正相——流动相与溶质排斥力强， 作用时间↑ ， k↑，组分tR↑ 反相——流动相与溶质排斥力弱， 作用时间↓， k↓，组分tR↓ 2．固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC约80%问题） 3．流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水 流动相极性 > 固定相极性 底剂 + 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇，乙腈，THF

（三）正相键合相色谱 4．流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑ 5．出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱 6．适用：非极性~中等极性组分（HPLC80%问题） （三）正相键合相色谱 1．分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、 诱导力、或氢键作用力 2．固定相：极性大的氰基或氨基键合相 3．流动相：极性小（同LSC） 底剂 + 有机极性调节剂 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇

4．流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ 5．出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先 出柱极性大的组分后出柱 6．适用： 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小） 分离物质也相似 氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等

三、离子色谱法（IC） 1．反相离子对色谱法（IPC或PIC） 1）离子对试剂：烷基磺酸钠→分析碱 四丁基季胺盐→分析酸 2）影响k的因素 反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分 与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离 1）离子对试剂：烷基磺酸钠→分析碱 四丁基季胺盐→分析酸 2）影响k的因素 a．与m的极性有关（同反相色谱） b．与R的链长有关：R↑长，极性↓小，tR↑，k↑ 3）适用：较强的有机酸、碱

2）k的影响因素：与流动相极性有关，还与pH值有关 选择流动相：应同时考虑极性及pH值 酸性物质——加入酸HAc tR↑，k↑ 2．反相离子抑制色谱 在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制 组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的 1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质 pH一定的缓冲溶液 2）k的影响因素：与流动相极性有关，还与pH值有关 选择流动相：应同时考虑极性及pH值 酸性物质——加入酸HAc tR↑，k↑ 碱性物质——加入碱NH3·H2O tR↑，k↑ 调节pH范围：3.0~8.0 pH>8.0 破坏键合相与载体的结合 pH<3.0 腐蚀柱子 3）适用：极弱酸碱物质 pH=3~7弱酸；pH=7~8弱碱；两性化合物

2．对流动相的要求： 1）与固定液不反应 2）对样品有良好溶解度 k=1~10 k=2~5 最理想的 3）与检测器匹配： UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长） 荧光，电化学 4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈） 使用前过滤、脱气

3．洗脱方式 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似GC的等温度洗脱 2）梯度洗脱： 在一定分析周期内不断变换流动相的种类 和比例 即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分 类似GC的程序升温（沸程较长样品）

§2-4 高效液相色谱仪 1．泵： 恒压泵：流量精度不稳 恒流泵：常用 2．进样装置 1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室） GC系统压力较小，可以 HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期） 2）阀进样：不必停泵，六通阀

液相色谱

3．色谱柱：直径4~6mm,柱长10~30cm 柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子） 柱再生：维护、保养、柱子的冲洗 4．检测器 1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质 2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质 灵敏度高 3）示差折光检测器：利用折光率的差别 灵敏度低，温度要求严格 4）电化学检测器 5）化学发光