海洋微生物與生物技術 — 生醫應用與其他 黃顯宗. 海洋微生物是豐富的生物醫學產品來源 （ biomedical products ） 許多有用的藥物來自細菌和真菌的二級代謝物 （ secondary metabolites ） 從自然界中尋找新要新藥 近 20 年這樣的海選回報不成比例 The effort.

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1 海洋微生物與生物技術 — 生醫應用與其他 黃顯宗

2 海洋微生物是豐富的生物醫學產品來源 （ biomedical products ） 許多有用的藥物來自細菌和真菌的二級代謝物 （ secondary metabolites ） 從自然界中尋找新要新藥 近 20 年這樣的海選回報不成比例 The effort necessary to Isolate valuable new compounds has become increasingly disproportionate to the returns 所以很多公司轉向已知產物的 structure-function 分析和 改良上 Table 14.4 從海洋細菌所生成的醫藥品

3 Table 14.4 藥品舉例 藥物生物來源功能活性 AbyssomicinVerucispora sp. 抗生素 AprotoxinsLyngbya spp. 干擾腫瘤細胞訊息與轉錄 BryostatinsCandidatus sp. 抑制 protein kinase C, 抗腫瘤等 Coibamide ALeptolyngbya sp. 使腫瘤細胞 apotosis CryptophycinsNostoc spp. 抑制腫瘤細胞的 tubulin 聚合 CuracinLyngbya majuscula 抑制腫瘤細胞的分裂 mitosis LargazoleSymploca sp. 抗腫瘤等 Psymberin 不能培養的 sponge 共生菌 細胞毒性 Salinosporamide ASalinospora sp. 抗腫瘤 Alzheimer’s disease 等

4 海洋生物致病能力 參考：海洋生醫 — 人類醫學發展的終極防線 Ref. 539

5 Fucoidans a complex series of sulfated polysaccharides found widely in the cell walls of brown macroalgae. display numerous physiological and biological properties, including anticoagulant, antiviral, antithrombotic （防凝血塊）, antitumor and antioxidant activities, as well as having an effect on the inflammatory and immune systems

6 微生物共生（ microbial symbionts ） 生成生物活性物質 一些軟體動物如 sponges 和 bryozoans （苔蘚蟲），為 了抵抗其他獵食者（ predators ）或抗病，衍生出化學抵 抗功能（ chemical defenses ） 從中分離出有用的藥物，如抗生素和抗腫瘤用藥 苔蘚蟲（ bryozoans ） Buguula neritina 生成 bryostatins ， 一種 cytotoxic macrolides ，用作治療白血病、食道癌 （ esophageal cancer ）等

7 微生物共生（ microbial symbionts ） 生成生物活性物質 分離培養、分析這些共生菌 數種和 sponge 共同生活的細菌，如 actinomycetes, vibrios 和真菌等，生成多種抗 細菌和抗腫瘤的物質 研究這些二級代謝物（ complex polyketide molecules ）生成過程中的酵素（ polyketide synthases ），基因 cloning Fig. 14.2 Metagenomics 策略， clone ，組合酵 素系列，合成

8 活性海洋微生物天然物的開發步驟 參考：海洋微生物天然物 ref 538

9 抗菌蛋白（ Antimicrobial peptides, AMPs ） 最早的研究是發現魚類本身在魚鱗體表會分泌 許多黏液，這些黏液具有殺菌的特性，抗菌蛋 白（ pleurocidin ） 無脊椎動物中的甲殼類如草蝦、白蝦等原有免 疫，分為體液性免疫及細胞性免疫 抗菌蛋白是屬於體液性免疫的一種，抗菌蛋白 在甲殼類中具有的特性可以直接破壞病原菌細 胞膜，並使其滲透壓不平衡

10 抗菌蛋白 抗菌蛋白依據其化學結構及生化特性可分 為下列幾種：線性螺旋抗菌蛋白、線性含 特定胺基酸抗菌蛋白、分子間含雙硫鍵的 抗菌蛋白 抗菌蛋白具有毒殺細菌、真菌、病毒之能 力 Cloning and developmental expression of a family of pleurocidin- like antimicrobial peptides from winter flounder,Pleuronectes americanus (Walbaum)Cloning and developmental expression of a family of pleurocidin- like antimicrobial peptides from winter flounder,Pleuronectes americanus (Walbaum)

11 細菌素 Bacteriocins 由細菌所生成的抑菌殺菌蛋白，可 用在水養養殖中 從海洋微生物中，確實可以分離到產生細菌素 的菌種 In total, 24 of 100 screened isolates showed antimicrobial activities and 7 of these exerted bacteriocin-like activities. Sequencing of 16S rRNA genes identified the isolates as members of the six genera Proteus, Providencia, Klebsiella, Alcaligenes, Bacillus 和 Enterococcus. Fifteen Bacillus licheniformis or pumilus isolates with antimicrobial activity

12 Marine microbes are a rich source for biomimetics, nanotechnology, and bioelectronics Biomimetics （仿生學） is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems 例如細菌表面的 S-layers ， ordered alignment of functional groups on the surface and in the pores, which allow chemical modifications and the binding of molecules in a very precise fashion ， 一種奈米科技

13 Marine microbes are a rich source for biomimetics, nanotechnology, and bioelectronics Magnetotactic bacteria 所形成的 magnetic crystals 整齊是目前工業做不到的 Bacteriorhodopsin from Halobacterium salinarum ， can store many gigabytes of information in 3-D films 基因改造會產生不同的 desirable properties 新發現 proteorhodopsins

14 微生物生物技術應用在水產養殖 （ aquaculture ） Table 14.5 衛生： Bioremediation for improvement of water quality 營養： immune stimulants as feed additives, Probiotics for growth promotion and disease prevention 診斷（ diagnosis of disease ）：發展快速方法

15 微生物生物技術應用在水產養殖 （ aquaculture ） Eliminating vertical transmission ：生產無病幼 苗，檢驗卵與精子 Antimicrobial treatment ：抗生素與合成抗菌物 質，敏感性測試 免疫 Vaccination ：各式疫苗 遺傳改良

16 抗藥性是養殖的大問題 養殖中大量使用抗生素等藥物 在環境中，如 sediments 中產生具有抗藥 性的菌株 有些可能會轉移到人類的致病菌或共生菌 中，如 Salmonella 、 E. coli 等

17 抗藥性是養殖的大問題 策略舉例機制 mechanism 修改 target binding site Penicillins 改變 penicillin-binding proteins Quinolones 改變 DNA gyrase 酵素分解 Penicillins 生成 Beta-lactamase 降低攝取和累積 tetracyclines 改變膜上 active efflux 蛋白質 繞過（ bypass ）代謝 Sulfonamides 超量生成作用基質 p- aminobenzoic acid

18 Probiotics, prebiotics 和 immunostimulants 廣泛應用於海產養殖 Probiotics 益生菌使用在飼料中，用於家禽與豬 的飼養 在魚類養殖，如鮭魚，飼料加入益生菌降低罹 病，增強抗病力 益生菌可分離自 Indigenous microbiota of the gut of marine fish 不參與 host immune system ，直接抑制病菌 機制，如產生抑菌物質、競爭營養、拓殖競爭

19 Probiotics, prebiotics 和 immunostimulants 廣泛應用於海產養殖 Probiotics vs prebiotics 益生菌的產物，如 LPS, glucans 等可增強宿主 的免疫性，有 immunostimulatory effects 可減少抗生素的使用 在體外試驗中，益生菌可抗致病菌，不保證實 地應用有同樣效果 此外，益生菌可能同時生產宿主有利的成分， 如維生素、抗氧化物質、脂肪、酵素等

20 Probiotics, prebiotics 和 immunostimulants 廣泛應用於海產養殖 用法： pelleted feeds, enrich live feed (such as rotifers) 益生菌，舉例 –Dry products: Endospores of Bacillus spp. –Lactic acid bacteria, Rosebacter spp., Pseudoalteromonas, Pseudomonas, nonpathogenic Vibrio spp., yeasts, microalgae 等 商業買賣這些產品，往往強調免疫增強或 vaccine 等，基本上是不正確的

21 Vaccination in aquaculture 有骨魚類會有有效的免疫反應，面對微生物抗 原會產生抗體，屬於 B-cell response 和 cell- mediated immunity (T-cell response) 小魚施予疫苗多採用 brief immersion in a dilute suspension 細菌抗原等穿過 gill 後，促進免疫反應 部分採用 intraperitoneal injection, 如病毒疫苗， 細菌疫苗等可溶性者 With oil adjuvant （佐劑）, ensures slow release

22 Vaccination in aquaculture 費時費工 口服方便 administered orally, 預防被胃和消化 道所改變 常用形式： Formalin-treated bacterial cells ，稱 為 bacterin 如 Vibrio anguillarum, V. salmonicida, V. ordalii 不是每次都成功，要瞭解致病和毒性的機制 如有效的 furunculous （癤病） vaccine 就是瞭 解到 extracellular proteases 和鐵調控外膜蛋白 質（ IROMP ）的重要性

23 Vaccination in aquaculture 遺傳工程發展疫苗 For viruses and some bacteria 利用 毒性基因： viral capsid proteins, bacterial toxins, surface antigens 等 選殖 cloned 後成為 subunit vaccine 成功在 high expression system (e.g. E. coli) 大量表現 Fusion protein ，再純化 有時候，使用昆蟲細胞或酵母菌等表現系 統

24 DNA vaccination 不同於傳統 DNA vaccination or genetic immunization depends on expression of a sequence encoding the protective antigen 該基因會在魚體內表現 雖然並未改變魚類本身的基因，不會是 transgenic modification ，還是受到一些地 區 public opinion 的質疑

25 Phage therapy The enemy of my enemy is my friend (Box 14.2) A brief history 1930 年代美國已經有醫藥公司進行商業生產噬 菌體，標準化與臨床試驗不完整 1940 年代在東歐有成功使用 1980 年代抗生素抗藥性興起，從新評估 phage therapy ，證實有效處理哺乳動物疾病，特別是 由抗藥性致病菌所造成者 包括處理食物，避免 Listeria 感染

26 Phage therapy 應用 phage 在醫療和生物防治（ biocontrol ） Advantages 和 disadvantages 噬菌體有專一性，細菌變異多，所以常需 要 phage 混合成的 cocktail ，才有效 噬菌體不見得能夠抵達身體各處 Lysogeny 和基因的轉移可能會發生 Vibrio harveyi VHML 病毒感染後，增強毒 性（ virulence ）

27 Phage therapy 在魚類養殖中的應用 日本 Nakai 等人（ 1999 ）研究 yellowtail 魚的伺 機性（ opportunistic ）病菌 Lactococcus 發現 90 ％的病菌對兩株噬菌體敏感 將病菌和噬菌體混合注射入魚的腹部 （ intraperitoneally ）， 100 ％魚不會死亡 其他方式感染前後處理，顯示不等效果

28 Phage therapy 將噬菌體納入到飼料中，死亡率從 60 ％降低至 10 ％ 將適當的噬菌體放入水中，可延遲 Aeromonas salmonicida 對鱒魚的感染 至今應用少，疫苗的防制更有效

29 Phage therapy 甲殼類 – 用於亞洲蝦子飼養、北美的龍蝦飼養，有少數報告 – 印度分離噬菌體，針對蝦子養殖的 Vibrio harveyi ， 添加於水中，降低致病菌的密度 – 破壞 biofilm 的形成 應用在珊瑚疾病 – 試驗困難 控制藻華（ algal bloom ）等問題 – 環境藻類菌種複雜，得用 cocktail

30 延伸閱讀 Metagenomics, biotechnology with non- culturable microbes Ref. 527 海洋微生物天然物 Ref.538 海洋生醫 — 人類醫學發展的終極防線 Ref. 539

31 延伸閱讀 Marine derived pharmaceuticals-Development of natural health products from marine biodiversity Ref. 543 Biological Characterisation of Secondary Metabolites from Marine Fungi microascus spp. Ref 532 Antimicrobial activity of extracellularly synthesized silver nanoparticles from marine derived Streptomyces rochei Ref. 533 Marine fungal biotechnology: an ecological perspective Ref. 534

32 延伸閱讀 Bioactive Compounds from Bacteria Associated to Marine Algae Ref. 540 共生菌 — 新活性天然產物的重要來源 Ref. 541 極地微生物 —— 新天然藥物的潜在來源 Ref. 536 2010 ～ 2013 之海洋微生物新天然產物 Ref. 537 海洋微生物來源新抗生素的研究 Ref. 542

33 延伸閱讀 海洋生物中的天然抗生素 — 抗菌蛋白 Ref. 535 Bacteriocin as Weapons in the Marine Animal- Associated Bacteria Warfare: Inventory and Potential Applications as an Aquaculture Probiotic Ref. 546 抗艾滋病海洋天然產物的研究進展 Ref. 544 海洋微生物毒素研究進展 Ref. 545 海洋微生物抗腫瘤活性產物研究進展 Ref. 560