实验十 ＤＮＡ片段从琼脂糖凝胶 中的分离 DNA fragment recovery from the agrose gel.

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1 实验十 ＤＮＡ片段从琼脂糖凝胶 中的分离 DNA fragment recovery from the agrose gel

2 一．实验目的及背景  在生物技术实验中，ＰＣＲ反应获得的目的 片段，酶切后所得特定的ＤＮＡ序列， 分子 杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电 泳后，目的片段与其它ＤＮＡ分开， 这就需 要有一套方法将目的ＤＮＡ从凝胶中分离出 来，通过处理后得到纯化的目的ＤＮＡ， 以 用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析 等.

3 从凝胶中分离回收ＤＮＡ的方法 现在常用的技术有：  电洗脱法  低熔点琼脂糖凝胶法  ＤＥＡＥ滤膜插片法等  其中电洗脱法，经济节省，操作方便， 对Ｄ ＮＡ的回收效果好。

4 低熔点琼脂糖凝胶法  65 o C 琼脂糖凝胶熔点 低熔点琼脂糖凝胶 37 o C 液体

5 ＤＥＡＥ滤膜插片法  High efficient  DNA high quality for microinjection  <5kb fragment  100ng DNA fragment  10mmol/L EDTA(pH8.0) 5 minutes  0.5 mol/L NaOH 5 minutes  低盐缓冲液 50mM/LTris.Cl 0.15M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)  高盐缓冲液 50mM/LTris.Cl 1M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)

6 电洗脱法基本原理  将电泳分离后含目的ＤＮＡ片段的琼脂糖切 割下来， 装于透析袋中，继续在高电压下电 泳，这时目的ＤＮＡ会从凝胶中电泳出进入 透析袋中， 由于ＤＮＡ分子量大，不能透过 透析袋，从而保留于透析袋中。  取出透析袋中含ＤＮＡ的溶液， 进一步用酚、 氯仿抽提纯化。

7 二．实验试剂及仪器  NaHCO3 2%  EDTA-Na2 0.01M  TBE 电泳液 10.8g Tris 碱 0.93g EDTA 5.5g 硼酸 调 pH8.2 定容 1000ml 琼脂糖 透析袋 ＴＥ 酚 氯仿 乙醇

8 三、实验方法  一、透析袋的处理：  １．切取适当长度适析袋。  ２．在２％ NaHCO3 1mM EDTA 溶液中 煮沸１０分钟。  ３．弃去煮沸液，加无菌水内外反复洗净 透析袋。

9 二、电洗脱  １．在长波紫外灯下（３００－３６０ nm ）将含目标ＤＮ Ａ片段的凝胶条带切下装入透析袋中。  ２．向透析袋内加入２ ml 电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排 空汽泡。  ３．将透析袋水平放入电泳槽（长度方向与电泳平行）， 加 入适量缓冲液将透析袋浸没（约６－７ mm ）。  ４．接通电源，１５０伏电洗，在紫外灯下观察待ＤＮＡ全 部移出凝胶。  ５．改变电场方向继续通电１分钟。  ６．从透析袋中吸出缓冲液于１－５ ml Eppendorf 管中。

10  ７．加入１．５倍体积正丁醇，混匀抽提去Ｅ Ｂ。  ８．在台式离心机上最高速２分钟。  ９．吸去上层，正丁醇溶液。  １０．重复７，８，９二次。  １１．自下层言ＤＮＡ的溶液中加入等体积酚 氯仿（２个）抽提２次。  １２．上清转入另一 Eppendorf 管中加入 1/10 倍体积 3M NaAc ２倍体积预冷无水乙醇，于 ２０℃过夜。

11  １３． 12000g ， 4 ℃下离心１０分钟，得ＤＮＡ沉 淀。  １４．弃上清，加入７０％乙醇洗涤２次后弃干乙 醇。  １５．加入５０ μl ＴＥ溶解ＤＮＡ。  １６．取１０ μl ＤＮＡ溶液加入 2μl Loading buffer 于０．８％琼脂糖上， ４０伏电泳，３小时。  １７．在紫外透射仪上观察结果。  １８．测定ＤＮＡ溶液 OD260,OD280 值。

12 结果与分析  １．计算ＤＮＡ回收效率，判断ＤＮＡ纯 度。  ２．记录电泳结果  问题与讨论：  １．电洗脱过程后，为什么要反向电泳１ 分钟？  ２．电洗脱后的ＤＮＡ如何去除ＥＢ？

13 玻璃奶法快速纯化回收 DNA 片段 本方法有多种用途，主要包括：  从琼脂糖凝胶中分离纯化 DNA 片段；  从 DNA 反应物中纯化目的 DNA 片段，如回收纯化 PCR 产物、 酶切连接反应中的 DNA 片段；  从探针制备反应物中去除未标记上的核苷酸以及小的 DNA 片 段（比如引物）；  DNA 浓缩、去盐及去除杂质。  本试剂盒的主要成分 “ 基因纯 ” 试剂是无毒、无味、无腐蚀作 用的白色颗粒，能专一性结合 0.2kb 到 50kb 大小的 DNA （双 链或单链，线性、环状或超螺旋），不结合 RNA 、蛋白质、 寡聚核苷酸、有机溶剂、去污剂及其它可能抑制酶活性的有 机或无机物。

14 使用本法回收 DNA 片段有以下优点：  高纯度：回收的 DNA 片段基本上不含 RNA 、蛋白质 及其它有机分子，可直接用于酶切、连接、探针制 备、序列测定等；  简便：所需主要仪器是一架台式离心机；  快速：整个回收过程只需半个小时；  高效：回收得率达到 70% 以上；  多用途：可以同时作胶回收、 PCR 产物回收、 DNA 片段及探针的纯化浓缩等；  安全：不接触苯酚、氯仿等有害物质。

15 二、试剂盒组成  1 ．碘化钠溶液： 50ml  2 ． DNA 洗涤液（ 20 倍浓缩液）： 10ml  3 ． “ 基因纯 ” 试剂： 1ml  4 ．超纯水： 1ml  使用前，将 DNA 洗涤浓缩液（ 10ml ）倒入一 玻璃瓶中，加 140ml 无水乙醇及 50ml 蒸馏水 （由使用者自配），混匀后置于 -20 ℃冰箱中， 其余溶液置于 4 ℃冰箱。

16 三、操作步骤  从琼脂糖凝胶中分离纯化 DNA 片段  a. 常规 DNA 电泳。按常规方法用溴化乙锭（ EB ）染色 DNA ，而后将欲分离的 DNA 带从胶上切割下来，置于一 1.5ml 离心管中。  b. 称出凝胶带的重量，加入三倍量（ V/W ）的碘化钠溶 液。（如 0.1g 凝胶中加入 0.3ml 碘化钠溶液）。  c. 置于 55 ℃水浴 5-10 分钟，直至凝胶完全溶化。  d. 加入 20ul 充分混匀的 “ 基因纯 ” 试剂（建议使用前用漩涡 振荡器振荡 3 分钟），室温放置 5 分钟（期间不时将管子 颠倒几次以混匀）。

17  e. 离心 10 秒（ 10,000rpm ），倒去上清液。  f. 加 0.8ml 刚从冰箱中取出的 DNA 洗涤液，充分摇匀，离 心 10 秒，去上清。  g. 重复步骤 f 两次（共洗涤三次）。  h. 用吸水纸仔细将管壁上及管底残留的洗涤液吸干。  i. 加入 20ul 超纯水，混匀后置于 55 ℃水浴 5 分钟。  j. 离心 3 分钟，将上清液小心吸至另一个离心管，即为纯 化的 DNA 。可直接用于酶切、亚克隆、 PCR 、标记、探 针制备、序列测定、细胞转染等。

18 注意事项：  溴化乙锭染色后的 DNA 易受紫外光破坏，故尽量放 置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间 尽量短。  DNA 洗涤液应保持在低温，否则可能使 DNA 从 “ 基 因纯 ” 试剂上脱落而导致回收率降低。  步骤 h 是另一关键，管壁和管底残留的洗涤液若不 完全除去，可能导致 “ 基因纯 ” 试剂上结合的 DNA 无 法由蒸馏水洗脱。

19 PCR 反应物中纯化目的 DNA 片段  PCR 反应完毕后，加蒸馏水至 100ul （最后体 积）。  加入 300ul 碘化钠溶液，混匀。  以下步骤与 “ 从琼脂糖凝胶中分离纯化 DNA 片段 ” 中步骤 d 到 j 相同。

20 从探针制备反应中除去未标记上的核 苷酸及小的 DNA 片段  探针制备反应完毕后，加蒸馏水至 100ul （最后 体积）。  加入 300ul 碘化钠溶液，混匀。  以下步骤与 “ 从琼脂糖凝胶中分离纯化 DNA 片段 ” 中步骤 d 到 j 相同。

21 DNA 浓缩，去盐及去除杂质  加入 3 倍量的碘化钠溶液于样品 DNA 溶液中（若 DNA 为固态，则先将之溶于适量水或 TE 中，再加 3 倍体积的碘化钠溶液）。  加 20ul 或更多的 “ 基因纯 ” 试剂（每 ul 该试剂可吸附 0.3ugDNA ，操作者可根据这一指标自行决定 “ 基 因纯 ” 试剂的用量，但不应少于 10ul ）。  以下步骤与 “ 从琼脂糖凝胶中分离纯化 DNA 片段 ” 中步骤 d 到 j 相同。